響應(yīng)面優(yōu)化南酸棗葉多糖的提取工藝及其抗氧化活性

張強(qiáng)，韋婉珍，羅小莉，丁世磊，戴航，黃宏妙，潘真真，李芳禪

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200）

南酸棗為漆樹科南酸棗屬植物果實(shí)，學(xué)名五眼果（Choerospondias axillaris）[1]，其干燥成熟果實(shí)為蒙醫(yī)用藥材[2]，藥食同源，具有較高的營養(yǎng)及藥用價值[3]。目前對南酸棗的研究主要集中在其果實(shí)部分，研究表明南酸棗果肉含有多酚、有機(jī)酸、多糖[4]、維生素及礦物質(zhì)[5]等，且有安神、提高記憶力、鎮(zhèn)靜等作用[6]。Wang等[7]對南酸棗水提物的體外及體內(nèi)抗氧化活性進(jìn)行測試，發(fā)現(xiàn)抗氧化活性效果顯著。南酸棗樹皮外用，是燙傷的特效藥[8]。Li等[9]研究發(fā)現(xiàn)南酸棗果皮中的原花青素對4種糖酵解酶有抑制活性。文獻(xiàn)調(diào)研發(fā)現(xiàn)，對南酸棗的研究主要集中在其果實(shí)、果皮，對南酸棗葉多糖的研究未見報道。

近年來，植物多糖的研究備受關(guān)注。多糖類化合物是一種可再生、儲存豐富的綠色資源，廣泛存在于植物的皮、果、葉中。大量研究結(jié)果表明植物多糖有抗氧化[10]、抗衰老[11]、抗癌活性[12]、降血糖[13-14]、免疫調(diào)節(jié)作用[15-16]等多種生物活性，是保健類食品開發(fā)的重要原料之一。目前多糖的提取方法主要有熱水浸提法、微波輔助法、酶解提取法和超聲輔助法等。這些方法各有優(yōu)點(diǎn)，微波輔助法和超聲波輔助法提取率較高，但微波和超聲波較高的能量雖然可以破碎細(xì)胞壁，達(dá)到提高多糖得率的目的，但也會使多糖的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響其活性[17]。另外超聲也會導(dǎo)致多糖降解[18]。酶解法提取成本較高，對pH值、溫度等條件較為敏感。熱水浸提法以操作簡單、設(shè)備需求低而備受青睞[19]。李景恩等[20]采用熱水浸提法對南酸棗果的多糖進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)提取率可達(dá)21.79%，但南酸棗葉多糖的研究未見報道。

為補(bǔ)充南酸棗林業(yè)資源化學(xué)成分庫，充分利用廢棄資源，本試驗(yàn)以南酸棗葉為原料，采用熱水浸提法提取多糖，通過響應(yīng)面法設(shè)計并優(yōu)化最佳工藝條件?？疾炝四纤釛椚~多糖的還原能力、對DPPH·和·OH的清除作用，以期為豐富南酸棗林業(yè)資源化學(xué)成分庫及天然抗氧劑的開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

南酸棗葉（采于6月）：廣西南寧植物園；葡萄糖（AR）、抗壞血酸（AR）、DPPH（AR）、鐵氰化鉀（AR）、三氯乙酸（AR）、氯化鐵（AR）、石油醚（AR）：上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司；水楊酸（AR）、丙酮（AR）、磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered saline，PBS）（AR）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇（AR）、FeSO4（AR）、硫酸（AR）、H2O2（30%）：廣東省精細(xì)化學(xué)品工程技術(shù)研發(fā)中心。

1.2 儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水式多用真空泵SHZ-D（III）：上海予華儀器有限公司;集熱式恒溫磁力攪拌器（DF-101S）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；離心機(jī)（LDZ4-2）：江蘇省金壇市金南儀器制造有限公司；分光光度計（UV-1780）：島津儀器（蘇州）有限公司；萬能粉粹機(jī)（FW-400AD）：天津鑫博得儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 南酸棗葉干粉的制備

將南酸棗葉置于60℃的烘箱中烘干12 h，用打粉機(jī)粉碎后過60目篩，用石油醚以液料比5∶1（mL/g）于60℃回流4 h脫脂，將脫脂后的粉末晾干，密封保存，備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，配制濃度為1.0 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別量取標(biāo)準(zhǔn)液0.20、0.30、0.40、0.60、0.70、0.80 mL置于20 mL棕色容量瓶中，補(bǔ)加蒸餾水至總體積為2.00 mL。向每個容量瓶中加入6%苯酚溶液1.00 mL，充分振搖后快速加入濃硫酸5.00 mL，振蕩后置于沸水浴中反應(yīng)20 min，取出后冷卻，在490 nm測定吸光度，繪制工作曲線。

1.3.3 南酸棗葉多糖的提取

1.3.3.1 溫度對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的南酸棗葉粉末2.00 g，置于圓底燒瓶中，在轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，固定液料比為100∶1（mL/g），提取時間為 4 h，分別在溫度為 75、80、85、90、95℃時試驗(yàn)，提取兩次，合并提取液，對提取液減壓抽濾，收集濾液。在溫度60℃下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液加熱濃縮，收集濃縮液。向濃縮液緩慢加入4倍體積的無水乙醇，充分?jǐn)嚢?，將析出的沉淀液置?0 mL的帶塞試管中，放入冰箱中靜置24 h后，于4 000 r/min離心15 min，棄上清液，收集沉淀，沉淀物依次使用無水乙醇、丙酮、石油醚洗滌2次，將沉淀干燥，得南酸棗葉粗多糖。計算南酸棗葉多糖得率。

1.3.3.2 液料比對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的南酸棗葉粉末2.00 g，置于圓底燒瓶中，在轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，固定溫度85℃，提取時間為 4 h，分別在液料比為 60∶1、80∶1、100∶1、120∶1、140∶1（mL/g）時提取多糖，提取 2 次，合并提取根據(jù)1.3.2的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算南酸棗葉多糖得率。

1.3.3.3 時間對多糖得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的南酸棗葉粉末2.0 g，置于圓底燒瓶中，在轉(zhuǎn)速100 r/min條件下，固定溫度85℃，液料比為 100∶1（mL/g），分別在提取時間為 2、2.5、3、4、5、6 h下試驗(yàn)，提取兩次，合并提取液，根據(jù)1.3.2的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算南酸棗葉多糖得率。

1.3.4 多糖得率測定

用苯酚硫酸法[21]測定南酸棗葉多糖得率。將提取得到的南酸棗葉多糖配制成1 mg/mL的溶液，用移液槍量取2.0 mL溶液，按照1.3.2步驟的操作方法測定其吸光度值，平行測定3次，取平均值，南酸棗葉多糖的得率按照回歸方程計算其多糖的得率，計算公式如下。

式中：x為標(biāo)曲上對應(yīng)濃度，mg/mL；V1為比色測定時吸取樣液體積，mL；V2為提取液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)，40；m為南酸棗葉質(zhì)量，g。

1.3.5 南酸棗多糖的抗氧化活性

參考王洪政等[22]的方法測定南酸棗葉多糖抗氧化能力。采用李婉婷等[23]的方法測定南酸棗葉多糖對DPPH·和·OH的清除作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

選取葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程為y=1.108 7x+0.000 8，R2=0.999 3。式中：y 為吸光值；x 為葡萄糖濃度，mg/mL。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 溫度的影響

提取溫度與南酸棗葉多糖得率的關(guān)系見圖2。

圖2 溫度對多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of polysaccharides

從圖2可見，隨著溫度升高，南酸棗葉多糖得率先升高后趨于穩(wěn)定，升高溫度有助于破碎植物細(xì)胞壁，加快多糖的溶出效率。當(dāng)溫度為85℃時，南酸棗葉多糖得率達(dá)到最大，之后有所降低，可能是由于溫度較高，部分多糖發(fā)生降解，導(dǎo)致多糖含量下降，故提取溫度不宜過高。選擇溫度85℃為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化中心值進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.2 液料比的影響

為考察液料比對南酸棗葉多糖得率的影響，以液料比為變量，固定其他因素進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。

圖3 液料比對多糖得率的影響Fig.3 Effect of liquid-material ratio on yield of polysaccharides

如圖3所示，當(dāng)液料比從60∶1增加到100∶1（mL/g），南酸棗葉多糖的得率增加顯著，是由于大量溶劑有助于提高細(xì)胞內(nèi)外多糖濃度差，進(jìn)而讓多糖快速溶出。當(dāng)液料比超過100∶1（mL/g）時，不再增加，且會浪費(fèi)溶劑及增加功耗。選擇液料比100∶1（mL/g）作為響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.2.3 時間的影響

為探究提取時間對南酸棗葉多糖得率的影響，以提取時間為變量，固定其他因素進(jìn)行試驗(yàn)，見圖4。

圖4 提取時間對多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of polysaccharides

如圖4所示，時間從2 h增加到4 h，南酸棗葉多糖得率增加顯著，之后隨時間不再增加。延長提取時間會導(dǎo)致生產(chǎn)周期過長，不利于經(jīng)濟(jì)性提升。選擇提取時間4 h作為響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化的中心值。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計與試驗(yàn)結(jié)果

選擇溫度A、液料比B、時間C進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析，試驗(yàn)方案與結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面設(shè)計與結(jié)果Table 1 Response surface design and results

把表1中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析，得到南酸棗葉多糖的得率Y對A、B、C的回歸方程：Y=+4.37+0.13A+0.29B+0.066C-0.18AB-0.06AC-0.16BC-0.17A2-0.31B2-0.067C2。

2.3.2 回歸方程及方差分析

對回歸方程分析可知，各因素對南酸棗葉多糖得率的影響次序：液料比>溫度>時間。將回歸方程進(jìn)行方差分析，分析結(jié)果見表2。

表2 方差分析結(jié)果Table 2 Results of ANOVA analysis

由表2分析可知，模型P<0.000 1，上述回歸模型極顯著，說明南酸棗葉多糖得率的擬合方程可靠性好。在擬合方程一次項A、B、C中，A、B的P值均<0.001，效果極顯著，表明溫度、液料比對多糖得率的影響作用較大，時間的影響較小，可能是由于提取溫度越高水分子越活躍，細(xì)胞壁更容易破裂，促使多糖向提取液中溶出[24]。從交互項AB、AC、BC的P值分析可知，AB、BC的P<0.01，且在圖5和圖7的三維響應(yīng)面圖比圖6陡峭，試驗(yàn)表明溫度和液料比、液料比和時間的交互作用比時間和溫度的交互作用對多糖得率的影響顯著。在二次項中，A2和B2的P值<0.001，表明與時間相比，溫度和液料比的二次項對多糖得率的影響較大，該模型相關(guān)系數(shù)R2=0.968，失擬項差異不顯著，表明數(shù)據(jù)可靠，該模型擬合度較高，可以用于熱水浸提法提取南酸棗葉多糖的理論預(yù)測。

圖5 液料比和溫度的交互作用對多糖得率的影響Fig.5 The effect of the interaction of liquid-to-material ratio and temperature on the yield of polysaccharides

圖6 時間和溫度的交互作用對多糖得率的影響Fig.6 The effect of the interaction of extraction time and temperature on the yield of polysaccharides

圖7 時間和液料比的交互作用對多糖得率的影響Fig.7 The effect of the interaction of time and liquid-to-material ratio on the yield of polysaccharides

2.3.3 響應(yīng)面及等高線分析

依據(jù)響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，采用Design Expert8.0.6軟件進(jìn)行回歸擬合分析，得到溫度、液料比、時間對南酸棗葉多糖得率的影響，響應(yīng)面和等高線如圖5～圖7所示。

由圖5～圖7的響應(yīng)面圖可以看出，溫度和料液比與時間和料液比的交互作用接近于橢圓形，表明交互作用顯著，對多糖得率影響較大，而時間和溫度的交互作用不顯著，說明對多糖得率影響較小。在等高線圖中，圖形呈橢圓狀，說明交互作用顯著，接近于圓形，說明交互作用弱[25]。在圖5～圖7的等高線圖中，AB和BC的交互作用呈橢圓形，說明其交互作用顯著，而AC接近于圓形，說明作用較弱。從上述分析說明，溫度和液料比、液料比和時間的交互作用對南酸棗葉多糖得率影響較大，影響較小的是溫度和時間的交互作用。

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)回歸模型方程，預(yù)測得到提取南酸棗葉中多糖的最佳工藝為提取溫度85.85℃、液料比109∶1（mL/g）、提取時間3.88 h，預(yù)測多糖理論得率4.44%。結(jié)合具體試驗(yàn)情況，將最優(yōu)工藝調(diào)整為溫度86℃、液料比110∶1（mL/g）、時間 3.90 h。在調(diào)整后的試驗(yàn)條件下，平行進(jìn)行5次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示多糖平均得率4.41%，實(shí)際值與理論值4.44%的誤差為0.068%，證明了該試驗(yàn)?zāi)Ｐ徒Y(jié)果可靠，適用于南酸棗葉多糖的提取。

2.4 南酸棗葉多糖抗氧化活性

2.4.1 總抗氧化能力

還原能力是評價物質(zhì)抗氧化能力的一項重要指標(biāo)，與抗氧化能力直接相關(guān)，吸光度越大表示還原能力越強(qiáng)[26]。南酸棗多糖的還原能力見圖8。

圖8 南酸棗葉多糖的還原能力Fig.8 Total reducing ability of Choerospondias axillaris leaves polysaccharides

由圖8分析知，南酸棗葉多糖的總抗氧化能力隨濃度的增大而增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.50 mg/mL時，南酸棗葉多糖的吸光值相當(dāng)于VC的77.05%，當(dāng)濃度達(dá)到2.00 mg/mL時，南酸棗葉粗多糖還原能力接近于VC。研究表明還原能力與結(jié)構(gòu)中的還原酮類物質(zhì)有關(guān)，它可以提供質(zhì)子進(jìn)而阻斷鏈?zhǔn)椒磻?yīng)達(dá)到抗氧化目的[27]。南酸棗葉多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，但稍弱于VC。

2.4.2 DPPH·清除能力

南酸棗葉多糖對DPPH·的清除率見圖9。

圖9 南酸棗葉多糖對DPPH·的清除率Fig.9 Scavenging activities of Choerospondias axillaris leaves polysaccharides on DPPH·

由圖9可知，南酸棗葉多糖對DPPH·清除能力與濃度呈正相關(guān)。當(dāng)多糖濃度在0.20 mg/mL～2.00 mg/mL，對DPPH·清除率快速增加，之后與VC接近。當(dāng)濃度為0.50mg/mL時，對DPPH·清除率為49.43%。南酸棗葉多糖對DPPH·清除率的IC50值為0.57mg/mL。研究表明多糖的抗氧化能力與其分子量、單糖組成等有關(guān)，低分子量多糖一般有較強(qiáng)的抗氧化能力[28]。推測南酸棗葉多糖可能以低分子量多糖為主。

2.4.3 ·OH清除能力

南酸棗葉多糖對的·OH清除率見圖10。

圖10 南酸棗葉多糖對的·OH清除率Fig.10 Scavenging activities of Choerospondias axillaris leaves polysaccharide on·OH

由圖10可知，南酸棗葉多糖對·OH的清除能力與濃度呈正相關(guān)的量效關(guān)系。多糖濃度在0.20 mg/mL～3.00 mg/mL范圍內(nèi)，對·OH清除能力隨濃度增大快速增加，之后呈平緩趨勢增加，逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)濃度為0.50 mg/mL時，對·OH清除率為55.92%。南酸棗葉多糖對·OH清除率的IC50值為0.39 mg/mL。表明南酸棗葉多糖具有一定·OH清除能力。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過熱水浸提法提取南酸棗葉多糖，用響應(yīng)面設(shè)計法對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對南酸棗葉多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究?？傻贸鋈缦陆Y(jié)論：1）熱水浸提法提取南酸棗葉多糖的最優(yōu)工藝條件：提取溫度86 ℃；液料比 110∶1（mL/g）；提取時間 3.90 h。在該工藝條件下，南酸棗葉多糖得率為4.41%。2）南酸棗葉粗多糖有一定的還原能力，對DPPH·和·OH的清除的IC50值分別是0.57 mg/mL和0.39 mg/mL，其結(jié)果弱于VC，期望為天然抗氧劑的開發(fā)提供數(shù)據(jù)依據(jù)。

南酸棗葉可以作為植物多糖的來源之一。試驗(yàn)僅采用熱水浸提法提取多糖，且未對多糖組成進(jìn)行分析。后續(xù)試驗(yàn)可考察其他提取方法對多糖得率和活性的影響，并采用大孔吸附樹脂、葡聚糖對南酸棗葉粗多糖進(jìn)行分離純化，以期探究南酸棗葉多糖各組分與其抗氧化能力的協(xié)同效應(yīng)。