超聲輔助法與閃式提取法提取五味子醇甲的工藝對(duì)比研究

崔悅，周新新，2，李雨軒，2，李樂樂，林曉影，馮波，關(guān)皎*，朱鶴云*

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.延邊大學(xué)藥學(xué)院，吉林 延吉 133002）

五味子又稱五梅子、山花椒，是木蘭科植物五味子[Schisandra chinensis（Turcz.）Baill.]的干燥成熟果實(shí)，具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心的功效[1-2]。五味子因具有“甘、酸、辛、苦、咸”五味而得名，在我國(guó)東北地區(qū)產(chǎn)量豐富，作為一種藥食同源的植物，五味子具有非常重要的藥用和食用價(jià)值。研究表明，五味子對(duì)消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等具有較好的保護(hù)作用[3-4]。此外，其亦可制為五味子酒、五味子飲料、五味子果醬等多種功能性食品[5]。在《中國(guó)藥典》（2020版）中，五味子藥材的質(zhì)量以五味子醇甲為指標(biāo)進(jìn)行控制。五味子醇甲為木脂素類化合物，是五味子的主要化學(xué)成分，文獻(xiàn)報(bào)道其具有保肝、抗炎、抗凝血等多種藥理活性[6-9]。

目前，五味子醇甲的提取方法包括超聲法[10-12]、滲漉法[13]和回流法[14]。其中，超聲法是一種常用的藥材提取方法，利用超聲波振動(dòng)的空化等作用，在振蕩過程中，空化泡周圍的微流會(huì)對(duì)溶液中的藥材產(chǎn)生切向力，進(jìn)而使得溶劑加速滲透到細(xì)胞當(dāng)中，溶解出藥材細(xì)胞中的有效成分，提取出藥材成分[15]。超聲功率、時(shí)間等都會(huì)影響到藥材的提取率。目前，超聲法已廣泛應(yīng)用于多種化學(xué)成分的提取，如多糖、苷類、黃酮和生物堿等[16-17]。閃式提取法又稱組織破碎提取法，最早源于生物組織的搗碎，后來被逐漸開發(fā)和創(chuàng)新出用于植物組織搗碎，并用于對(duì)中藥材的提取[18]。文獻(xiàn)報(bào)道連翹果實(shí)總黃酮、白蘞多糖等都可采用閃式提取法提取[19-20]，具有省時(shí)、穩(wěn)定、節(jié)能等優(yōu)點(diǎn)。

本研究將通過比較超聲輔助提取法和閃式提取法對(duì)五味子中五味子醇甲的提取率的影響，優(yōu)選出五味子醇甲的最佳提取工藝，為五味子醇甲的大規(guī)模提取和五味子開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子果實(shí)：吉林市吉林大藥房；五味子醇甲對(duì)照品（純度＞98%，批號(hào)：Y17M8H31887）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜級(jí)）：Fisher公司；無水乙醇（分析純）：永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（LC-20AT）：日本島津公司；微型萬能粉碎機(jī)（FW80）：天津市泰斯特儀器有限公司；電子天平（FA1104N）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；閃式提取器（JHBE-50S）：河南金鼐科技發(fā)展有限公司；三頻恒溫?cái)?shù)控超聲波清洗器（KQ-500GVDV）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的預(yù)處理

取適量干燥后的五味子藥材于藥材粉碎機(jī)中，粉碎，備用。

1.3.2 超聲輔助提取方法

取五味子藥材粉末5 g，加入50%乙醇250 mL，采用超聲輔助進(jìn)行提取，提取功率為150 W，超聲時(shí)間為0.75 h，提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.3 閃式提取方法

取五味子藥材粉末5 g，加入50%乙醇250 mL，閃式提取3 min，提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾，待用。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

超聲輔助提取法單因素試驗(yàn)考察的因素為乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）、超聲時(shí)間（0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 h）、超聲功率（50、100、150、200、250 W）和料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]，固定因素為乙醇濃度50%、超聲時(shí)間0.75 h、超聲功率150 W、料液比 1∶50（g/mL）；閃式提取法單因素試驗(yàn)考察因素為乙醇濃度（10%、30%、50%、70%、90%、100%）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 min）和料液比[1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）]，固定因素為乙醇濃度 50%、提取時(shí)間3 min、料液比 1∶50（g/mL）。考察以上各因素不同水平對(duì)五味子醇甲提取率的影響。

1.3.5 五味子醇甲含量測(cè)定

1.3.5.1 色譜條件

色譜柱采用Shim-pack GIST柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相采用 0.1%甲酸-甲醇（35∶65，體積比），檢測(cè)波長(zhǎng)為250 nm，流速為1.0 mL/min，柱溫為35℃，取樣品10 μL分析。

1.3.5.2 對(duì)照品溶液的制備和標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以甲醇為溶劑制得1.0 mg/mL的五味子醇甲對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

取五味子醇甲對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇做溶劑配制成五味子醇甲系列對(duì)照品溶液，濃度分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL，進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，五味子醇甲溶液的濃度為橫坐標(biāo)（X），得到五味子醇甲的線性回歸方程為Y=2.086×104X-4.112 3×103（R2=0.999 9），五味子醇甲的線性范圍為 5 μg/mL～200 μg/mL。

1.3.5.3 精密度試驗(yàn)

取五味子醇甲50 μg/mL對(duì)照品溶液適量，按1.3.5.1色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.06%，即儀器精密度良好。

1.3.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批五味子藥材粉末，按1.3.2方法得供試品溶液，分別將樣品放置 0、2、4、8、12、24 h 后進(jìn)行色譜分析，峰面積的RSD為1.01%，即樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

1.4 正交試驗(yàn)

選取不同的影響因素和各因素的不同水平，以L9（34）設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以五味子醇甲的提取率為考察指標(biāo)。各項(xiàng)試驗(yàn)平行3次。超聲輔助提取法正交試驗(yàn)因素水平見表1，閃式提取法正交試驗(yàn)因素水平見表2。

表1 超聲輔助提取法正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal experimental factor levels of ultrasonic-assisted extraction

表2 閃式提取法法正交試驗(yàn)因素水平Table 2 Orthogonal experimental factor levels of flash extraction

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用正交設(shè)計(jì)助手oea_v31p進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，優(yōu)化最佳提取工藝，采用Origin 8.5軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

五味子醇甲對(duì)照品和五味子樣品的色譜圖見圖1。

圖1 五味子醇甲和五味子樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of schizandrin reference and Schisandrae chinensis Fructus sample

由圖1可知，該色譜條件下五味子樣品中五味子醇甲分離良好，無干擾。

2.1 超聲輔助提取五味子醇甲的單因素試驗(yàn)結(jié)果

超聲輔助提取五味子醇甲的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 超聲輔助法不同因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響Fig.2 Effects of different factors on schizandrin extract rates by ultrasonic-assisted extraction

由圖2a可知，五味子醇甲的提取率隨乙醇濃度的增大先升高后降低，在乙醇濃度90%時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇90%為乙醇的適宜濃度。由圖2b可知，五味子醇甲的提取率隨超聲時(shí)間的增大而升高，最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到0.50 h后，提取率保持平穩(wěn)。因此，0.50 h為適宜的超聲時(shí)間。由圖2c可知。五味子醇甲的提取率隨超聲功率的升高而增大，考慮到超聲儀的額定功率為250 W，因此，在試驗(yàn)范圍內(nèi)選擇提取的超聲功率為250 W。由圖2d可知，隨著溶劑體積的增大，五味子醇甲的提取率先增大后減小，當(dāng)料液比達(dá)到1∶60（g/mL）時(shí)五味子醇甲的提取率達(dá)到最大值。因此，提取的適宜料液比為1∶60（g/mL）。

2.2 閃式提取五味子醇甲的單因素試驗(yàn)

閃式提取五味子醇甲的單因素試驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 閃式提取法不同因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響Fig.3 Effects of different factors on schizandrin extracts rates by flash extraction

由圖3a可知，五味子醇甲的提取率隨乙醇濃度的增大先升高后降低，在乙醇濃度90%時(shí)達(dá)到最大值。因此，選擇90%為乙醇的適宜濃度。由圖3b可知，五味子醇甲的提取率隨提取時(shí)間的增大而升高，最后趨于穩(wěn)定。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到3 min后，提取率保持平穩(wěn)。因此，3 min為適宜的提取時(shí)間。由圖3c可知，隨著溶劑體積的增大，五味子醇甲的提取率先增大后減小，當(dāng)料液比達(dá)到1∶60（g/mL）時(shí)五味子醇甲的提取率達(dá)到最大值。因此，提取的適宜料液比為1∶60（g/mL）。

2.3 超聲輔助提取五味子中的五味子醇甲最佳工藝的確定

2.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以乙醇濃度（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）和料液比（D）為4個(gè)試驗(yàn)因素，各因素設(shè)置3個(gè)水平。超聲輔助提取法的正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果分別見表3和表4。

表3 超聲輔助提取法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of ultrasonic-assisted extraction

表4 超聲輔助提取法方差分析結(jié)果Table 4 Variance analysis results of ultrasonic-assisted extraction

由表3可知，超聲輔助提取方法中各因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響順序?yàn)镈>B>C>A。表4方差結(jié)果表明，各因素不會(huì)顯著性影響提取工藝。篩選得到的超聲輔助提取法最佳工藝為A1B3C2D3，即50%乙醇，提取 1.00 h，功率 200 W，料液比 1∶60（g/mL）。

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

取供試品溶液，對(duì)最優(yōu)工藝A1B3C2D3進(jìn)行驗(yàn)證（n=3），計(jì)算后五味子醇甲平均提取率為4.72 mg/g，高于正交試驗(yàn)的最高提取率（4.68 mg/g）。

2.4 閃式提取法提取五味子中的五味子醇甲最佳工藝的確定

選取乙醇濃度（E）、料液比（F）、提取時(shí)間（G）3個(gè)試驗(yàn)因素。閃式提取法正交試驗(yàn)和方差分析結(jié)果分別見表5和表6。

表5 閃式提取法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal test results of flash extraction

表6 閃式提取法方差分析結(jié)果Table 6 Variance analysis results of flash extraction

由上述結(jié)果，通過比較各試驗(yàn)條件下五味子醇甲的提取率可知：各因素對(duì)五味子醇甲提取率的影響順序?yàn)镋>F>G。方差結(jié)果表明：各因素不會(huì)顯著性影響提取工藝。篩選得到的閃式提取法最佳工藝為E2F2G3，即 70%乙醇，料液比 1∶50（g/mL），提取 3 min。

2.5 超聲輔助提取法與閃式提取法的比較

分別用超聲輔助提取法和閃式提取法最佳工藝提取五味子醇甲，結(jié)果見表7。

表7 不同提取方法五味子醇甲的提取率Table 7 The extraction rates of schizandrin by different extraction technologies

由表7可知，超聲輔助法的提取率為4.72 mg/g，閃式提取法的提取率為5.02mg/g。通過比較，閃式提取法提取五味子醇甲的提取率更高，且其提取時(shí)間僅為3 min，而超聲輔助法的提取時(shí)間為60 min，顯然，閃式提取法更加省時(shí)、高效，較適合對(duì)五味子醇甲的大規(guī)模提取。

3 結(jié)論

本研究將超聲輔助法和閃式提取法提取五味子中的五味子醇甲的工藝進(jìn)行比較研究。結(jié)果表明，閃式提取法提取效率更高，且具有省時(shí)、簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)。確定的最佳提取工藝為閃式提?。阂?0%的乙醇作為提取溶劑，料液比為 1∶50（g/mL），提取時(shí)間為 3 min。在此工藝下，五味子醇甲的提取率為5.01 mg/g。五味子作為一種藥食同源的植物，具有極高的藥用和食用價(jià)值。采用最佳的提取工藝對(duì)五味子醇甲進(jìn)行提取，能夠大大提高其提取效率，對(duì)于擴(kuò)大五味子的市場(chǎng)應(yīng)用具有非常重要的意義。本研究可為五味子醇甲的大批量生產(chǎn)開發(fā)提供理論依據(jù)。