蘋果花葉病研究進(jìn)展

李春霞

(延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 延安 716000)

0 引言

我國蘋果栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一。延安地處西北黃土高原中部，由于海拔高、日照時間長，晝夜溫差大，被世界公認(rèn)的最佳蘋果優(yōu)生區(qū)，生產(chǎn)的蘋果深受國內(nèi)外市場的青睞。蘋果栽培分布在全市13個縣區(qū)，且面積和規(guī)模迅速擴(kuò)大。根據(jù)立地條件，分為旱塬蘋果(南部5個縣)和山地蘋果(北部8個縣(區(qū)))兩大產(chǎn)區(qū)。2020年全市蘋果面積達(dá)到26.67萬hm2，產(chǎn)量達(dá)到400萬t，蘋果產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為延安的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)和農(nóng)民脫貧致富奔小康的主要途徑，同時對水土保持和生態(tài)綠化建設(shè)發(fā)揮重要作用。

蘋果花葉病( Apple Mosaic)在國內(nèi)外蘋果種植區(qū)普遍存在[1～3]。近年來，隨著栽培面積的迅速擴(kuò)大，育苗規(guī)模擴(kuò)大，苗木的頻繁調(diào)運，花葉病日趨嚴(yán)重，成為蘋果生產(chǎn)中危害嚴(yán)重且難防治傳染病之一，給蘋果高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)帶來很大影響，為此，筆者通過大量田間觀察調(diào)查和查閱資料，從蘋果花葉病危害、病原種類及鑒定方法、防治措施等方面進(jìn)行了概述，為人們更加全面認(rèn)識蘋果花葉病和后續(xù)研究提供參考。

1 蘋果花葉病的危害

蘋果花葉病病毒主要危害葉片，除侵染蘋果外，還侵染梨、花紅、桃、櫻桃、山楂、木瓜等薔薇科果樹植物[4],1963年Kristensen和Thomsen 通過調(diào)查和試驗發(fā)現(xiàn)蘋果花葉病毒科侵染19個屬的65種植物[5]。

1.1 對生長結(jié)果的影響

經(jīng)田間觀察和查閱資料證實，一年生枝條感染病后，節(jié)間變短，樹體生長緩慢，延遲結(jié)果；多年生樹感病后，削弱樹勢，枝葉生長緩慢，不易成花，即使結(jié)果，在6月份也容易落果，果實小、畸形果多、味淡、不耐貯藏，降低產(chǎn)量和品質(zhì)，嚴(yán)重者造成早期落葉[6～8]。

王永宗調(diào)查認(rèn)為，蘋果花葉病主要發(fā)生在老齡果樹，嚴(yán)重老齡果園發(fā)病率在20%，平均減產(chǎn)在30%左右[9]。但經(jīng)本人近10 a在延安13個縣田間調(diào)查觀察，隨著蘋果栽植面積的不斷擴(kuò)大，除了20多年老齡果園花葉病越來越重外，新栽幼樹和未結(jié)果樹也很嚴(yán)重，甚至在一千多畝高標(biāo)準(zhǔn)新建示范園中，有的地塊病株率達(dá)到15%～25%，嚴(yán)重影響果樹早果豐產(chǎn)。

1.2 對葉綠素含量和光合作用的影響

花葉病造成品質(zhì)和產(chǎn)量是由于影響葉綠素和花青素的含量。柴光臻等研究表明，蘋果花葉病能顯著降低蘋果葉片葉綠素含量和葉片凈光合速率[10]；田明璐研究結(jié)果表明，隨著病害嚴(yán)重程度的增大,蘋果葉片的花青素含量升高[11]。

1.3 對細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

Fulton等對蘋果花葉病毒粒體的研究發(fā)現(xiàn)，花葉病毒在體外非常不穩(wěn)定，在54℃的熱穩(wěn)定性只有10 min，在含0.02M2-巰基乙醇的緩沖液中只能保持2～3 h的侵染活性。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)蘋果花葉病毒粒子的大小為25 nm或29 nm[12]。張明珍選用花葉病毒葉片進(jìn)行超薄電鏡切片觀察，發(fā)現(xiàn)蘋果花葉病葉片的細(xì)胞發(fā)生明顯變化，病毒粒以分散的長線狀形式聚集排列在細(xì)胞質(zhì)中，葉綠體畸形且數(shù)目減少，淀粉粒膨脹、增多，在葉綠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有鐵蛋白存在，遠(yuǎn)離細(xì)胞壁[13]。

2 蘋果花葉病癥狀表現(xiàn)

蘋果花葉病癥狀表現(xiàn)受病原株系、環(huán)境條件影響(尤其是溫度、光照等因素)變化較大。主要癥狀類型有斑駁型、花葉型、網(wǎng)斑型、云斑型、環(huán)斑型、鑲邊型及以上癥狀的混合型，枝條和果實則沒有明顯病癥[3,13]。

在田間同一株、同一枝或同一葉片常常出現(xiàn)不同癥狀 ，但以花葉型、斑駁型和云斑型幾種類型居多。成年樹上的癥狀發(fā)展較慢，并且表現(xiàn)在部分枝條上，常經(jīng)過幾年后仍然局限于部枝紙條上；但在苗木上則發(fā)展很快，在發(fā)病當(dāng)年即可全株出現(xiàn)癥狀。

3 果樹病毒的檢測方法

果樹病毒檢測方法隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展而不斷提高，由最初的生物鑒定，增加了血清鑒定、電子顯微技術(shù)鑒定、熒光鑒定及分子生物學(xué)鑒定等多種方法，各種方法各有優(yōu)勢，取長補(bǔ)短，相互配合，使得檢測時間不斷縮短，準(zhǔn)確性不斷提高。

3.1 生物學(xué)檢測(即指示植物法)

這是一種比較傳統(tǒng)的病毒檢測方法(也叫指示植物法)。即利用指示植物對病毒敏感性進(jìn)行測試。當(dāng)指示植物受不同病毒侵染時，能夠快速顯現(xiàn)出不同的生物學(xué)癥狀，根據(jù)特異性生物學(xué)癥狀表現(xiàn)判斷病毒的種類。這種方法簡單、方便、直觀、成本低，可在大田、溫室或試管嫁接方法，但因速度慢且靈敏度低。

3.2 血清學(xué)檢測

主要是指酶聯(lián)免疫吸附分析方法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA法)。該方法實驗成本低、簡單、特異性好、快速，能夠?qū)Υ罅繕悠愤M(jìn)行快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測，是當(dāng)前植物病毒檢測中應(yīng)用最廣泛的方法。但是ELISA法的準(zhǔn)確性往往依賴于抗血清的品質(zhì)以及病毒濃度。不同實驗材料、組織部位、取樣時間，樣品中病毒濃度變化差異較大，會導(dǎo)致ELISA檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性[14]。溫度過高會降低樣品中的病毒含量，降低ELISA檢測結(jié)果的可信度。此外，病毒變異較快、株系復(fù)雜，容易導(dǎo)致特定病毒抗體不能識別特異抗原或識別程度下降，從而導(dǎo)致漏檢或錯檢[15]。杜國榮等研究表明，病毒濃度低的寄主植物中的病毒不易被檢測到[16]。

3.3 電子顯微檢測

電子顯微鏡檢測可以準(zhǔn)確、直觀的看到病毒性態(tài)結(jié)構(gòu)、在寄主細(xì)胞內(nèi)存在狀態(tài)以及引起寄主細(xì)胞的病變和內(nèi)含體特征，是深度研究引起病變細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞學(xué)方面的重要手段。但是電鏡儀器昂貴、操作復(fù)雜，技術(shù)水平要求高。這種方法不適于大量樣本檢測[17]。

3.4 分子生物學(xué)檢測

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription PCR，簡稱RT-PCR)技術(shù)，具有檢測速度快、靈明度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，已用于多種植物病毒的診斷與檢測[18～20]。在果樹病毒檢測方面應(yīng)用的分子生物技術(shù)主要包括核酸分雜交技術(shù)、多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)、雙鏈RNA電泳技術(shù)、熒光定量PCR(real-time PCR)技術(shù),又稱實時定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)技術(shù)等。有研究認(rèn)為RT-qPCR技術(shù)檢測靈敏度是ELISA檢測的106倍[21]；尤其是一步法RT-qPCR的應(yīng)用，具有更好的特異性[22]。這種方法可以適用于大樣本病毒檢測。

3.5 高通量測序技術(shù)

又稱為下一代測序(Next Generation Sequencing NGS),是能夠給予病毒入侵植物后產(chǎn)生的小干擾進(jìn)行測序分析的技術(shù)方法，利用它能夠發(fā)現(xiàn)新的病毒分子及其致病機(jī)理[23]。

4 蘋果花葉病病毒種類檢測及確定

蘋果花葉病病原種類問題，隨著植物病毒研究方法和技術(shù)不斷提高，蘋果花葉病毒鑒定技術(shù)也在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新，對病毒種類得到進(jìn)一步認(rèn)識。從首次報道蘋果花葉以來，人們普遍認(rèn)為，引起花葉病的病原為單一蘋果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)侵染所致，并且也做了大量的研究檢測確認(rèn)，如韓禮星(1991年)曾利用指示植物和血清學(xué)方法檢測到蘋果花葉病毒[24]，洪霓等(1994年)采用A蛋白酶聯(lián)免疫法檢測了蘋果花葉病毒，并對血清學(xué)檢測蘋果花葉病毒進(jìn)行探討，隨后，專家學(xué)者們將先進(jìn)的分在生物技術(shù)應(yīng)用到蘋果花葉病的檢測中[25]。楊俊玲于2004年，首次建立了蘋果花葉病毒(ApMV)和李屬矮縮病毒(PDV)RT—PCR檢測體系,并優(yōu)化了ApMV的RT—PCR監(jiān)測體系，實現(xiàn)了高效低成本檢測類[26]，候義龍等[27]和冀志蕊等[28]也分別研究建立了蘋果花葉病毒RT-PCR檢測技術(shù)。

也有一些專家學(xué)者認(rèn)為引起蘋果花葉病的毒原是李屬壞死環(huán)斑病毒(Prunus nicrotic ringspot apple mosaic strain virus，PNRSV)中的蘋果花葉株系[6,7]。另外，邱強(qiáng)曾報道除蘋果花葉病毒外，還有李屬壞死環(huán)斑病毒中的蘋果花葉株系，這種病毒在我國是否存在及分布情況，有待研究。2016年Hu et al.在中國首次報道了李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)能夠侵染蘋果葉片，引起花葉病[29]，梁鵬博等研究也說明，李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)可能會引起蘋果花葉病[30]。

近年來，高通量測序技術(shù)在蘋果花葉病病毒檢測和鑒定中得到運用，檢測出引起花葉病新的病原--蘋果壞死花葉病毒(Apple necrotic mosaic virus,ApNMV)，它與ApMV和PNRSV親緣關(guān)系較近，可能是引起我國蘋果花葉病的病原[23,31～32]。國內(nèi)外在蘋果花葉病病葉中檢測到蘋果壞死花葉病毒(ApNMV)的報道也有一些[33～36]。有專家在山東棗莊海棠花葉病葉片中也檢測出蘋果壞死花葉病毒[37]。這些研究結(jié)果證實李屬壞死環(huán)斑病毒和蘋果壞死花葉病毒都是引起蘋果花葉病的病原[38]。

綜上所述，引起蘋果花葉病的病原不是由單一花葉病毒引起，而是由不同病毒引起系統(tǒng)侵染病害。

5 蘋果花葉病發(fā)病規(guī)律

Vibert于1863年正式報到蘋果花葉病的發(fā)生，指出該病能夠通過芽接傳播，后來Blodgett(1923)[39]和Bradford(1933)[40]試驗也證明蘋果花葉病可借芽接和切接進(jìn)行傳播，這是最早證明能夠通過嫁接傳播的病毒病害之一。人們普遍認(rèn)為病毒主要靠嫁接傳播，無論砧木或接穗帶毒，均可形成新的病株。蘋果花葉病毒(ApMV)既不能夠通過帶毒的種子和花粉傳播，也沒有相關(guān)傳播媒介被報道[41～42]。

李屬壞死環(huán)斑病毒(PNRSV)的種子和花粉傳毒機(jī)理研究較為透徹。PNRSV入侵花粉粒，感染胚囊和生殖細(xì)胞，減少花粉粒萌發(fā)，延遲花粉管的生長[43～44]。PNRSV在種子發(fā)育的早期就能夠侵染包括胚在內(nèi)的種子的所有部分。進(jìn)行感染PNRSV杏果實的種子萌發(fā)試驗發(fā)現(xiàn)，10%的感病種子能夠完成PNRSV的侵染過程，部分幼苗表現(xiàn)嚴(yán)重的萎縮現(xiàn)象[45]。

嫁接后的潛育期長短不一，一般在3～27個月之間，氣溫10～20℃時，光照較強(qiáng)，土壤干旱及樹勢衰弱時，有利于癥狀表現(xiàn)。幼苗接種后，潛育期一般較短。

蘋果花葉病癥狀表現(xiàn)，在蘋果萌芽后10～20 d表現(xiàn)出來，在幼果期(花后20～30 d)發(fā)展迅速，其后急劇減緩。7～8月盛夏期，病害基本停止發(fā)展，甚至出現(xiàn)癥狀隱蔽現(xiàn)象。9月初病樹抽發(fā)秋稍后，癥狀又重新開始發(fā)展，10月份又急劇減緩，11月份完全停止。

6 蘋果花葉病防治方法

6.1 選用無病毒接穗和砧木

栽培無病毒苗木，是防治蘋果花葉病毒的根本措施[3,6～9，46～47]。但是由于無毒苗木繁殖程序復(fù)雜，技術(shù)水平要求高，環(huán)境條件要求嚴(yán)格，價格貴，在生產(chǎn)上應(yīng)用很少，大面積推廣也較為困難。因此，在繁育苗木是，嚴(yán)格選用無病毒接穗和砧木是簡單實用的最有效的辦法[48～50]。

6.2 使用有效藥劑，是控制病害的發(fā)生發(fā)展最有效的方法

在生產(chǎn)中，要加強(qiáng)管理，增強(qiáng)樹勢，提高抗病能力；對于嚴(yán)重的病枝要剪除或嚴(yán)重的病苗要拔掉，這些對預(yù)防和減少花葉病的發(fā)生有重要作用。對已經(jīng)掛果的果園，使用有效藥劑，是控制病害的發(fā)生發(fā)展最有效的方法。許多專家使用化學(xué)農(nóng)藥也進(jìn)行了大量研究，如春季發(fā)病初期，可試噴灑1.5%植病靈乳劑1 000倍液或83增抗劑100倍液，20%鹽酸.嗎林胍.銅可濕性粉劑(毒克星，原名病毒A)4 000倍液，隔10～15 d噴1次，連續(xù)2～3次,可有效防治花葉病。 用20%嗎胍.乙酸銅灌根，在3月20日～4月20日防治蘋果花葉病效果可達(dá)約98%以上[8,51～52]。趙小明等用寡聚半乳糖醛酸300倍～500倍噴霧，防效達(dá)87%,81%～92.08%[53]。呂開偉等采用放射溝根施施果多防治蘋果花葉病田間試驗，防治效果達(dá)75%，既能增產(chǎn)又能提早成熟期[54]。楊鴛研究表明，6%阿泰靈(寡糖.鏈蛋白)1 000倍液、10%病毒唑1 500倍液和2%嗎啉胍.銅1 000倍液對花葉病都有防治效果，并且用6%阿泰靈輸液滴干技術(shù)，不僅可以防治花葉病，還可以提高果實品質(zhì)[55]。

7 展望

7.1 利用生物農(nóng)藥及復(fù)配劑防控需要試驗

蘋果花葉病因為發(fā)病較慢，常不被人重視。隨著病害越來越重，盡管在防治上已取得了一定進(jìn)展，但是生物農(nóng)藥、生物農(nóng)藥與生長調(diào)節(jié)劑(如蕓苔素)復(fù)配在防治蘋果花葉病方面報道還很少，隨著藥肥雙減在生產(chǎn)中的實施進(jìn)展，迫切需要不斷研究新的生物農(nóng)藥及復(fù)配劑防效試驗。

7.2 實生苗花葉病病原需要鑒定

專家學(xué)者研究認(rèn)為，蘋果花葉病毒(ApMV)既不能夠通過帶毒的種子和花粉傳播，也沒有相關(guān)傳播媒介被報道[41～42]。但國內(nèi)外都曾在實生苗圃里見到花葉病株，根據(jù)在一些地區(qū)調(diào)查(1977年)看到不少海棠實生苗中有花葉病株，可見種子傳染花葉病毒的可能性是很大的[6,8]。這是由李屬壞死環(huán)斑病毒侵染種子引起，還是由最新發(fā)現(xiàn)的蘋果壞死花葉病毒侵染種子引起，目前尚無確切的試驗證明， 有待于進(jìn)一步研究。另外，關(guān)于新發(fā)現(xiàn)的蘋果壞死花葉病毒致病機(jī)理和傳播途徑，文獻(xiàn)報到較少。

7.3 新品種對花葉病抗性需要研究

錦繡海棠由于結(jié)果早、豐產(chǎn)，風(fēng)味美，成熟早，是集觀賞和鮮食為一體的優(yōu)良品種，深受人們的青睞，近年來，作為矮化密植新建果園優(yōu)良的授粉樹或觀光園的主栽品種，面積在不斷擴(kuò)大。經(jīng)過在延安富士和錦繡海棠在同一塊地或同一個果園中調(diào)查觀察，紅富士蘋果樹或輕或重都有花葉病，而錦繡海棠卻沒有見到花葉病，是否錦繡海棠較抗蘋果花葉病，有待研究。