細胞焦亡在腫瘤中的作用機制及治療進展

胡凌煜，吳 斌，鐘征翔

(1.嘉興市第二醫(yī)院肝膽外科，浙江 嘉興 314000；2.蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠 233000)

惡性腫瘤是人類面臨的最為棘手的疾病之一，近年來發(fā)病率逐年增高。惡性腫瘤無法根治，消耗了大量的社會醫(yī)療資源，國內(nèi)外大量的研究者為此致力于癌癥研究。腫瘤有許多的表型它們是導(dǎo)致腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，抵抗細胞死亡是其的重要表型之一[1-2]。正常細胞的增殖和死亡是相對平衡的，而腫瘤細胞的生長是不受控制的，以往研究認為腫瘤中的細胞凋亡(Apoptosis)出現(xiàn)了問題。細胞凋亡作為程序性細胞死亡的一種形式，其自主的細胞裂解不會引起炎癥，并積極參與腫瘤細胞的生死平衡過程。在之前的幾十年間，凋亡在腫瘤領(lǐng)域被廣泛研究報道，近年來出現(xiàn)一種新的細胞死亡方式—細胞焦亡(Pyroptosis)。細胞焦亡被認為是一種全新的程序性細胞死亡方式，1992年巴斯德研究所在福氏志賀菌感染的巨噬細胞中首次觀察到這種特殊現(xiàn)象。2000年，Brennan等研究發(fā)現(xiàn)沙門氏菌通過一種依賴于caspase-1介導(dǎo)的炎性壞死機制引起巨噬細胞死亡，并提出了“細胞焦亡”這一概念。2018年，細胞死亡命名委員會(NCCD)正式建議將細胞焦亡定義為調(diào)節(jié)性細胞死亡(Regulated cell death，RCD)的一種形式。相比于細胞凋亡，細胞焦亡的發(fā)生更快、更劇烈，并伴隨大量促炎癥因子的釋放。因此，深入研究這種死亡效應(yīng)有助于從新的角度揭示腫瘤細胞死亡機制，對于開發(fā)腫瘤治療新策略具有重要意義。本文就細胞焦亡及其在腫瘤中的相關(guān)研究進展做一綜述，以期能夠為腫瘤治療提供新思路。

1 細胞焦亡與細胞凋亡的異同

雖然細胞焦亡與細胞凋亡存在一些類似的形態(tài)學(xué)特征，如DNA損傷、核固縮、Tunel和Annexin-V染色陽性等，但是它們之間也存在許多不同。首先，細胞焦亡的DNA損傷形式非常特殊，焦亡細胞雖然經(jīng)歷染色質(zhì)凝結(jié)和DNA斷裂，但它的細胞核仍保持完整，細胞膜上形成眾多1～2 nm的孔隙，使細胞膜失去完整性，破壞了膜兩側(cè)的離子平衡，最終導(dǎo)致細胞膜溶解，釋放出細胞內(nèi)容物。當(dāng)細胞受到內(nèi)源危險信號時,Caspase-1由NLRP1、NLRP3、和Pyrin等典型的炎性小體激活,一方面,通過切割Gasdermin家族蛋白使其N-、C-兩端的結(jié)構(gòu)域分開,進而釋放N-端的片段在膜上寡聚化穿孔,導(dǎo)致細胞滲透壓變化、胞膜破裂和內(nèi)容物釋放,發(fā)生焦亡并啟動炎癥反應(yīng)的發(fā)生;另一方面,Caspase-1切割pro-IL-1β和pro-IL-18,形成IL-1β和IL-18釋放到胞外，誘發(fā)劇烈的炎癥反應(yīng)。而在細胞凋亡中DNA的損傷依賴于caspase-3 激活的DNA酶—CAD(caspase-activated DNase)與其抑制劑ICAD的結(jié)合，這在細胞焦亡中是不需要的，直接通過Caspase-1即可裂解CAD。近期有研究報道,凋亡過程中Caspase介導(dǎo)質(zhì)膜上的pannexin-1通道的開放會釋放一些代謝產(chǎn)物，Caspase也能抑制炎性蛋白質(zhì)的翻譯和一些炎性因子的分泌,從而抑制炎癥反應(yīng)，并促進傷口愈合[3]。但是在某些情況下,凋亡過程中,會伴隨炎性因子的釋放,從而引發(fā)機體炎癥發(fā)生，這類炎癥反應(yīng)通常并不劇烈[4]。Caspase作為一組在胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，廣泛參與了細胞的生長、分化調(diào)節(jié)。其既能介導(dǎo)細胞凋亡，又能介導(dǎo)細胞焦亡。研究表明細胞凋亡依賴caspase-6/7介導(dǎo)，而細胞焦亡則依賴caspase-1/4/5(人體內(nèi))和caspase-11(小鼠體內(nèi))介導(dǎo)。此外，細胞凋亡受ATP水平的影響，DNA修復(fù)酶(Poly ADP-ribose polymerase，PARP)可被DNA損傷激活，引發(fā)ATP的消耗。在細胞凋亡過程中可以通過抑制caspase-1影響PARP，以調(diào)控ATP水平，但細胞焦亡不受PARP激活調(diào)控[5]。

2 細胞焦亡的相關(guān)分子機制

細胞焦亡是程序性細胞死亡的一種炎癥形式，由gasdermin蛋白家族所介導(dǎo)，目前在人類中有6個同源基因即GSDMA，GSDMB，GSDMA，GSDMD，GSDME(也被稱為DFNA5)和PJVK(也被稱為DFNB59)，被caspase-1/4/5/11激活并并切割。以GSDMD為例，其可被可被成兩部分：位于N端的GSDMD-N和C端的GSDMD-C。GSDMD-N與細胞膜上的磷脂酰肌醇、磷脂酸和磷脂酰絲氨酸連接，從而觸發(fā)聚集，導(dǎo)致孔隙的形成[6-7]。據(jù)報道，孔隙的內(nèi)徑約為15 nm，外徑約為32 nm，而IL-18的直徑約為4.5 nm，因此其可以順利通過這些孔隙[8]。這些孔隙導(dǎo)致細胞膜兩側(cè)離子濃度平衡性被打破，細胞腫脹，質(zhì)膜溶解，染色質(zhì)碎裂和細胞內(nèi)促炎成分的釋放后導(dǎo)致死亡，即發(fā)生焦亡。目前，研究較多的是依賴caspase-1的經(jīng)典通路和依賴caspase-4/5/11的非經(jīng)典通路。

2.1 依賴caspase-1的經(jīng)典通路在依賴caspase-1的經(jīng)典通路中，炎性小體通過模式識別受體(Pattern recognition receptors，PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)并激活caspase-1。經(jīng)典的炎性小體包括NLRP1/3，NLRC4和AIM2，它們都具有位于N端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域(PYD)或位于C端的半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域(CARD)。凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)利用PYD和CARD結(jié)構(gòu)域同源蛋白相互作用來招募NOD樣受體(NOD-like receptors，NLRs)和pro-caspase-1，從而組裝成炎性小體。ASC在這個過程中聚集形成大分子二聚體—ASC斑點(ASC-speck)，ASC斑點招募pro-caspase-1并激活caspase-1，活化的caspase-1切割焦亡執(zhí)行蛋白GSDMD，切割產(chǎn)生的GSDMD-N在細胞膜上打孔形成非選擇性通道，破壞細胞膜兩側(cè)離子的平衡，導(dǎo)致細胞腫脹、裂解并最終死亡。此外，活化的caspase-1也可切割和加工pro-IL-18和pro-IL-1β(IL-18和IL-1β的前體)，將成熟體IL-18和IL-1β分泌至細胞外，介導(dǎo)炎癥性死亡即細胞焦亡。有研究表明，GSDMD也可影響成熟的IL1β的分泌。

2.2 依賴caspase-4/5/11的非經(jīng)典通路在非經(jīng)典通路中，作為革蘭陰性菌的細胞壁成分的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是激活 caspase-4/5/11非經(jīng)典通路的關(guān)鍵，被激活的caspase-11(小鼠體內(nèi))/ caspase-4/5(人體內(nèi))可通過裂解GSDMD形成GSDMD-N在細胞膜上打孔形成非選擇性通道，導(dǎo)致細胞焦亡。隨著研究的深入，有報道發(fā)現(xiàn)活化的 caspase-4/5/11 也可通過活化 Pannexin-1 等通道來調(diào)控炎性介質(zhì)分泌至細胞外。

2.3 執(zhí)行蛋白及caspase-3/8介導(dǎo)的通路Caspase-3則長期以來一直被認為是細胞凋亡的重要標(biāo)志。然而最近，Wang等發(fā)現(xiàn)caspase-3可以影響和激活GSDME促進焦亡的發(fā)生。在GSDME高表達的腫瘤細胞系中，化療藥物可誘導(dǎo)caspase-3活化并裂解GSDME，產(chǎn)生的GSDME-N可在細胞膜上打孔引起腫瘤細胞焦亡[5]。Sarhan等研究報道了致病性耶爾森氏菌通過效應(yīng)因子YopJ抑制TAK1的過程中caspase-8可切割GSDMD(鼠巨噬細胞中為GSDME)，介導(dǎo)了細胞焦亡發(fā)生[9]。

2.4 絲氨酸蛋白酶GZMA介導(dǎo)的通路最近，紹峰課題組首次發(fā)現(xiàn)gasdermin可在非Asp位點經(jīng)絲氨酸蛋白酶GZMA水解執(zhí)行打孔功能，并將經(jīng)細胞毒性淋巴細胞誘導(dǎo)的細胞死亡證明為焦亡，這項發(fā)現(xiàn)改寫了焦亡只能經(jīng)Caspase活化的定論。細胞毒性淋巴細胞(如CTLs，NK細胞等)中的絲氨酸蛋白酶Granzyme A可以經(jīng)穿孔素(perforin)進入靶細胞，通過水解Gasdermin B(GSDMB)分子Lys229/Lys244位點誘導(dǎo)靶細胞發(fā)生焦亡。GSDMB存在組織特異性表達，并在消化系統(tǒng)上皮細胞源腫瘤細胞中呈高表達，而通過GSDMB誘導(dǎo)焦亡將增強抗腫瘤免疫，將成為這些腫瘤治療潛在靶點[10]。

3 細胞焦亡在腫瘤中的相關(guān)研究進展

3.1 胃癌及食管癌研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細胞中的GSDMD表達量較臨近的正常組織細胞少，這可能促進了癌細胞的增殖。Wang等的研究發(fā)現(xiàn)GSDMD通過抑制胃癌(GC)細胞中的ERK1/2、STAT3和PI3K/AKT，從而使得Cyclin A2和Cyclin Dependent Kinase(CDK2)的表達降低。因此GC細胞中GSDMD表達量的減低，使得Cyclin/CDK復(fù)合物作為調(diào)控細胞周期的物質(zhì)表達增加，促進S期向G2期過渡，加速GC細胞增殖[11]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)GSDME也是Gasdermin超家族成員之一，化療作用時與GSDMD具有相同的孔隙形成作用的GSDME可被caspase-3激活。Yin B等研究報道，用5-氟尿嘧啶(5-FU)處理GC細胞(SGC-7901和MKN-45)，發(fā)現(xiàn)細胞活力明顯下降。5-FU處理后的細胞膜上有大的氣泡吹出，caspase-3激活使GSDME裂解，GC細胞發(fā)生焦亡[12]。細胞焦亡在食管癌中也有報道。Wang,F.等報道了酒精誘發(fā)食管炎并通過細胞焦亡參與了食管癌的發(fā)生和發(fā)展，進一步研究發(fā)現(xiàn)caspase-1的抑制劑Ac-YVAD-CMK在體內(nèi)和體外均可有效抑制IL-1β和IL-18的表達，減少炎癥反應(yīng)，有望成為抑制食管炎向食管癌進展的藥物[13]。最近Wu,M.等的一項研究表明GSDME在食管癌細胞中的表達高于正常細胞，GSDME高表達和焦亡發(fā)生相關(guān)[14]。研究中PLK1抑制劑BI2536通過誘導(dǎo)膿毒癥，增加了食管鱗狀細胞癌(ESCC)細胞對順鉑(DDP)的敏感性。低劑量的BI2536與DDP結(jié)合后，激活了細胞凋亡相關(guān)蛋白BAX和caspase-3，導(dǎo)致GSDME的裂解，增加了DNA損傷，誘導(dǎo)焦亡。

3.2 結(jié)直腸癌結(jié)直腸癌方面，Derangere,V.等首次報道了在LXR激動劑的介導(dǎo)下，LXRβ能與pannexin-1結(jié)合并觸發(fā)其開放，導(dǎo)致ATP的分泌。細胞外的ATP可聚集炎性小體NLRP3，隨后通過P2X7受體(一種ATP門控離子通道)途徑激活caspase-1，導(dǎo)致結(jié)腸癌細胞發(fā)生焦亡。Ma,Y.等前期研究表明LncRNA RP1-85F18.6在結(jié)直腸癌中高表達，可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控ΔNp63(其作用與p53相反)，從而參與了結(jié)直腸癌細胞的增殖、侵襲、存活、轉(zhuǎn)移過程，包括抑制腫瘤細胞的凋亡。值得注意的是，LncRNA RP1-85F18.6還參與了結(jié)直腸癌細胞的焦亡過程。LncRNA RP1-85F18.6下調(diào)通過沉默ΔNp63以及裂解GSDMD，誘導(dǎo)CRC細胞的焦亡發(fā)生。最近，Yu J.等研究發(fā)現(xiàn)洛鉑可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞激活caspase-3/9，通過GSDME介導(dǎo)的ROS/JNK/Bax-線粒體凋亡途徑使細胞發(fā)生焦亡。在洛鉑誘導(dǎo)激活HT-29和HCT116結(jié)腸癌細胞中的caspase-3/9后，GSDME被裂解，誘導(dǎo)活性氧物種(ROS)升高和JNK磷酸化。激活的JNK將Bax招募到線粒體，從而刺激細胞色素c釋放到細胞質(zhì)，使腫瘤細胞發(fā)生焦亡。進一步研究洛鉑通過這種途徑殺死腫瘤細胞的機制，可能對化療藥物的臨床應(yīng)用具有重要意義[15]。

3.3 肝癌Chu,Q.等研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系 Bel-7402 和 HepG2 中caspase-1的表達顯著低于正常肝細胞系HL-7702。進一步研究發(fā)現(xiàn)焦亡通路激活對肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲具有抑制作用，而Ac-YVAD-CMK(caspase-1抑制劑)可削弱該作用。同時發(fā)現(xiàn)小檗堿(一種黃連中提取的生物堿)可以通過上調(diào)caspase-1，促進IL-1β表達，進而抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲。Wei,Q.等報道了雌二醇(E2)誘導(dǎo)的NLRP3炎性體激活可能在HCC進展中起到抑制作用，可能的機制是觸發(fā)細胞焦亡并抑制保護性的細胞自噬發(fā)生。E2誘導(dǎo)的NLRP3炎性體激活通過E2/ERβ/AMPK/mTOR通路觸發(fā)細胞焦亡從而在HCC進展中起到抑制作用。3-甲基腺嘌呤(3-MA)可明顯增強E2誘導(dǎo)的細胞焦亡現(xiàn)象在，而在Ac-YVAD-CMK治療下焦亡則被抑制，這表明caspase-1依賴性細胞焦亡受自噬的負調(diào)控[16]。

3.4 肺癌焦亡在肺癌的研究中，Gao等研究發(fā)現(xiàn)GSDMD在非小細胞肺癌(NSCLC)中相較癌旁正常組織高表達，研究表明敲除GSDMD在NSCLC細胞系和異種移植小鼠模型中能抑制腫瘤的生長，通過促進細胞焦亡向凋亡轉(zhuǎn)化和抑制非小細胞肺癌NSCLC中的EGFR / Akt信號傳導(dǎo)而減弱了腫瘤的增殖[17]。Wang等研究報道，抗高脂血癥藥物辛伐他汀可在NSCLC細胞系和異種移植小鼠模型中通過激活NLRP3來誘導(dǎo)細胞焦亡，從而抑制了腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移。此項研究表明，辛伐他汀有可能成為一種新型治療NSCLC的藥物，有較大的應(yīng)用前景。

3.5 胰腺癌胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)是一種預(yù)后極差的疾病，其發(fā)病率逐年上升，目前胰腺癌中的焦亡研究較少 。Cui,J.等報道了哺乳動物STE20樣激酶1(MST1)在PDAC中的表達量較低，同時MST1的表達促進了PDAC細胞死亡，并通過caspase-1誘導(dǎo)的細胞焦亡抑制PDAC的增殖、遷移、侵襲。而ROS抑制劑(N-acetyl-cysteine)可抑制MST1 激活caspase-1，以及減弱MST1對PDAC細胞死亡、增殖、遷移和侵襲的影響。研究表明MST1將是一個潛在的預(yù)后和治療PDAC的靶點，對胰腺癌的治療具有重要意義[18]。

3.6 乳腺癌乳腺癌的焦亡研究中，Omega-3脂肪酸可以調(diào)節(jié)炎癥并發(fā)揮抗癌作用，促進癌細胞死亡。二十二碳六烯酸(DHA)是一種具有抗腫瘤作用的Omega-3脂肪酸。Pizato等研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DHA處理的乳腺癌細胞與未處理的細胞相比，DHA處理的乳腺癌細胞caspase-1被激活，gasdermin D被裂解，IL-1β分泌增強，高遷移率族蛋白B1(HMGB1)向細胞質(zhì)轉(zhuǎn)運，膜孔形成，證明DHA可以誘導(dǎo)乳腺癌細胞發(fā)生細胞焦亡。另外，Draganov等報道了伊維菌素通過介導(dǎo)P2X4/P2X7-門控的Pannexin-1通道調(diào)節(jié)細胞外ATP和HMGB1的敏感性，激活caspase-1誘導(dǎo)細胞凋亡和焦亡。Kolb等發(fā)現(xiàn)NLRC4炎癥小體在肥胖乳腺癌患者的乳腺癌組織中相對過表達，肥胖的乳腺癌小鼠模型的腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)腫瘤浸潤性髓樣細胞增加，激活NLRC4炎性小體，進而激活I(lǐng)L-1β，誘導(dǎo)細胞焦亡，并通過脂肪細胞介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)表達和新生血管生成，從而促進乳腺癌的進展[19]。

3.7 宮頸癌So等報道，與正常宮頸癌細胞相比，SIRT1在HPV感染的宮頸癌細胞中的表達量更高，且促進癌細胞的生長和增殖。SIRT1在宮頸癌細胞中的表達通過干擾黑素瘤缺乏因子2(AIM2)基因轉(zhuǎn)錄因子RelB的mRNA，抑制了NF-κB誘導(dǎo)的AIM2基因的轉(zhuǎn)錄。然而，敲除SIRT1可上調(diào)AIM2炎性小體相關(guān)基因，增強RelB的穩(wěn)定性，從而介導(dǎo)了AIM2炎性小體依賴性細胞焦亡發(fā)生[20]。另外也有文獻報道，AIM2作為一種受體識別細胞膜雙鏈脫氧核糖核酸(dsDNA)，具有包括HPV在內(nèi)的細胞膜dsDNA的功能，能與ASC形成大分子復(fù)合物，激活caspase-1介導(dǎo)的細胞焦亡，這在結(jié)腸癌中也有類似的報道。由此可見，AIM2可能在宮頸癌等腫瘤中起潛在的治療靶標(biāo)作用。

4 展望

越來越多的研究關(guān)注于腫瘤中的焦亡現(xiàn)象，目前研究主要集中在激活NLRP1/3、NLRC4和AIM2等炎性小體并促進細胞焦亡的化合物或分子，它們有希望成為治療腫瘤的新藥物。然而，我們對這些分子如何影響腫瘤細胞焦亡的機制通路還沒有完全了解。未來朝著闡明焦亡的發(fā)生機制研究，將有助于我們提高對腫瘤細胞焦亡的理解，有助于開發(fā)出基于細胞焦亡的抗腫瘤藥物。同時也需要更多的臨床試驗來驗證焦亡在腫瘤治療中的價值。