過表達c-Ski改善心房顫動犬模型心房電重構和結構重構

韓素霞 王娟 高蘇莉 盛樂智 李耀

心房顫動(AF)可引起心房重構。AF與心房結構的進行性改變有關[1-3]；心房間質纖維化、成纖維細胞變性和細胞外基質(ECM)的合成破壞了心房肌細胞間的電生理連接，引起電傳導紊亂[4]。c-Ski是v-Ski癌蛋白的同源蛋白，在包括心臟組織在內的不同組織中廣泛表達[5]。沉默c-Ski可增強轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的心肌細胞H9C2上皮間質轉化[6]。微小RNA(miRNA)-34a/miR-93/c-Ski軸調節(jié)TGF-β1和異丙腎上腺素(ISO)誘導的心臟纖維化[7]。前期研究證實，c-Ski抑制TGF-β1誘導的人心臟成纖維細胞和ECM合成[8]，提示c-Ski在心臟纖維化中發(fā)揮作用，但c-Ski在AF心房重構中的作用尚未報道。本研究在心房起搏犬模型中轉染c-Ski過表達腺病毒載體，分析c-Ski對犬心房起搏誘導的心房重構的影響。

1 材料與方法

1.1 AF犬模型構建及分組

對比格犬行超聲心動圖后構建AF模型。將起搏器固定在比格犬的背部，并通過頸外靜脈連接到右心房的起搏導線上，連續(xù)4周以400次/min的速度進行右心房起搏。心電圖顯示P波消失、基線消失、RR間期絕對不等則提示AF模型構建成功。停心房起搏1周，以確保F波基線狀態(tài)穩(wěn)定。開胸后暴露心臟，剪開心包，將其4角吊起，固定胸壁，建立心包支架，將腺病毒注射到右心房的多個部位后縫合，2周后處死動物。

18只10～12 kg的比格犬隨機分成4組：假手術組(僅植入起搏器，但不起搏，n=3)、AF對照組(僅構建AF模型，n=3)、AF-AdNull組(在AF模型中轉染腺病毒空載體，n=6)和AF-Adc-Ski組(在AF模型中轉染c-Ski過表達腺病毒載體，n=6)。過表達c-Ski的腺病毒載體和對照室載體購自漢恒生物科技有限公司。本研究的動物實驗經(jīng)過上海衛(wèi)生大學附屬上海浦東新區(qū)人民醫(yī)院實驗動物管理委員會批準。

1.2 電生理實驗

電生理實驗室系統(tǒng)在基本起搏周期為300 ms時測定AF模型中起搏器的誘導能力和持續(xù)時間。誘導成功的AF定義為心房程序性刺激后心電圖上P波消失和心房快速活化，心室反應不規(guī)則。對各部位心肌嘗試3次起搏器誘導AF，同時記錄起搏器誘導AF的持續(xù)時間。AF誘導率=誘導AF成功次數(shù)/總誘導次數(shù)。

1.3 蘇木精-伊紅染色檢測心房組織變化

取犬心房組織，在4%多聚甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片厚度為5 μm。二甲苯脫蠟，酒精濃度從高到低進行梯度水化，蘇木精染色和伊紅染色，梯度脫水，透明和封片。在顯微鏡下觀察各組心房組織情況。

1.4 Masson染色檢測心肌纖維化

將犬心房組織石蠟切片脫蠟至水，Masson復合染色液染色，洗去殘余染液。磷鉬酸溶液染色后加入苯胺藍染液復染，分化液分化且重復2次。酒精梯度脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察各組心肌纖維化情況。

1.5 苦味酸-天狼星紅染色檢測膠原纖維

將犬心房組織石蠟切片脫蠟至水，天青石藍染液染色5 min，天狼猩紅-飽和苦味酸染液浸染后，無水乙醇分化，梯度脫水，二甲苯透明后中性樹脂封片。在顯微鏡下觀察各組膠原纖維情況。

1.6 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測c-Ski的mRNA表達水平

用TRIzol試劑(Takara公司)從犬心房組織中提取RNA。采用PrimeScript RT試劑試劑盒(Takara)合成cDNA，采用SYBR預混合Ex TaqⅡ試劑盒(Takara)在MX3005 real-time PCR儀上進行qRT-PCR。每組重復3次，以GAPDH為對照，以2-ΔΔCt法測定c-Ski的mRNA表達水平。

1.7 Western blot法檢測蛋白表達水平

將犬心房組織在裂解液中勻漿，離心純化，分離出總蛋白，采用BCA蛋白試劑盒(碧云天公司)測定蛋白濃度。電泳分離可溶性蛋白，并將其轉移到聚偏二氟乙烯膜上。5%牛奶封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h。采用紅外成像系統(tǒng)掃描儀和ImageJ軟件對目的條帶進行分析。

1.8 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示。統(tǒng)計學分析均采用GraphPad Prism 5.0軟件。兩組間比較采用Student′st檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組電生理學指標比較

采用電生理方法測定快速起搏構建的AF犬模型的AF誘發(fā)率和持續(xù)時間。實驗6周后，AF對照組和AF-AdNull組AF誘導率和持續(xù)時間明顯高于假手術組，而AF-Adc-Ski組誘導率和持續(xù)時間明顯低于AF對照組和AF-AdNull組。見表1。

表1 各組AF誘導率和持續(xù)時間比較

2.2 各組心房病理學特征及c-Ski表達水平比較

HE染色示，假手術組的心房肌細胞間隙適中，纖維排列整齊有序；AF對照組和AF-AdNull組的心肌間質細胞增生，排列不整齊，大小不規(guī)則；AF-Adc-Ski組的心肌間質纖維增生、排列不整齊和大小不規(guī)則的情況較AF對照組和AF-AdNull組改善。見圖1。

圖1 各組心房組織蘇木精-伊紅染色情況

qRT-PCR和Western blot檢測結果表明，AF對照組和AF-AdNull組犬心房組織c-Ski的mRNA和蛋白表達水平均明顯低于假手術組，而AF-Adc-Ski組犬心房組織中c-Ski的mRNA和蛋白表達水平均明顯高于AF對照組和AF-AdNull組(P均<0.05)，見表2、圖2。

表2 各組心房組織c-Ski的mRNA和蛋白表達水平比較

圖2 各組心房組織c-Ski蛋白表達情況

2.3 各組心房纖維化情況比較

Masson染色和苦味酸-天狼星紅染色結果顯示，假手術組僅有極少量心肌間質纖維化，未見纖維組織增生，僅有極少量膠原纖維。AF對照組和AF-AdNull組膠原排列成疏網(wǎng)狀，Ⅲ型膠原比例增加，間質纖維化，且較假手術組更為廣泛；而AF-Adc-Ski組心房組織間質纖維化較AF對照組和AF-AdNull組明顯減輕，見圖3、表3。

圖3 各組心房組織Masson染色、苦味酸-天狼星紅染色情況

Western blot結果顯示，AF對照組和AF-AdNull組心房組織中α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ)的蛋白表達水平明顯高于假手術組，AF-Adc-Ski組心房組織中α-SMA和collagenⅢ的蛋白表達水平明顯低于AF對照組和AF-AdNull組。見表3、圖4。

表3 各組膠原蛋白比例及α-SMA、collagenⅢ的蛋白表達水平比較

圖4 各組心房組織α-SMA 和 collagenⅢ蛋白表達情況

3 討論

AF的發(fā)生和維持與心房重構密切相關[9]。心房纖維化改變心房電傳導和興奮性，為AF的維持提供基礎。Nakashima等[10]發(fā)現(xiàn)心房起搏犬在心臟起搏2周后，心房已經(jīng)進入一種無序的紊亂顫動狀態(tài)，心房內傳導次數(shù)和房顫持續(xù)時間增加，起搏4周后繼續(xù)增加。本研究構建了AF犬模型，電生理實驗結果顯示，過表達c-Ski可以明顯降低快速起搏后AF的誘發(fā)率和持續(xù)時間。Zhao等[11]結果顯示，快速起搏心房2周后，心房出現(xiàn)纖維化，纖維化改變是使AF進展的基本因素，心房纖維化與重構協(xié)同作用導致AF。本研究通過蘇木精-伊紅染色、Masson染色和苦味酸-天狼星紅染色證明過表達c-Ski可以明顯改善快速起搏誘導的心房纖維化。心肌纖維形成的主要特征是ECM的積累和沉積，尤其是膠原蛋白的積累和沉積，ECM蛋白水平的升高可能與AF的發(fā)病密切相關[12]。為了評估c-Ski參與心房結構重構的程度，本研究采用組織病理學和Western blot方法檢測犬心房纖維化程度以及纖維化相關因子α-SMA和collagenⅢ的表達水平。正常心臟的膠原蛋白主要受心臟成纖維細胞調節(jié)。心臟纖維化的特征是膠原、α-SMA、纖維連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白等過度沉積在心臟ECM中，導致心臟收縮期和舒張期功能障礙。本研究結果顯示，過表達c-Ski能夠明顯抑制心房起搏犬α-SMA和collagenⅢ的蛋白表達水平，提示c-Ski可能在AF相關的心房重構中發(fā)揮重要作用，是治療纖維化的潛在靶點。本研究在快速心房起搏誘導的AF犬模型中發(fā)現(xiàn)c-Ski表達下調，過表達c-Ski可降低快速起搏后AF的誘發(fā)率和持續(xù)時間。另外，組織染色顯示c-Ski明顯改善快速起搏誘導的心房纖維化。過表達c-Ski抑制快速心房起搏誘導的AF犬中α-SMA和collagenⅢ的表達水平升高。上述結果提示c-Ski可能在AF引起的纖維化中發(fā)揮作用，是潛在的治療纖維化的靶點。