RhoA/ROCK2通路在心臟成纖維細(xì)胞分化中的作用機(jī)制

廖榮恒 祁禛 汪永義

心臟纖維化是一種以肌成纖維細(xì)胞過(guò)度分泌與細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度沉積為特點(diǎn)的病理過(guò)程，急性心肌梗死(AMI)后，心臟成纖維細(xì)胞在以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)為主的細(xì)胞因子作用下分化為肌成纖維細(xì)胞，并分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，使心臟順應(yīng)性下降，影響心臟正常功能[1-2]。心臟成纖維細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)是維持正常心臟結(jié)構(gòu)必不可少的成分，但分化的肌成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力大大提升，從而導(dǎo)致心臟纖維化[3-4]。細(xì)胞外基質(zhì)的特異性構(gòu)成組分是α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)[5]，常作為評(píng)價(jià)細(xì)胞外基質(zhì)生成的標(biāo)準(zhǔn)。其次，心臟成纖維細(xì)胞分化的特征還包括細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng)[6]。

RhoA/ROCK通路由Rho家族小G蛋白最具代表性的亞型RhoA及其下游分子Rho相關(guān)激酶(ROCK)構(gòu)成，廣泛參與如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、遷移、黏附、增殖、細(xì)胞生存與凋亡等細(xì)胞基本功能的調(diào)控[7]。ROCK家族包括2種亞型，即ROCK1與ROCK2，兩者具有高度同源性[8]。作為調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的重要信號(hào)通路，RhoA和ROCK1廣泛參與血管平滑肌增生、心肌肥厚和心肌纖維化等過(guò)程[9-11]。本研究擬探究RhoA/ROCK2通路在AMI后心臟成纖維細(xì)胞分化過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人心臟成纖維細(xì)胞在含5%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)處理前，成纖維細(xì)胞在無(wú)血清DMEM/F12中饑餓6 h,然后用含10 ng/L TGF-β1帶血清DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)。RhoA 小干擾RNA通過(guò)Lipo3000在無(wú)血清DMEM/F-12培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)染8 h，之后換成用含10 ng/L TGF-β1帶血清DMEM/F-12培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)

收集細(xì)胞后于常溫下用lysis buffer裂解15 min，收集裂解液后通過(guò)EZ-press RNA提取試劑盒(EZ-bioscience)提取總RNA并確定樣本濃度,之后通過(guò)HiScript Ⅱ 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Vazyme)合成為cDNA。qRT-PCR采用ChamQ SYBR 綠色熒光染料(Vazyme)與引物混合后在熒光定量熱循環(huán)儀中進(jìn)行反應(yīng)。

1.3 免疫印跡分析(Western blot)

收集細(xì)胞后通過(guò)RIPA在4 ℃條件下對(duì)細(xì)胞樣本進(jìn)行裂解，收集裂解液后15 000 g離心15 min取上清液。測(cè)定蛋白質(zhì)樣本濃度通過(guò)BCA蛋白定量試劑盒(Beyotime)進(jìn)行。等量的蛋白樣本通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜(PVDF膜)上，室溫條件下在5%牛血清白蛋白(Thermofisher)中封閉2 h。封閉結(jié)束的PVDF膜在4 ℃條件下用對(duì)應(yīng)的一抗孵育過(guò)夜，并在室溫條件下用TBST清洗3次。之后在與一抗相同種屬的二抗(Beyotime)中孵育1 h，TBST洗3遍后采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑(Vazyme)顯影，并采用ImageJ 軟件處理圖像數(shù)據(jù)。

1.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞種植于六孔板生長(zhǎng)至90%密度后，用200 μL槍頭在劃痕尺的引導(dǎo)下于，每孔左、中、右分別劃1道劃痕。用PBS洗滌3次后，細(xì)胞在不同的處理組中繼續(xù)培養(yǎng)。相應(yīng)時(shí)間內(nèi)，六孔板在倒置相差顯微鏡下通過(guò)明場(chǎng)觀察并測(cè)量劃痕寬度變化(放大倍數(shù)100倍)。

1.5 Transwell試驗(yàn)

細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同組的處理后，將等量的細(xì)胞懸浮于1.5 mL無(wú)血清培養(yǎng)基中種植于Transwell板(Corning)上腔，在下腔中放入2 mL含25%血清的培養(yǎng)基。經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)后，遷移至腔底的細(xì)胞被固定在4%的甲醛中,用結(jié)晶紫(Beyotime)染色后，在光學(xué)顯微鏡下(放大倍數(shù)100倍)隨機(jī)選取5個(gè)明場(chǎng)視野計(jì)數(shù)發(fā)生遷移的細(xì)胞數(shù)。

1.6 小鼠心肌梗死后纖維化模型建立與免疫組織化學(xué)染色

將12只6～8周健康雄性C57小鼠隨機(jī)分為2組，每組6只。假手術(shù)組于異氟烷麻醉后切開(kāi)氣管，直視下插管機(jī)械通氣。AMI組經(jīng)左胸切口進(jìn)胸后，尋找小鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，結(jié)扎相同位置左前降支，保證梗死面積約60%。術(shù)后于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)21 d，處死后取出小鼠心臟，結(jié)扎點(diǎn)以下石蠟包埋切片，予以對(duì)應(yīng)抗體染色后，樹(shù)脂封片于顯微鏡下明場(chǎng)觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Graphpad 7.0軟件進(jìn)行作圖及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組樣本之間比較采用Student′st檢驗(yàn)，多組(n≥3)樣本之間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RhoA、ROCK2在梗死心臟組織中表達(dá)水平增加

小鼠心臟組織切片中，AMI組梗死區(qū)與假手術(shù)組相比，RhoA與ROCK2的表達(dá)均明顯增加(圖1)，心臟組織勻漿中，AMI組較假手術(shù)組α-SMA、RhoA和ROCK2的mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯增加(表1)。

表1 2組小鼠心臟組織RhoA、ROCK2、α-SMA表達(dá)水平比較(n=6)

圖1 假手術(shù)組與AMI 組心臟組織RhoA與ROCK2蛋白表達(dá)

2.2 RhoA與ROCK2在TGF-β1刺激下分化的成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加

TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞，α-SMA表達(dá)隨時(shí)間梯度逐漸增加。4個(gè)時(shí)間點(diǎn)中，RhoA與ROCK2的mRNA與蛋白層表達(dá)水平在48 h之前隨時(shí)間梯度增加，而48 h時(shí)表達(dá)水平相對(duì)24 h時(shí)下降(見(jiàn)表2)。

表2 TGF-β1刺激后成纖維細(xì)胞中RhoA、ROCK2、α-SMA的表達(dá)水平(n=3)

2.3 TGF-β1刺激下分化的成纖維細(xì)胞遷移能力增加

TGF-β1刺激成纖維細(xì)胞后進(jìn)行劃痕試驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量在24 h之前隨時(shí)間而增加(見(jiàn)表3)，細(xì)胞遷移能力增加，且細(xì)胞遷移能力與RhoA、ROCK2變化情況一致。

表3 成纖維細(xì)胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量(n=3)

2.4 TGF-β1通過(guò)RhoA/ROCK2通路增強(qiáng)細(xì)胞遷移以促進(jìn)成纖維細(xì)胞分化

利用RhoA小干擾RNA敲低RhoA表達(dá)后，相對(duì)于TGF-β1+空白小干擾RNA組，TGF-β1+RhoA小干擾RNA組α-SMA、RhoA與ROCK2蛋白表達(dá)水平均下降，而空載小干擾RNA不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見(jiàn)表4)。對(duì)同樣處理的細(xì)胞進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)與Transwell實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于TGF-β1+空白干擾RNA組，TGF-β1+RhoA小干擾RNA組成纖維細(xì)胞劃痕愈合比例與穿膜量均明顯下降(見(jiàn)表5)。

表4 各組成纖維細(xì)胞中α-SMA、RhoA、ROCK2蛋白的表達(dá)水平比較(n=3)

表5 各組成纖維細(xì)胞劃痕愈合比例與穿膜數(shù)量比較(n=3)

3 討論

心臟成纖維細(xì)胞是心臟中最重要的細(xì)胞成分之一，在心臟的結(jié)構(gòu)維持中起著至關(guān)重要的作用[12]。心肌梗死后TGF-β1表達(dá)增加，引起心臟成纖維細(xì)胞過(guò)度激活，造成ECM過(guò)度沉積，導(dǎo)致心功能障礙和心力衰竭[13-15]。現(xiàn)有治療心臟纖維化的藥物由于不良反應(yīng)和未知風(fēng)險(xiǎn)在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此，探索心臟纖維化下游機(jī)制成為解決這個(gè)問(wèn)題的重要方向。本研究結(jié)果提示RhoA/ROCK2通路參與心臟纖維化的過(guò)程，其相關(guān)抑制治療可能是預(yù)防和治療心臟纖維化的一個(gè)新的潛在方向。

RhoA/ROCK1通路作為典型的細(xì)胞遷移信號(hào)通路，廣泛參與細(xì)胞骨架形成、細(xì)胞極化、遷移過(guò)程[16]。作為與ROCK1同源的ROCK2蛋白，其在心臟成纖維細(xì)胞遷移過(guò)程中的作用尚不清楚。在腫瘤治療領(lǐng)域，針對(duì)RhoA/ROCK通路的治療策略已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，臨床應(yīng)用具有一定前景。因此，研究RhoA/ROCK通路參與心臟成纖維細(xì)胞分化的機(jī)制具有一定的臨床價(jià)值。

本研究通過(guò)構(gòu)建小鼠AMI后纖維化模型和人成纖維細(xì)胞系分化模型明確了RhoA、ROCK2在小鼠心臟梗死后纖維化區(qū)域和分化的心臟成纖維細(xì)胞中表達(dá)增加。通過(guò)構(gòu)建小干擾RNA敲低RhoA蛋白表達(dá)，進(jìn)一步明確了RhoA/ROCK2通路與心臟成纖維細(xì)胞遷移的關(guān)系。本研究結(jié)果證實(shí)RhoA/ROCK2通路可通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞分化，在TGF-β1誘導(dǎo)的心臟成纖維細(xì)胞分化過(guò)程中，RhoA/ROCK2通路通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞遷移能力，促進(jìn)心臟成纖維細(xì)胞分化，從而促進(jìn)AMI后心臟纖維化過(guò)程。本研究為通過(guò)干擾RhoA/ROCK2通路改善心肌梗死后心臟纖維化過(guò)程提供了理論依據(jù)。