植物群體DNA甲基化研究進展

鄒枚伶 夏志強 王文泉

(1中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所海南?？?71101;2海南大學海南?？?70228;3華中農業(yè)大學湖北武漢430070)

自Waddington在1942年第一次提出表觀遺傳 學（Epigenetic）的概念，即“基因與環(huán)境互作導致表型的出現(xiàn)”，標志著表觀遺傳學問世。Waddington［1］對表觀遺傳學現(xiàn)象的描述強調了其“變異”的特點。以Bird［2］為代表的現(xiàn)代表觀遺傳又進一步定義為“不基于DNA序列變異的基因表達的可遺傳改變”，強調了“表觀遺傳中的變異大部分可以在世代間穩(wěn)定遺傳”。但二者都是對現(xiàn)象的描述，缺少合理和深入的分子機理的闡述解釋。Nei等于1975年提出基于研究群體中基因型頻率及遺傳結構關系的群體遺傳學，但當時并未考慮到群體表觀遺傳的影響。后續(xù)對植物群體表觀遺傳的研究，彌補了群體遺傳學對于不符合孟德爾遺傳定律的表型的重要認識。DNA甲基化（DNA methylation）是DNA化學修飾的一種形式，也是表觀遺傳學的重要組成部分，指通過DNA復制后，經各類DNA甲基轉移酶催化，將S-腺苷甲硫氨酸上的甲基共價結合到DNA分子的胞嘧啶堿基或腺嘌呤上的過程，能夠在不改變DNA序列的前提下，改變遺傳表現(xiàn)。植物群體中DNA甲基化（DNA Methylation in Plant Population）的變異是植物表型和基因表達變異的重要來源之一。近年來隨著基因組學和分子生物學快速發(fā)展，使得DNA甲基化遺傳和變異的分子機理得以基本闡明，并使植物群體DNA甲基化成為研究熱點。

1 植物中的DNA甲基化修飾

在植物不同的生物學過程中，作為重要的表觀遺傳標志物之一，DNA甲基化是表觀遺傳學的重要組成部分，在維持植物基因組穩(wěn)定、調控基因表達、響應外界環(huán)境脅迫等方面發(fā)揮重要作用［3-7］。DNA甲基化通常發(fā)生在植物胞嘧啶堿基中，包含CG、CHG和CHH（H代表A，T或C）類型［8-9］。CG類型甲基化水平明顯高于CHG或CHH甲基化類型［10］。Zhang等［7］發(fā)表了第一張植物全基因組甲基化圖譜，發(fā)現(xiàn)超過三分之一的表達基因在基因區(qū)含有甲基化，而只有約5%的基因在啟動子區(qū)內顯示甲基化，并發(fā)現(xiàn)基因區(qū)甲基化的擬南芥基因高度表達。隨后Inagaki等［11］發(fā)現(xiàn)，基因區(qū)甲基化在轉錄區(qū)比在非轉錄區(qū)高，然而這種關聯(lián)的機制還不明確。

DNA甲基化檢測目前常用的主要方法有甲基化敏感擴增多態(tài)性方法［12］（methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP）、高效液相色譜法［13］（high performance liquid chromatography，HPLC）、甲基化DNA免 疫沉淀測定法［14］（methylated DNA immunoprecipitation-sequencing，MeDIP-seq）、AFSM法［15］（Amplifiedfragment single nucleotide polymorphism and methylation），以亞硫酸氫鹽測序法［16］（bisulfite sequencing）等。到目前為止，亞硫酸氫鹽測序法仍是用于檢測全基因組DNA甲基化的最經典和最重要的方法，盡管昂貴的費用可能會限制其樣本的檢測數量。而AFSM技術基于二代測序利用不同甲基化敏感程度的限制性內切酶進行雙酶切，降低基因組復雜度，同時利用標簽技術，可以用超低成本，同時對大規(guī)模無參考基因組的非模式植物群體樣本進行高性價比的DNA甲基化和SNP分析［17-20］。

植物中建立和維護甲基化，以及去甲基化的主流研究認為，主要分為從頭甲基化和甲基化維護，以及去甲基化機制［21］。發(fā)生在以前未甲基化的胞嘧啶的甲基化被稱為從頭甲基化機制［21］，是由同源甲基轉移酶DRM2和DNMT3催化。在全基因組中一旦建立起DNA甲基化模式，就必須穩(wěn)定地維護，以確保轉座子保持在沉默狀態(tài)，并維護識別的細胞類型。目前研究發(fā)現(xiàn)，維護甲基化主要通過以下3種途徑：第一種是通過DNA甲基轉移酶MET1（也稱為DMT1）、DNMT1同源甲基化轉移酶和MSH1等甲基酶維護CG甲基化；第二種是通過植物特有的DNA甲基轉移酶色氨酸甲酯酶CMT3維護CHG甲基化；第三種是通過包含DNA甲基轉移酶DRM1/2和RNAi的RNA介導的DNA甲基化（RdDM）途徑，維護CHH甲基化［22-23］。

2 植物中建立和維護甲基化，以及去甲基化機制

2.1 植物中甲基化建立機制

CG、CHG和CHH這3種類型的甲基化均可以通過RdDM途徑發(fā)生從頭DNA甲基化。在植物中RNA介導的DNA甲基化現(xiàn)象［24-25］最早是1994年由Wassenegger等［26］發(fā)現(xiàn)。在植物生長發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA靶向同源基因組DNA序列導致胞嘧啶甲基化，即RdDM［26］。RdDM通過一套復雜的機制來沉默重復序列和轉座子［27］。除了RNAi和DRM1/2外，RdDM還需要植物特異性RNA聚合酶Pol II、Pol IV和Pol V，來調節(jié)DNA甲基化途徑［25，28-29］。Zemach等［30］發(fā)現(xiàn)，擬南芥RdDM途徑主要介導短的轉座子和常染色質區(qū)域，以及長的異染色質轉座子邊緣的CHH甲基化，而長染色質基因區(qū)CHH甲基化由CMT2甲基轉移酶獨立維護。

2.2 植物中CG類型甲基化維護機制

在植物中，CG甲基化是最豐富的DNA甲基化類型，廣泛分布于基因區(qū)、轉座元件和重復序列中［10，31］，可以通過DNA復制過程中簡單的復制機制維護［32］。MET1是CG甲基化維護中重要的DNA甲基轉移酶［7，10，31，33］。Bewick等［34］發(fā)現(xiàn)，植物組成型表達基因的基因區(qū)中有大量CG甲基化位點，在進化中丟失了GBM的被子植物中同時也缺失甲基轉移酶CMT3，證明了維護被子植物基因區(qū)甲基化需要CMT3。Stroud等［25］發(fā)現(xiàn)，met1擬南芥缺陷型突變株在全基因組中無CG類型甲基化，而vim1/2/3擬南芥缺陷型突變株中全基因組CG類型甲基化也大大缺失，并發(fā)現(xiàn)在ddm1擬南芥缺陷型突變株異染色質甲基化大大缺失。植物中ddm1突變體可引起H3K9甲基化缺失［35］，H3K9高度甲基化與植物基因表達沉默相關［36］。Virdi等［37］發(fā)現(xiàn)，擬南芥msh1突變株CG甲基化類型發(fā)生超甲基化。

2.3 植物中CHG類型甲基化維護機制

CHG甲基化被認為通過由包含組蛋白H3K9me2和DNA甲基化的加強環(huán)維護［32，36，38-39］。CMT3是擬南芥中主要負責維護CHG甲基化的甲基轉移酶，Stroud等［25］研究發(fā)現(xiàn)，CMT3擬南芥缺陷型植株中CHG甲基化水平相比野生型大大減少。其它研究中也發(fā)現(xiàn)，當DNA甲基轉移酶CMT3或者負責H3K9甲基化的組蛋白甲基轉移酶KYP（又稱SUVH4）減少時，將導致CHG類型甲基化水平顯著降低［40-42］。觀察到的DNA和組蛋白修飾的相互依賴性可以通過CMT3和KYP的復合結構域結構發(fā)現(xiàn)。除了其組蛋白甲基轉移酶結構域，KYP具有特異性結合CHG甲基化的SRA結構域，這表明CHG甲基化可影響KYP。另一方面，CMT3具有結合甲基化組蛋白H3尾部的結合位點，這表明KYP的組蛋白甲基化也可影響CMT3［38-39，43］。另外，除KYP外，負責H3K9甲基化的組蛋白甲基轉移酶SUVH5和SUVH6也是重要的CHG甲基化轉移酶，kyp、suvh5/6缺陷株中CHG甲基化類型相比野生型也是大大減少［25，44-45］。在許多情況下，這些修飾之間的聯(lián)系似乎涉及組蛋白和DNA甲基轉移酶之間的蛋白互作［46］。

2.4 植物中CHH類型甲基化維護機制

CHH甲基化是通過CMT2和RdDM從頭甲基化來形成和維護［5，47］。CMT2對于植物維護CHH甲基化，特別是長異染色質元件的CHH甲基化，起了非常重要的作用［30］。然而在一些位點，CHH甲基化由CMT3、DRM1/2控制［25，48］。另外還發(fā)現(xiàn)，KYP SUVH5/6、通過另外的甲基化途徑維護部分CHH甲基化［25］。

CG甲基化與非CG甲基化也是相互依存關系。Stroud等［25］還發(fā)現(xiàn)CG甲基化需要用于維護CHG甲基化，而同時CG甲基化取決于特定位點的非CG甲基化，在KYP suvh5/6，cmt3和drm1/2擬南芥缺陷突變株中，CG甲基化的缺失與非CG甲基化的缺失有關。

2.5 植物DNA去甲基化機制

盡管大多數的植物DNA甲基化是一種較為穩(wěn)定的表觀遺傳標記，但植物仍可以主動或者被動地發(fā)生去甲基化［49-50］。Ikeda等［51］和Zhu［52］的研究發(fā)現(xiàn)，植物可能通過DNA糖基化酶，與堿基切除修復途徑BER結合，產生去甲基化。在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了DEMETER（DME）、沉默代謝物ROS1、DEMETERLIKE 2（DML2）和DML3［53-56］等DNA糖基化酶，糖基化酶的DME/ROS1家族與HhH-GPD具有同源性，是雙功能酶，其可以打破N-糖苷鍵，去除堿基和DNA主鏈［57-59］。擬南芥的糖基化酶識別并從dsDNA寡核苷酸中去除甲基化的胞嘧啶［55-56，60-62］。通常參與BER的DNA糖基化酶識別和去除誘變底物，包括氧化和烷基化堿基，以及T/G錯配，其通常由甲基化胞嘧啶脫氨產生［57］。Hsieh等［50］在植物生長發(fā)育過程中觀察到了甲基化水平減少的現(xiàn)象。Niederhuth等［49］在克隆繁殖的植物中也發(fā)現(xiàn)了去甲基化現(xiàn)象。

3 植物群體中的DNA甲基化

3.1 植物群體DNA甲基化與植物進化

植物群體DNA甲基化在進化上很重要，也是重要進化過程中的間接結果，通常與基因沉默有關。Niederhuth等［49］對34種不同被子植物甲基化進行研究發(fā)現(xiàn)，廣泛的DNA甲基化模式，在進化方面反映了植物的差異性，如十字花科植物中CHG類型甲基化水平低、基因區(qū)CG甲基化類型少或者缺失，而禾本科中異染色質CHH類型甲基化少或缺失，且基因區(qū)富集CHH類型甲基化。Takuno等［63］發(fā)現(xiàn)，蕨類植物和被子植物CG甲基化相對水平具有一致性，但是CHG甲基化與基因組大小相關?；騾^(qū)甲基化（GBM）在各種植物直系同源物種中具有高度保守性［63-65］。

植物DNA甲基化的遺傳變異是自然變異的潛在來源，影響植物遺傳多樣性，對植物進化及對當地環(huán)境的適應性產生重要貢獻［66］。Graaf等［67］由擬南芥積累的突變評估每一代每個單倍體中每個CpG位點的突變率發(fā)現(xiàn)，擬南芥中正向突變率（即甲基化增加速率）約為2.56×10-4，而反向突變率（即甲基化損失速率）約為6.30×10-4，這些甲基化突變速率比Ossowski等［68］研究發(fā)現(xiàn)的基因突變率（約7×10-9）高約5個數量級，因此，提出在進化過程中表觀遺傳突變與DNA序列單倍型分離的一種進化機制，分離的程度取決于精確的表觀遺傳率和潛在的表觀遺傳選擇效應［67］。擬南芥DNA甲基化的改變可產生可遺傳的表型多樣性，表明復雜性狀表觀遺傳的誘導和自然突變的產生可能是進化中適應不同生態(tài)環(huán)境的一種途徑［67，69-70］。

雖然通過自然突變可以產生DNA甲基化的改變［71-72］，但遺傳和環(huán)境因素對于DNA甲基化的改變更為重要。DNA甲基化變化的遺傳基礎包括TE插入和缺失、染色體重排、甲基化相關因子突變等［73］，而重要的環(huán)境條件包括溫度及其它脅迫條件等［4-5，74-75］。Marí-Ordó?ez等［76］發(fā)現(xiàn)，轉座元件活動導致基因多樣化，從而提供適應進化的潛在性狀來源，因此也在植物進化中發(fā)揮了關鍵作用。常見由TE誘導而導致基因功能缺失，即形成無效突變，從而改變表型。TE誘導無效突變已在植物馴化過程中被多次選擇。Kawase等［77］發(fā)現(xiàn)，低直鏈淀粉率（糯性）地方品種中由于TE插入，淀粉合酶基因GBSS具有弱或無效等位基因。另外白色和粉色的葡萄品種［78-79］、無核蘋果［80］，以及進化中多種花色的形成［81-82］也是由于TE插入形成無效突變引起的。TE插入后還能增強基因表達或阻礙基因表達［83］。在大量玉米、水稻、擬南芥等的研究中發(fā)現(xiàn)，TEs可以介導染色體結構的大規(guī)模變化，從而使發(fā)生缺失、倒位、易位或者其它染色體重排［83-87］。植物通過DNA甲基化還表現(xiàn)出對于環(huán)境的局部適應性。Shen等［88］發(fā)現(xiàn)，依賴于CMT2的CHH甲基化可能影響擬南芥的耐熱性。Dubin等［5］發(fā)現(xiàn)CHH甲基化隨溫度增加而增加，而在基因轉錄區(qū)CG甲基化與擬南芥起源緯度相關。但有另一種觀點認為，從長時間進化角度來看，可遺傳的表觀遺傳變異中環(huán)境誘導對于甲基化變化僅是次要因素［6］。

3.2 植物群體DNA甲基化的遺傳多樣性

植物種內遺傳多樣性可能是群體和生態(tài)系統(tǒng)功能的重要組成部分，大部分研究表明，種內多樣性效應歸因于DNA序列的潛在變化，然而種內表型差異及潛在的功能多樣性同樣也可通過表觀遺傳變異產生。由于植物通常會在同一地理位置生活很長時間，因此植物有可能更傾向于利用DNA甲基化，產生多樣性的表觀遺傳，來快速地適應不斷變化的環(huán)境。

Latzel等［89］在擬南芥群體中發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳多樣性增加后其群體產量增加了40%，且表觀遺傳多樣性增加的群體抗病能力更強。Kawakatsu等［8］通過對來自全球的1 028份擬南芥自然種群甲基化分析發(fā)現(xiàn)，不同種質中基因區(qū)甲基化基因數，具有很大的差異性，并且與這些基因的CG甲基化水平相關。甲基化與種質的地理起源以及氣候有非常明顯的相關性。從地理起源來看，來源于瑞典的擬南芥種質表現(xiàn)出高甲基化，而來源于西班牙的擬南芥種質表現(xiàn)出低甲基化。而從當地氣候溫度來看，CHH甲基化水平與當地氣候溫度呈正相關。Schmitz等［27］在擬南芥群體中觀察到誘導和自發(fā)的表觀遺傳變異，植物表觀遺傳多樣性的增加，有利于增加其抗性、產量和保持其物種穩(wěn)定性。

3.3 植物群體DNA甲基化的遺傳穩(wěn)定性與變異

DNA甲基化可以通過有絲分裂和減數分裂穩(wěn)定遺傳［89］。目前對植物全基因組群體DNA甲基化遺傳學研究還很少，而大都集中在模式植物擬南芥［5-6，90］，玉米［91-92］和大豆［93］中。雖然不同植物物種間的總甲基化含量差異很大［94］，很可能是由于基因組大小和組織的差異［94-95］，特異性甲基化變異的模式似乎都比較保守［5-6，47，90-91，93，96-97］。富含基因的獨立區(qū)域往往是最可變的，而在轉座元件富集的異染色區(qū)域中的變化在很大程度上被抑制［27，67，90-91］。異染色質區(qū)域缺乏變異與TE序列通過RNA介導機制的穩(wěn)定沉默一致［22］。Schmitz等［90］利用全基因組亞硫酸氫鹽測序技術對來自全球的155份擬南芥進行DMR識別，并將該數據與其全基因組DNA序列數據整合，在植物中第一次進行了群體全基因組DNA甲基化研究。在玉米和大豆群體中也發(fā)現(xiàn)DMR受到強烈的遺傳控制［91，93］。有研究表明，許多在植物種群中檢測到的關聯(lián)是因為SNP等位基因標記附近的結構突變，例如TE插入，這些突變會影響DNA甲基化［98-99］。

Cortijo等［100］研究發(fā)現(xiàn)，在同基因型擬南芥群體中實驗誘導的DMR可以顯著穩(wěn)定地遺傳。實驗誘導的DMR在該物種的自然種群中也是可變的，表明這些DMR在野生植株中也會發(fā)生表觀突變，并且可能也潛在地受到自然的選擇。為更進一步了解進化機制，近年來對植物群體表觀遺傳變異進行了大量的研究［69，101-109］。

4 研究趨勢及展望

隨著DNA甲基化測序技術的發(fā)展和測序成本的下降，以及相關生物信息學方法的開發(fā)與優(yōu)化，使得可以對更大量的樣品、更多種類的植物組織進行表觀遺傳學研究，表觀遺傳學將逐步由研究植物個體DNA甲基化圖譜發(fā)展為研究植物群體DNA甲基化。

DNA甲基化可以影響基因表達，并導致明顯的表型差異，以及一些適應環(huán)境變化的性狀。不像轉座子甲基化，在基因區(qū)的CG甲基化并不引起沉默，因為這些基因更傾向于在許多組織中被適度表達［2，33］。Sun等［110］發(fā)現(xiàn)，小麥雜種中甲基化程度降低與基因表達增強有關。Takuno等［63］研究植物基因區(qū)甲基化發(fā)現(xiàn)，針葉樹表達基因中有較高水平的CG和CHG甲基化水平。盡管如此，在met1突變體中，一些基因區(qū)甲基化的基因表達上調［33］，這表明基因區(qū)甲基化與轉錄水平間的相互作用。推測可能基因區(qū)甲基化抑制了某些啟動子產生反義轉錄物［33，111］。然而鮮有發(fā)現(xiàn)met1突變體中反義轉錄增加，并且與基因區(qū)甲基化的基因并不相關［2］。植物遺傳群體雜交種中親本甲基化模式的變異可能有助于新的基因表達，進而出現(xiàn)雜種優(yōu)勢；而植物自然群體出現(xiàn)的甲基化變異通過影響基因表達水平，從而產生表型變異，影響原植物的進化進程。但目前植物群體甲基化、基因表達與表型之間相關研究還較少。近年來，在植物群體中結合DNA甲基化和基因差異表達研究，為研究植物群體DNA甲基化機制提供了新的思路。Feng等［112］通過在水稻中全基因組DNA甲基化測序，結合轉錄組測序分析等發(fā)現(xiàn)，抗逆、金屬離子轉運和轉錄因子等基因發(fā)生甲基化變異可引起其基因表達發(fā)生變化，經5-氮胞苷處理后可通過降低DNA甲基化水平從而促進水稻植株的生長和鎘的積累，從而解析了水稻通過DNA甲基化變異對鎘反應的分子機制。Zou等［17］利用基于二代測序的AFSM技術，高通量地檢測了186份木薯雜交群體的半甲基化位點、全甲基化位點及SNP位點，解析了兩親本和子代甲基化遺傳特征，構建了木薯遺傳連鎖圖譜、DNA甲基化圖譜等，并結合多年多點表型數據進行了耐寒和產量品質相關QTL和表觀QTL定位，同時結合全基因組轉錄組測序，解析了差異甲基化區(qū)域差異表達基因的功能及其相關性。因此，在植物群體中結合轉錄組分析研究植物群體的DNA甲基化變異是可行的。

隨著基因編輯技術的發(fā)展，使得結合基因編輯技術探討去甲基化也成為了以后研究植物群體DNA甲基化機制的新的有效途徑之一。Ji［113］和Gallego-Bartolome［114］分別開發(fā)了擬南芥基因組中隨機、高效、快速去DNA甲基化和高特異性、低脫靶效應的特定位點靶向去除DNA甲基化的兩大類去甲基化新工具，可用于揭示植物群體甲基化變異機理。

根據經典遺傳學理論，Ainouche等［115］認為，遠緣雜種和異源多倍體在進化上的潛力要低于二倍體親本，但后來通過越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，異源多倍體具有普遍性，甚至典型二倍體小基因組植物擬南芥和水稻等在其進化過程中也經歷了多倍化事件［116］。高等植物基因組進化和新物種形成與有性雜交和有性漸滲雜交有關［117］，雜交在高等植物新種形成和進化上具有重要意義。遠緣雜交后產生的雜種可以通過完整基因組加倍形成異源多倍體，或者通過回交使主效基因和主效QTL通過直接或間接方式（如基因互作等）產生新的基因組變異，甚至是產生表型變異，進而改變自然選擇條件下物種進化的進程。在一些極端情況下，遠緣雜種還可以在同倍體水平適應不同生境方面具有明顯雜種優(yōu)勢，且與親本生殖隔離的新種［115］。植物在遠緣雜交和異源多倍體進化過程中，編碼基因和轉座子等DNA甲基化水平及模式等的改變，使得F1雜種或異源多倍體中同一基因組中同源基因和不同基因組中部分同源基因之間的相互作用，從而誘導產生出基因表達差異，進而出現(xiàn)大量廣泛的“不符合孟德爾遺傳規(guī)律的表型變異”的一些進化優(yōu)勢，但具體機理還不清楚。隨著甲基化測序技術的發(fā)展，以后可以在植物群體全基因組甲基化水平進一步深入解析遠緣雜種和多倍體進化過程中DNA甲基化變異及其遺傳調控機制。這將有利于進一步闡明群體表觀遺傳變異的遺傳來源、植物表觀遺傳變異的因果，解析植物中通過雜交導致的雜種優(yōu)勢，甚至新物種形成的機制，種內和種間多樣性，對于生長環(huán)境的適應性、作物馴化的分子基礎。同時，雜種優(yōu)勢高效利用新途徑對于探索表觀遺傳和復雜表型間的關系具有重要意義。另外，受到環(huán)境影響的甲基化如何由短期效應變?yōu)殚L期效應也是很值得研究。