間充質(zhì)干細(xì)胞深低溫保藏技術(shù)體系的建立與初步分析

朱志浩，高家明，沈君顏，祝建波，劉海亮,*

(1 新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2 同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院/附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學(xué)研究所，上海 200123)

間充質(zhì)干細(xì)胞的組織來(lái)源骨髓基質(zhì)細(xì)胞最初在骨髓基質(zhì)中被發(fā)現(xiàn)后，間充質(zhì)干細(xì)胞已經(jīng)從幾個(gè)成人和胎兒組織中分離和鑒定，包括脂肪，真皮(皮膚)，滑膜液，骨膜，臍帶血，胎盤(pán)和羊水。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)給生命科學(xué)帶來(lái)劃時(shí)代的改變，充分利用脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分化潛能在臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用，治愈重大疾病，如腦血栓、心肌梗死、糖尿病等。它可以分化成這些壞死的細(xì)胞，進(jìn)入這些器官，行使和死亡細(xì)胞一樣的功能，徹底治愈這類(lèi)疾[1-4]。并且它也可以分化成這些器官的年輕細(xì)胞，替代器官內(nèi)衰老的細(xì)胞，將分化后的年輕細(xì)胞植入該器官并成活后，進(jìn)而替代功能衰竭或者損毀的器官，如腎損傷，肝壞死，心臟的衰竭，從而延緩衰老。

干細(xì)胞凍存是研究干細(xì)胞生物學(xué)功能的重要方法之一，凍存劑的選擇起到了關(guān)鍵性的作用。目前細(xì)胞凍存劑主要有兩種類(lèi)型：一種是滲透性保護(hù)劑包括：甘油、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(GLY)。其原理屬低分子中性物質(zhì)，易與溶液中水分子結(jié)合，易于穿透細(xì)胞；另一種是非滲透性保護(hù)劑：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。其原理屬大分子物質(zhì)，不能穿透細(xì)胞；在冰晶形成之前，優(yōu)先結(jié)合溶液中水分子；降低細(xì)胞外溶液的電解質(zhì)濃度，減少陽(yáng)離子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量。已有較多研究對(duì)多種凍存劑進(jìn)行了分析，雖然DMSO在毒性方面要大于EG，PG，GLY，但是其凍存效果仍然較好。DMSO與PVP凍存效果相似。近年來(lái)，相對(duì)于傳統(tǒng)的凍存劑(DMSO，GLY，Tre)，左旋肉堿(L-carnitine)、海藻糖(Trehalose)也顯示出比較好的凍存效果，在細(xì)胞毒性方面，也顯示出較大的優(yōu)勢(shì)[5-8]。

目前，在干細(xì)胞廣泛研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)上，建立臨床級(jí)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)制備工藝技術(shù)和干細(xì)胞庫(kù)就顯得尤為重要。臨床級(jí)干細(xì)胞，就再生醫(yī)學(xué)而言，可以隨時(shí)投入臨床使用的干細(xì)胞，即可用于人類(lèi)的臨床研究，制備標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，具有“臨床級(jí)”質(zhì)量，不需要昂貴而又危險(xiǎn)的轉(zhuǎn)換過(guò)程。臨床級(jí)干細(xì)胞的提供途徑消除了基于細(xì)胞的療法發(fā)展的重大障礙，而且臨床級(jí)干細(xì)胞的分離與擴(kuò)增是干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)化過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)。標(biāo)準(zhǔn)化，產(chǎn)業(yè)化的干細(xì)胞生產(chǎn)，這意味著每批細(xì)胞都符合臨床使用所需的質(zhì)量和安全標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)化能更快地為患者提供救生療法[9-12]。因此，開(kāi)發(fā)標(biāo)準(zhǔn)性干細(xì)胞分離純化和保藏的新技術(shù)是進(jìn)一步推動(dòng)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的必然趨勢(shì)。從而更能實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)?；\(yùn)行，質(zhì)量達(dá)到臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)過(guò)綜合分析，本研究重點(diǎn)分析DMSO、 L-carnitine和Trehalose這3種凍存劑凍存脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的效果與能力。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12(Thermo)，NEAA (non-essential amino acids)，胎牛血清(FBS)，0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Sigma公司)，海藻糖(上海國(guó)藥)，肉毒堿(美國(guó)AMRESCO公司)，地塞米松(Sigma公司)，維生素C(Sigma 公司)，硫代甘油(Sigma 公司)，成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基(CYAGEN)，CCK-8試劑，油紅O染液，脂肪干細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞，293細(xì)胞。

細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus)，超凈工作臺(tái)(Forma Scientific Inc)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)，低溫離心機(jī)(Heraeus儀器公司)，-80 ℃冰箱(Forma Scientific 公司)，液氮罐，流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckmen Coulter 公司)，酶標(biāo)儀。細(xì)胞培養(yǎng)瓶(美國(guó)Corning)：T25，T75；細(xì)胞培養(yǎng)板(美國(guó) Corning)：6，12，24孔；細(xì)胞培養(yǎng)皿：10 cm2；移液管(美國(guó)Forma)：5 mL，10 mL；離心管：15 mL；凍存管：1.8 mL；酶標(biāo)板：平底96孔透明酶標(biāo)板。

1.2 細(xì)胞凍存

配制各種細(xì)胞凍存液。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)基，用PBS清洗。去除PBS，加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái)。1 500 r·min-1，離心5 min。去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打混勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度[13-15]。一般為5×106或1×107個(gè)·mL-1。將細(xì)胞分裝于凍存管中，每管1 mL。在凍存管管中標(biāo)明細(xì)胞的名稱(chēng)，凍存時(shí)間及操作者。也可將凍存管放入4 ℃，2h，-80 ℃，過(guò)夜，放入液氮中。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇

從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37 ℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。從37 ℃水浴鍋中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。離心，1 500 r·min-1，離心5 min。棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞活性檢測(cè)

細(xì)胞活力測(cè)定，對(duì)凍存1、3、7 d的ADSC，在復(fù)蘇后24 h和48 h進(jìn)行細(xì)胞活性檢測(cè)，分析不同凍存劑凍存時(shí)間長(zhǎng)短和復(fù)蘇后不同時(shí)間的細(xì)胞活性。CCK-8檢測(cè)步驟。向各孔中加入100 μL細(xì)胞懸液，向各孔中加入各濃度的待測(cè)溶液10 μL，在37 ℃下孵育培養(yǎng)板。向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育1～4 h，測(cè)定450 nm處的OD值。

1.5 細(xì)胞周期檢測(cè)

收集復(fù)蘇后的特定傳代ADSC細(xì)胞，細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×106個(gè)。離心棄上清，加入300 μL預(yù)冷的PBS制成單細(xì)胞懸液。加入700 μL預(yù)冷的無(wú)水乙醇固定，-20 ℃放置待測(cè)。上機(jī)檢測(cè)前加入PBS稀釋細(xì)胞，離心棄上清，加入終濃度500 μg·mL-1的。RnaseA置于37 ℃孵育30 min。加入終濃度50 μg/mL的碘化丙啶，4 ℃避光孵育30 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量，軟件分析。

1.6 成骨誘導(dǎo)

取特定代次生長(zhǎng)良好的ADSC細(xì)胞，胰酶消化，1×105個(gè)·mL-1的濃度接種于6孔板，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基。每3天換一次液，以未加誘導(dǎo)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)孔作空白對(duì)照，共誘導(dǎo)培養(yǎng)基28 d。誘導(dǎo)期間用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，并拍照記錄。取成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)14 d和28 d后的細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色。

1.7 RNA提取及RNA-seq分析

使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從凍存前和凍存后的ADSC細(xì)胞中提取總RNA，并用NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)進(jìn)行定量。將符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(260/280 nm> 1.8)的樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。測(cè)序數(shù)據(jù)分析均基于高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，使用Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)軟件構(gòu)建參考基因組的索引，并使用TopHat v2.0.9(ccb.jhu.edu/software/tophat)軟件將配對(duì)末端的干凈讀數(shù)與參考基因組對(duì)齊?；诨蜷L(zhǎng)度和映射到該基因的讀數(shù)計(jì)數(shù)，并考慮測(cè)序深度和基因長(zhǎng)度對(duì)讀數(shù)計(jì)數(shù)的影響，計(jì)算出每千個(gè)轉(zhuǎn)錄本的讀數(shù)，每個(gè)基因的百萬(wàn)個(gè)圖譜讀數(shù)(RPKM)。差異基因通過(guò)權(quán)重基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析(WGCNA)計(jì)算，畫(huà)圖[16-18]。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)單因素方差分析確定，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞活性檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)采用3種凍存劑，六組實(shí)驗(yàn)；1號(hào)，5% DMSO+10% FBS；2號(hào)，5% DMSO；3號(hào)，5% Trehalose+10%FBS；4號(hào)，5% Trehalose；5號(hào)，5% L-carnitine+10% FBS；6號(hào)，5% L-carnitine；分別凍存ADSC，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，4號(hào)和6號(hào)凍存ADSC后，細(xì)胞死亡率很大，無(wú)法進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)只對(duì)1號(hào)，2號(hào)，3號(hào)和5號(hào)進(jìn)行。在ADSC凍存1、3、7 d后復(fù)蘇。培養(yǎng)24 h后，檢測(cè)細(xì)胞活性。

結(jié)果如圖1所示：1號(hào)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活性最高，在凍存1、3、7 d復(fù)蘇后，其均值分別為0.413 3、0.265 5和0.218 4，隨著凍存時(shí)間的增加呈現(xiàn)出逐漸下降趨勢(shì)；2號(hào)實(shí)驗(yàn)組在凍存1、3、7 d復(fù)蘇后其細(xì)胞活性均值分別為0.152 9、0.201 6和0.283 1，并隨時(shí)間表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)；在3號(hào)實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞凍存1 d和3 d后細(xì)胞活性并沒(méi)有表現(xiàn)出很大差別，而在凍存7 d復(fù)蘇后細(xì)胞活性略有上升；5號(hào)實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞活性雖時(shí)間表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，在凍存1 d復(fù)蘇后，其細(xì)胞活性為0.153 9，凍存3 d復(fù)蘇后，細(xì)胞活性為0.167 7，凍存7 d后為0.148 7。

總體變化不大。復(fù)蘇后培養(yǎng)48 h細(xì)胞活性與24 h具有相似的特點(diǎn)(圖1)。

以上結(jié)果表明，1號(hào)實(shí)驗(yàn)組在細(xì)胞凍存復(fù)蘇24 h后具有最高活性，說(shuō)明1號(hào)實(shí)驗(yàn)組為該實(shí)驗(yàn)條件下的最佳凍存劑組合。與1號(hào)實(shí)驗(yàn)組相比，2號(hào)實(shí)驗(yàn)組ADSC細(xì)胞在凍存1 d和3 d，復(fù)蘇后其活性顯著的低于1號(hào)實(shí)驗(yàn)組。當(dāng)凍存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d時(shí)，2號(hào)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞活性顯著上升且明顯高于1號(hào)實(shí)驗(yàn)組，這一現(xiàn)象表明在進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的凍存時(shí)，F(xiàn)BS可能會(huì)對(duì)細(xì)胞活性產(chǎn)生一定的影響。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞凍存過(guò)程中，F(xiàn)BS在對(duì)細(xì)胞活性的保護(hù)中起到了關(guān)鍵性作用。FBS是細(xì)胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細(xì)胞生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)成分。提供結(jié)合蛋白，能識(shí)別維生素，脂類(lèi)，金屬和其他激素等，能結(jié)合或調(diào)變他們所結(jié)合的物質(zhì)活力。但其具體的影響機(jī)制仍需進(jìn)行進(jìn)一步的探究。

3號(hào)實(shí)驗(yàn)組和5號(hào)實(shí)驗(yàn)組與1號(hào)實(shí)驗(yàn)組相比，其細(xì)胞活性要明顯低于1號(hào)實(shí)驗(yàn)組。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DMSO在細(xì)胞凍存過(guò)程中對(duì)細(xì)胞活性的影響要略低于Trehalos和L-carnitine，DMSO更適合作為ADSC細(xì)胞凍存劑在實(shí)驗(yàn)中使用。綜上，5%DMSO+10%FBS為當(dāng)前實(shí)驗(yàn)條件下最適的凍存劑組合。在同樣的低溫，DMSO條件下，F(xiàn)BS對(duì)維持ADSC存活起到了關(guān)鍵性作用。

2.2 細(xì)胞周期檢測(cè)

當(dāng)凍存劑組合1號(hào)為5% DMSO+10% FBS時(shí)，對(duì)凍存1、3、7 d后復(fù)蘇的ADSC進(jìn)行流式細(xì)胞分析，結(jié)果如圖2所示，G1期細(xì)胞所占比例由凍存1 d的79.85%，到3 d的 75.74%,再到7 d的89.88%。G1含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。

S期，1 d，11.15%,3 d，17.24%，7 d，3.35%。隨凍存天數(shù)的增加，S期總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)凍存劑為2號(hào)5% DMSO時(shí)，對(duì)凍存1、3、及7 d后復(fù)蘇的ADSC進(jìn)行流式細(xì)胞分析，結(jié)果如圖2所示，G1期細(xì)胞所占比例，1 d，65.78%，3 d，66. 15%，7 d，89.94%。G1期細(xì)胞所占比例，隨凍存天數(shù)增加，呈上升趨勢(shì)。S期細(xì)胞所占比例，1 d，27.38%，3 d，26.34%，7 d，2.9%,S期含量呈下降。

以上結(jié)果表明，DMSO試劑對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用，低溫抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。綜上，1號(hào)實(shí)驗(yàn)組與2號(hào)實(shí)驗(yàn)組相比，尤其是凍存1 d和3d后，S期，1號(hào)數(shù)據(jù)小于2號(hào)。分別為10.58%和18.87%。

說(shuō)明在有FBS情況下，凍存1～3 d，確實(shí)影響了ADSC細(xì)胞的增值效率。但是凍存7 d后，幾乎沒(méi)有差別。

圖2 不同凍存劑凍存ADSC 1、3、 7 d復(fù)蘇后細(xì)胞周期檢測(cè)

當(dāng)凍存劑為5% Trehalos+10% FBS，對(duì)凍存1、3、7 d后復(fù)蘇的ADSC進(jìn)行流式分析(圖3)。在凍存1、3、7 d后，G1含量分別為80.73%，85.58%，93.15%。隨凍存天數(shù)的增加，G1含量總體呈上升趨勢(shì)。在凍存1、3、7 d后，S期含量分別為9.93%，11.85%，2.17%。隨凍存天數(shù)的增加，S期含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。當(dāng)凍存劑為5% L-carnitine+10% FBS時(shí)。凍存1、3、7 d后復(fù)蘇，流式細(xì)胞分析結(jié)果見(jiàn)圖4。凍存1、3、7 d后，G1含量分別為91.55%，78.54%，88.57%。隨凍存天數(shù)的增加，G1含量總體呈下降趨勢(shì)(圖4)。在凍存1、3、7 d后，S期含量分別為5.09%，17.74%，3%。隨凍存天數(shù)的增加，S期含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)。

從細(xì)胞周期來(lái)看，短期(1 d～3 d凍存)，不同凍存劑確實(shí)可以引起細(xì)胞周期的改變，尤其是對(duì)于細(xì)胞增殖來(lái)說(shuō)，但是如果凍存時(shí)間較長(zhǎng)(如7 d)就會(huì)大大縮小這個(gè)差距，凍存劑之間差別不明顯。并且我們可以看到，凍存劑中包含F(xiàn)BS一定程度上會(huì)影響ADSC的增殖(圖2)。

2.3 成骨誘導(dǎo)分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證凍存是否會(huì)對(duì)ADSC的分化潛能有影響，我們進(jìn)一步選擇1號(hào)和2號(hào)凍存劑進(jìn)行ADSC成骨分化，分別凍存1 d和5d后復(fù)蘇進(jìn)行成骨誘導(dǎo)。

從誘導(dǎo)的顏色來(lái)看，紅色較深，誘導(dǎo)成骨效果較好。1號(hào)凍存劑，凍存1 d后，復(fù)蘇細(xì)胞誘導(dǎo)成骨細(xì)胞較多，出現(xiàn)大量紅色聚集斑塊。凍存5 d后，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞也較多，兩者效果差別不明顯(圖3A、3B)。而使用2號(hào)凍存劑，可以明顯看到，不管是凍存1 d還是5 d，成骨分化的效果較1號(hào)凍存劑誘導(dǎo)效果要弱(圖3C、3D)。因此，在同樣的低溫，DMSO條件下，F(xiàn)BS對(duì)維持ADSC的分化潛能起到非常關(guān)鍵的作用。

A：1號(hào)凍存劑，凍存ADSC 1 d 成骨分化；B：1號(hào)凍存劑， 凍存ADSC 5 d成骨分化；C：2號(hào)凍存劑，凍存ADSC 1 d成骨分化； D：2號(hào)凍存劑，凍存ADSC 5 d成骨分化；成骨分化圖片(50 μm)。圖3 1號(hào)和2號(hào)凍存劑凍存ADSC1d和5 d后復(fù)蘇， 誘導(dǎo)成骨分化檢測(cè)

2.4 RNA-seq表達(dá)譜分析

為了驗(yàn)證凍存劑在凍存過(guò)程中對(duì)細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的影響，我們又選擇以1號(hào)凍存劑：5% DMSO+10% FBS，分別對(duì)凍存前和凍存后的ADSC細(xì)胞進(jìn)行了RNA-seq表達(dá)譜結(jié)合生物信息WGCNA分析，結(jié)果表明，在凍存過(guò)程中，凍存劑的存在會(huì)對(duì)細(xì)胞的整體表達(dá)譜會(huì)產(chǎn)生一定的影響(圖4)。但是這個(gè)影響是因?yàn)閮龃娈a(chǎn)生的還是因?yàn)閮龃鎰┑挠绊懏a(chǎn)生的，還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

總之，這在一定程度上說(shuō)明，如果是要通過(guò)表達(dá)譜確定ADSC的相關(guān)參數(shù)，一定要選取相同條件的細(xì)胞，更為可靠的最好是復(fù)蘇后培養(yǎng)一段時(shí)間再進(jìn)行檢測(cè)。

ME：Module Eigengenes (基因簇特征向量矩陣)，縱向不同顏色 代表不同的共表達(dá)基因簇。圖4 RNA-seq表達(dá)譜分析1號(hào)凍存劑凍存 ADSC前后基因表達(dá)水平

2.4.1 樣品間維恩圖分析

凍存前有811個(gè)特異性表達(dá)基因，而凍存后有590個(gè)特異性表達(dá)基因，兩者共有基因數(shù)目為15 287(圖5)。共有基因數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于凍存前后的特異性基因數(shù)目，說(shuō)明細(xì)胞凍存雖然對(duì)脂肪干細(xì)胞的整體活性具有一定的影響，然而這種影響相對(duì)比較小。

圖5 樣品間維恩圖分析

2.4.2 DEG層次聚類(lèi)分析

根據(jù)各個(gè)樣品基因表達(dá)水平，我們檢測(cè)樣品之間的差異表達(dá)基因(DEG)，使用 DEseq2和 PossionDis 方法進(jìn)行差異檢測(cè)。根據(jù)需求，我們對(duì) DEG 進(jìn)行層次聚類(lèi) (圖6)。該圖直觀地反映了差異基因上下調(diào)的聚類(lèi)情況，同時(shí)適用于不同差異方案間DEG差異倍數(shù)的比較。

X軸代表進(jìn)行聚類(lèi)分析的差異比對(duì)，Y軸代表差異基因。 顏色代表log2轉(zhuǎn)換過(guò)的差異倍數(shù)， (顏色越紅代表上調(diào)倍數(shù)越大，越藍(lán)代表下調(diào)倍數(shù)越大)。圖6 DEG層次聚類(lèi)熱圖

2.4.3 差異表達(dá)基因GO功能分析

通過(guò)GO富集性分析，低溫凍存對(duì)細(xì)胞代謝和調(diào)控影響最大 (圖7)。整體上，細(xì)胞凍存過(guò)程對(duì)脂肪干細(xì)胞的代謝和信號(hào)調(diào)控過(guò)程影響較大。

X軸代表DEG數(shù)目，Y軸代表GO功能分類(lèi)圖7 差異基因GO功能分類(lèi)圖

3 討論

科學(xué)家們開(kāi)始意識(shí)到了許多重大疾病或特殊生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)生機(jī)制都可以從干細(xì)胞角度從新認(rèn)識(shí)，這意味著臨床上的許多疾病的防止研究可以從干細(xì)胞的角度進(jìn)行，也意味著一些新的防止方法和手段的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)從不同凍存劑凍存應(yīng)用更加廣泛的ADSC細(xì)胞后，對(duì)其細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，成骨分化潛能以及基因表達(dá)譜的研究，從一定角度了解了ADSC細(xì)胞對(duì)于不同凍存劑凍存的反應(yīng)，為后面詳細(xì)而細(xì)致的研究奠定了基礎(chǔ)[19-20]。

細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果表明：對(duì)照組細(xì)胞在凍存后的復(fù)蘇效果優(yōu)于實(shí)驗(yàn)組，且不同凍存劑之間的凍存效果也存在一定差異。對(duì)照組(5% DMSO+10% FBS)表現(xiàn)出最好的凍存效果，在進(jìn)行液氮凍存1、3、7 d后，其細(xì)胞在復(fù)蘇24 h后的活性分別為0.413、0.267和0.218，復(fù)蘇48 h后的活性分別為0.532、0.366和0.256，均高于2號(hào)(5% DMSO)、3號(hào)(5% T+10% FBS)和5號(hào)(5% L+10% FBS)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分別在凍存復(fù)蘇后的活性。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明：在進(jìn)行凍存復(fù)蘇之后，處于G1期的細(xì)胞所占比例最大，處于G2期的細(xì)胞所占比例最小。在對(duì)處于S期的細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行短期凍存后(1～3 d)，2號(hào)實(shí)驗(yàn)組中處于S期細(xì)胞所占比例最大，分別為27.38%和26.34%，顯著的高于對(duì)照組11.15%和17.24%。當(dāng)凍存時(shí)間延長(zhǎng)至7 d后，對(duì)照組中處于S期的細(xì)胞所占比對(duì)最大，為3.35%，5號(hào)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組效果相似，但略低于對(duì)照組，為3%。

在培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)液后，會(huì)把間充質(zhì)干細(xì)胞能夠誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞，使用油紅O染液染色，誘導(dǎo)成為成骨細(xì)胞能夠被染成紅色，紅色越深或者越多，表示被誘導(dǎo)的細(xì)胞越多。誘導(dǎo)最多的是凍存劑為5% DMSO+10% FBS下凍存1 d，其次是凍存劑為5% DMSO+10% FBS下凍存5 d，誘導(dǎo)最少的是5% L+10% FBS凍存1 d。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，在經(jīng)過(guò)凍存處理之后，脂肪干細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生變化，說(shuō)明凍存處理確實(shí)會(huì)對(duì)細(xì)胞的基因表達(dá)產(chǎn)生影響。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)不同凍存劑條件下細(xì)胞復(fù)蘇后的生物學(xué)特性，比較了不同凍存劑對(duì)細(xì)胞活性和細(xì)胞周期的影響，并通過(guò)表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析了5% DMSO+10% FBS凍存劑對(duì)脂肪干細(xì)胞基因表達(dá)的影響，深低溫凍存確實(shí)對(duì)脂肪干細(xì)胞的基因表達(dá)差生了影響。為充分利用干細(xì)胞進(jìn)行生物組織構(gòu)建、細(xì)胞移植以及其他方面的研究奠定了一定的基礎(chǔ)。

經(jīng)過(guò)整體性分析，1號(hào)，5% DMSO+10% FBS，為該實(shí)驗(yàn)的最佳凍存劑組合。本實(shí)驗(yàn)雖然嘗試用其它凍存劑來(lái)代替DMSO，但是在相同濃度下，它們并沒(méi)有表現(xiàn)的比DMSO要好，并不能很好的保護(hù)ADSC細(xì)胞，因此，在本實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)缺少組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，是因?yàn)閮龃婧螅?xì)胞就已經(jīng)不能存活或者存活百分比較低，不能進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，后期能否通過(guò)改變濃度或者尋找更安全，更有效的凍存劑還需要驗(yàn)證。