腓骨杯樁菇基本營(yíng)養(yǎng)成分和揮發(fā)性物質(zhì)分析及評(píng)價(jià)

何軼榕，王術(shù)榮*，孟俊龍，常明昌

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 太谷 030800；2.黃土高原食用菌提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 太谷 030800）

五臺(tái)山地貌多樣、氣候清涼、臺(tái)蘑資源豐富。臺(tái)蘑包括大白樁菇、肉色杯傘、落葉杯傘、紫丁香蘑、堊白樁菇等，俗名有白銀盤(pán)、紅銀盤(pán)、水皮子、小香蕈、大香蕈、虎皮臺(tái)蘑等[1]。史光中等[2]研究了大白樁菇（白銀盤(pán)）、肉色杯傘（紅銀盤(pán)）、紫丁香蘑（大香蕈）和堊白樁菇（小香蕈）等野生臺(tái)蘑的營(yíng)養(yǎng)成分，發(fā)現(xiàn)野生臺(tái)蘑的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，蛋白質(zhì)含量大約占干物質(zhì)的40%。羅明正等[3]全面分析評(píng)價(jià)了五臺(tái)山大白樁菇（白銀盤(pán)）、肉色杯傘（紅銀盤(pán)）、堊白樁菇（小香蕈）和紫丁香蘑（大香蕈）中蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)這4種野生臺(tái)蘑中，肉色杯傘的蛋白質(zhì)含量最高，其次是大白樁菇，紫丁香菇和堊白樁菇最低，但都比茶樹(shù)菇和香菇的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值要高。張芳雅等[4]對(duì)落葉杯傘（水皮子）的化學(xué)成分進(jìn)行了研究，通過(guò)提取、分離及鑒定，從落葉杯傘（水皮子）中共得到10個(gè)單體化合物。本文對(duì)腓骨杯樁菇（Clitopaxillus fibulatus）的基本營(yíng)養(yǎng)成分、氨基酸組成和揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定分析，以期為腓骨杯樁菇的產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和深層次利用提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腓骨杯樁菇（虎皮臺(tái)蘑）于2019年8月18日采自山西省五臺(tái)山自然保護(hù)區(qū)，編號(hào)G16174。將采回的新鮮子實(shí)體于65℃烘干箱中烘干，研磨機(jī)磨粉，過(guò)80目篩，裝入塑封袋，4℃冰箱保存。

DNA試劑盒：美國(guó)OMEGA公司；瓊脂：上海生物工程有限公司；HCl（分析純）：成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Eclipse Ni-U光學(xué)顯微鏡：日本尼康公司；TB-214型電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統(tǒng)有限公司；GZX-9240MBE型電恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限責(zé)任公司；MultifugeX1R Centrifuge離心機(jī)：美國(guó)THERMO公司；KDN-1型全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Biochrom-30+全自動(dòng)氨基酸分析儀：英國(guó)百康biochrom公司；StableFlex手動(dòng)固相微萃取裝置：美國(guó)Supelco公司；HP6890/5975C型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司；Gel DOCTMXR+凝膠成像分析、C1000 TouchTM溫度梯度基因擴(kuò)增儀（polymerase chain reaction，PCR）：美國(guó)BIO RAD公司。

1.3 形態(tài)學(xué)分析

觀察新鮮子實(shí)體的宏觀形態(tài)并且拍照記錄，于55℃烘干箱中烘干，制作標(biāo)本，標(biāo)本收藏于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)菌物標(biāo)本館（HMSAU）。將干標(biāo)本徒手切片，在5%KOH溶液中復(fù)水，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)復(fù)水后的切片觀測(cè)其孢子、擔(dān)子等顯微結(jié)構(gòu)[5]。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定步驟包括DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序。從干燥的真菌標(biāo)本中提取基因組DNA，提取后測(cè)定DNA的濃度。PCR擴(kuò)增遵循Vilgalys和Hester協(xié)議[6]進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用引物ITS8-F/LR3，對(duì)DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）和核糖體大亞基區(qū)（ribosomal large subunit，LSU）進(jìn)行擴(kuò)增。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 基本營(yíng)養(yǎng)成分分析

蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法參照GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[7]；脂肪含量測(cè)定參照GB 5009.6—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測(cè)定》[8]；灰分含量測(cè)定參照GB 5009.4—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測(cè)定》[9]；總糖的測(cè)定采用徐顯利等[10]的方法進(jìn)行測(cè)定；多糖含量采用苯酚-硫酸法進(jìn)行檢測(cè)[11]。根據(jù)上述方法依次對(duì)腓骨杯樁菇的蛋白質(zhì)、脂肪、灰分、總糖和多糖進(jìn)行含量測(cè)定。

1.6 腓骨杯樁菇子實(shí)體的氨基酸檢測(cè)及分析

使用分析天平稱(chēng)量子實(shí)體粉0.2 g，置于安瓿管中加6 mol/L HCl溶液定容至10 mL。通入氮?dú)庋杆俜饪诤?，置?10℃烘箱內(nèi)水解22 h，將安瓿管取出后迅速冰水浴冷卻至室溫（25℃）。然后，將樣品水解液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，用0.01 mol/L HCl定容至50 mL，準(zhǔn)確吸取水解液2.0 mL，置于60℃下真空旋轉(zhuǎn)蒸干；繼續(xù)加入0.02 mol/L HCl溶液 2.0 mL，過(guò) 0.45 μm 濾膜，即得酸水解液。取20 μL水解液樣品到氨基酸自動(dòng)分析儀，分析樣品蛋白中水解氨基酸的組成與比例含量；最后，根據(jù)氨基酸平衡理論世界衛(wèi)生組織/聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（World Health Organization/Food&Agriculture Organization，WHO/FAO）的必需氨基酸模式，采用氨基酸的化學(xué)評(píng)分（amino acid score，AAS）來(lái)評(píng)價(jià)腓骨杯樁菇子實(shí)體的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12-13]。

1.7 腓骨杯樁菇子實(shí)體的揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)及分析

1.7.1 固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）進(jìn)樣條件

準(zhǔn)確稱(chēng)取烘干的腓骨杯樁菇子實(shí)體粉1.0 g，將其裝入10 mL固相微萃取的樣品瓶，放置于60℃恒溫水浴搖床振蕩30 min，取樣前將萃取頭放置在250℃的氣相色譜進(jìn)樣口，老化30 min的萃取頭并進(jìn)行空白試驗(yàn)，直至無(wú)雜峰出現(xiàn)。然后，將SPME萃取頭迅速插入樣品瓶的頂空部分，在60℃下萃取吸附30 min后，抽回萃取頭，再迅速插入氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）進(jìn)樣口，置于 250 ℃下解吸5 min后，進(jìn)行GC-MS分析測(cè)定樣品中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

1.7.2 氣相色譜-質(zhì)譜分析條件

氣相色譜條件：TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）彈性毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度250℃；載氣為氦氣，流速1.0 mL/min，不分流進(jìn)樣模式，隨后進(jìn)行程序升溫；柱溫起始溫度35℃，停留3min，以5℃/min升至180℃，保持3min，然后再以10℃/min升至250℃，最后停留5 min。

質(zhì)譜條件：電子轟擊（electron ionization，EI）離子源，溫度250℃，電子能量70 eV，傳輸線溫度250℃，離子源四極桿溫度150℃，質(zhì)量掃描范圍35 m/z～500 m/z，分析化合物CAS號(hào)經(jīng)NIST和WLIEYT譜圖庫(kù)檢索分析確認(rèn)定性[14-15]。

1.7.3 揮發(fā)性物質(zhì)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)檢索對(duì)比后選擇匹配度大于800的結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索結(jié)合譜庫(kù)確定其揮發(fā)性物質(zhì)并用峰面積歸一化法確定揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量，通過(guò)保留時(shí)間、質(zhì)譜及化合物成分等參數(shù)進(jìn)一步確定其揮發(fā)性物質(zhì)[16-17]。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Excel統(tǒng)計(jì)所有數(shù)據(jù)，并采用Origin軟件進(jìn)行繪圖，所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)分析

腓骨杯樁菇的子實(shí)體形態(tài)見(jiàn)圖1。

圖1 腓骨杯樁菇的子實(shí)體Fig.1 Basidiomata of Clitopaxillus fibulatus

初期菌蓋凸起，隨著年齡的增長(zhǎng)漸漸平展，中間略微凹陷，乳白色至淺褐色，邊緣內(nèi)卷，菌蓋寬4 cm～10cm，具有同心皺紋或裂縫；菌褶彎生至延生，奶油色至淡黃色，有分叉，褶間有橫脈；菌柄（4～10）cm×（1～3）cm，實(shí)心，圓柱形，黃白色至淡黃色，菌柄內(nèi)部隨著年齡的增長(zhǎng)逐漸變成海綿狀；菌肉氣味濃厚。

擔(dān)孢子（5.12～6.45）μm×（3.93～4.57）μm（n=20），（長(zhǎng)寬比，Q）=1.30～1.41，（長(zhǎng)寬比平均值，Qm）=1.36±0.10，寬橢圓形至橢圓形，壁薄光滑，無(wú)色透明。擔(dān)子（23.5～37.6）μm×（4.8～6.4）μm（n=20），長(zhǎng)棍棒狀到接近圓柱形，有4個(gè)擔(dān)子小梗，小梗長(zhǎng)約5 μm。褶緣囊狀體（30.34～9.67）μm×（7.46～8.12）μm。鎖狀聯(lián)合存在于子實(shí)體的菌絲和基部，有時(shí)候呈現(xiàn)環(huán)形或者未封閉狀態(tài)。菌絲細(xì)胞內(nèi)帶有褐色色素。

2.2 分子學(xué)鑒定

基于腓骨杯樁菇的ITS序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2。

圖2 基于腓骨杯樁菇的ITS序列構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Clitopaxillus fibulatus and rellated species based on ITS sequence

通過(guò)rDNA的ITS、序列比對(duì)和人工復(fù)檢后，將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)。并從構(gòu)建的ML系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，以灰乳牛肝菌Suillus viscidus（MZ005510.1）做外類(lèi)群比對(duì)，本研究采集的G16174標(biāo)本與已有相關(guān)研究的腓骨杯樁菇（Clitopaxillus fibulatus）模式標(biāo)本ITS序列聚在一起，支持率高達(dá)100%，并且與褶樁菇屬及近似屬的其他物種分開(kāi)。

2.3 腓骨杯樁菇基本營(yíng)養(yǎng)成分分析

腓骨杯樁菇的主要營(yíng)養(yǎng)成分分析見(jiàn)表1。

表1 腓骨杯樁菇的主要營(yíng)養(yǎng)成分分析Table 1 Analysis of main nurition components of Clitopaxillus fibulatus

子實(shí)體干品中含有33.9%的蛋白質(zhì)、5.9%的灰分、1.6%的脂肪、45.3%的總糖和4.32%的多糖。腓骨杯樁菇蛋白質(zhì)含量是平菇的1.8倍，是香菇的1.7倍（平菇的蛋白質(zhì)含量為19.08%[19]，香菇的20.3%[20]），其脂肪含量是平菇的0.9倍，是香菇0.5倍（平菇的脂肪含量為1.71%[19]，香菇的脂肪含量為3.4%[20]）。綜上所述，腓骨杯樁菇的蛋白質(zhì)含量較高，脂肪含量較低，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白的來(lái)源。

2.4 氨基酸組成分析及評(píng)價(jià)

2.4.1 氨基酸組成分析

腓骨杯樁菇氨基酸分析色譜圖見(jiàn)圖3。腓骨杯樁菇中氨基酸的組成與含量分析見(jiàn)表2。

圖3 腓骨杯樁菇氨基酸分析色譜圖Fig.3 Amino acid chromatograms of Clitopaxillus fibulatus

表2 腓骨杯樁菇中氨基酸的組成與含量分析Table 2 Composition and content analysis of Clitopaxillus fibulatus

腓骨杯樁菇經(jīng)過(guò)酸水解后對(duì)其氨基酸種類(lèi)及含量進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得的17種氨基酸（色氨酸除外）中，必需氨基酸有7種，非必需氨基酸有10種。必需氨基酸占總氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸含量的49.39%。在必需氨基酸中，賴氨酸的含量為33.53 mg/g，占必需氨基酸總含量的29.61%，可以補(bǔ)充人體賴氨酸的不足。腓骨杯樁菇子實(shí)體中含氮呈味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸和酪氨酸）的總量為173.05 mg/g，占總氨基酸含量的47.09%。極其豐富的含氮呈味氨基酸，賦予腓骨杯樁菇良好的風(fēng)味與鮮味，為開(kāi)發(fā)天然呈鮮味物質(zhì)及其功能性風(fēng)味食品提供了理論依據(jù)[21-22]。

2.4.2 氨基酸評(píng)價(jià)

腓骨杯樁菇的氨基酸評(píng)價(jià)見(jiàn)表3。

表3 腓骨杯樁菇的氨基酸評(píng)價(jià)Table 3 Evaluation of amino acids of Clitopaxillus fibulatus

氨基酸評(píng)分主要反映的是食物蛋白中氨基酸含量與氨基酸評(píng)分模式中對(duì)應(yīng)氨基酸需要量相比的滿足程度。由表3知，腓骨杯樁菇氨基酸含量能滿足FAO/WHO的成人推薦值[23-24]，其中賴氨酸高于成人模式推薦值的1.09倍，氨基酸評(píng)分高達(dá)2.10；蘇氨酸高于成人模式推薦值的1.21倍，氨基酸評(píng)分高達(dá)2.21；苯丙氨酸+酪氨酸高于成人模式推薦值的0.58倍，氨基酸評(píng)分為1.58。因此可得，腓骨杯樁菇能滿足成人對(duì)氨基酸的需求。

2.5 腓骨杯樁菇子實(shí)體揮發(fā)性物質(zhì)分析

腓骨杯樁菇子實(shí)體中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS總離子流色譜圖見(jiàn)圖4。腓骨杯樁揮發(fā)性成分的GCMS鑒定結(jié)果見(jiàn)表4。

圖4 腓骨杯樁菇子實(shí)體中揮發(fā)性風(fēng)味成分的GC-MS總離子流色譜圖Fig.4 Total ion chromatogram of GC-MS from volatile flavor components in Clitopaxillus fibulatus

表4 腓骨杯樁揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定結(jié)果Table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

續(xù)表4 腓骨杯樁揮發(fā)性成分的GC-MS鑒定結(jié)果Continue table 4 Analytical results for GC-MS identification of volatile compounds in Clitopaxillus fibulatus

采用固相微萃取、氣相色譜-質(zhì)譜的方法分析腓骨杯樁菇的揮發(fā)性物質(zhì)[25]。共檢測(cè)出的58種化合物中醛、醇、酮、烷烴種類(lèi)比較豐富，分別有12種、6種、7種、7種，其含量也比較高，分別占總揮發(fā)物質(zhì)的31.08%、14.17%、7.42%、5.47%、6.43%。在醛類(lèi)揮發(fā)物中，己醛的含量達(dá)到了15.05%，使子實(shí)體具有獨(dú)特的油脂和蘋(píng)果香氣。其他揮發(fā)物質(zhì)：酸類(lèi)物質(zhì)5種、吡嗪2種、酯類(lèi)2種、呋喃1種，分別占總揮發(fā)物質(zhì)的5.47%、3.77%、3.35%、12.70%。豐富的揮發(fā)物質(zhì)構(gòu)成了腓骨杯樁菇獨(dú)特的風(fēng)味，賦予其獨(dú)特鮮味物質(zhì)[26]。綜上所述，這些主要的風(fēng)味化合物與腓骨杯樁菇獨(dú)特的香味有密切的聯(lián)系。

3 結(jié)論

通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)分析驗(yàn)證了此種臺(tái)蘑為腓骨杯樁菇，其子實(shí)體蛋白質(zhì)、總糖、多糖含量比較高，分別占干樣的33.9%、45.3%、4.32%，灰分和脂肪含量比較低，分別占干樣的5.9%、1.6%。其蛋白質(zhì)含量高于香菇和平菇，脂肪含量卻低于香菇和平菇。子實(shí)體中氨基酸種類(lèi)齊全，共有17種氨基酸，其中必需氨基酸占總氨基酸含量的33.06%，必需氨基酸占非必需氨基酸的49.39%，能滿足FAO/WHO的18歲以上推薦值。含有的58種揮發(fā)物質(zhì)中醛、醇、酮、烷烴種類(lèi)比較多，醛類(lèi)的揮發(fā)性物質(zhì)含量高達(dá)31.08%，特別是己醛，達(dá)到了15.05%，賦予了子實(shí)體油脂和青草氣及蘋(píng)果香味，2-正戊基呋喃含量為12.70%，給予子實(shí)體獨(dú)特的鮮味。綜上所述，腓骨杯樁菇子實(shí)體是一種高蛋白、低脂、能滿足人體需求、具有獨(dú)特風(fēng)味的食品原料，可進(jìn)一步深層次開(kāi)發(fā)臺(tái)蘑風(fēng)味食品和產(chǎn)品。