環(huán)狀RNA在眼部增生性疾病中的研究進展

楊天靜，沈 軼

0引言

非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是一類不參與編碼蛋白質的RNA，此類RNA占據(jù)人類RNA序列的絕大多數(shù)[1]。過去ncRNAs一直被視為轉錄過程中的垃圾分子，但隨著研究的進展和技術的革新，研究人員對ncRNAs的認識逐步深入，發(fā)現(xiàn)此類RNA可以通過參與表觀遺傳水平上的調控來調節(jié)生物體的生長發(fā)育，因此其鑒定與功能也越來越受到廣泛關注。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種在真核生物中廣泛存在的內源性ncRNAs。越來越多的研究表明，circRNA具有重要的生理病理功能，可以參與調節(jié)細胞增殖、分化和凋亡等過程，也可以參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括動脈粥樣硬化、心肌肥厚與心力衰竭等心血管疾病及阿爾茲海默癥[2]、急性髓細胞性白血病[3-4]、骨肉瘤[5-6]、肺癌和結直腸癌[7-9]等。近年研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可通過調節(jié)血管新生等病理過程參與多種眼部增生性疾病的發(fā)生發(fā)展。本文就circRNA的概念、分類、作用機制及其在多種眼部增生性疾病包括增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關性黃斑變性等中的研究進展進行綜述。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的概念Coca-Prados等首次在真核細胞中發(fā)現(xiàn)circRNA[10]。由于其表達豐度較低，既往研究普遍認為circRNA是剪切或錯誤剪切過程的產(chǎn)物[11]。隨著對circRNA分子算法的改進和高通量測序等先進技術的出現(xiàn)，越來越多的研究開始關注circRNA的鑒定及其功能。目前研究認為circRNA在哺乳動物體內廣泛存在，并參與多種生物學功能的調控[12-13]。與線性RNA不同，circRNA通過反向剪切形成單鏈共價閉環(huán)結構，長度為100nt～4kb[14-15]。此類RNA不存在 5’帽子端和3’多聚腺苷酸(Poly A)尾，更易抵抗核酸外切酶的降解作用，因此結構更穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)circRNA的半衰期比其同源線性RNA的半衰期更長[16-18]，可達數(shù)小時至數(shù)天，且在未分化細胞中尤為明顯[19-20]。多數(shù)circRNA具有時空特異性和高度保守性，這些特性和特殊結構也提示了其可能在細胞分化、組織穩(wěn)態(tài)及疾病的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用。

1.2 circRNA的分類盡管多數(shù)circRNA由外顯子組成，但也有部分circRNA來源于內含子、基因間區(qū)、非編碼RNA及其反義非編碼RNA基因座[21]。根據(jù)序列來源的不同可將circRNA分為外顯子環(huán)狀RNA(exonic circular RNA， ecircRNA)、內含子環(huán)狀RNA(intronic circular RNA，ciRNA)以及外顯子和內含子共同來源的環(huán)狀RNA(exonic circular RNA with introns，EIciRNA)。

1.3 circRNA的作用機制

1.3.1 miRNA分子海綿與其他ncRNAs相似，circRNA也含有微小RNA(microRNA，miRNA)結合位點， 許多circRNA含有單個或多個miRNA結合位點，甚至參與調控整個miRNA家族的功能[22]。此類RNA可以作為競爭性內源RNA(ceRNA)，通過“海綿吸附”作用調控miRNA下游靶基因的表達。研究發(fā)現(xiàn)，不是所有circRNA與miRNA的結合均能導致后者活性與功能的抑制，circRNA也有可能充當miRNA的儲存庫，促進miRNA的轉運。CDR1as[23]是最典型的circRNA，具有明顯的組織特異性，主要在人和鼠的腦組織中表達，其含有72個miRNA結合位點。Piewecka等[24]發(fā)現(xiàn)在CDR1as敲除鼠的腦組織中，miR-7的含量明顯下降。而其他研究認為CDR1as與miR-7的表達水平呈負相關[25]，這表明CDR1as對miR-7的調控作用可能與細胞及其所處外環(huán)境有關。

1.3.2調控基因轉錄研究表明，ecircRNA主要位于細胞質中[26]，其在核內剪切后轉運至細胞質，或在細胞分裂過程中從細胞核逃逸。與ecircRNA相比，ciRNA的miRNA結合位點較少且主要位于細胞核內，此類circRNA可與RNA聚合酶Ⅱ結合，從而參與順式轉錄調控[14]。部分EIciRNA除在轉錄位點附近聚集，還可在其他區(qū)域點狀富集，提示EIciRNA可能參與反式調控過程。

1.3.3與RNA結合蛋白相互作用circRNA可以吸附蛋白分子，直接調控蛋白的功能。Ashwal-Fluss等[27]發(fā)現(xiàn)circMbl及其側翼內含子均含有盲肌樣結合蛋白(muscleblind-like protein，MBNL)結合位點，MBNL1可與circMbl蛋白結合，促進后者的生成，因此認為過量的MBNL1可以促進circRNA的生成進而抑制mRNA的生成。此外，前文提到的CDR1as可依賴miR-7與miRNA效應分子Argonaute(AGO)結合，參與基因的調控[23]。

1.3.4作為翻譯模板研究表明，某些circRNA可被核糖體翻譯并編碼蛋白質，但目前此功能只在少數(shù)內源性circRNA得到證實[28-31]，如circZNF609、circMbl、circ-FBXW7、circSHPRH等。多數(shù)circRNA編碼的多肽相關功能仍不清楚，但研究人員認為此類多肽可能充當?shù)鞍鬃凅w，參與調節(jié)其他蛋白復合物的生成過程。

2 circRNA與眼部增生性疾病

2.1 circRNA與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)常發(fā)生于眼外傷及孔源性視網(wǎng)膜脫離，是創(chuàng)傷后視網(wǎng)膜和玻璃體的異常愈合與修復反應。在此過程中，黃斑前膜形成，其收縮引起視網(wǎng)膜牽拉及褶皺，再次引發(fā)視網(wǎng)膜脫離，從而導致患者視功能下降甚至失明。

Yao等[32]通過基因芯片微陣列分析發(fā)現(xiàn)，在30例PVR患者的黃斑前膜樣本中有91種異常表達的circRNA。研究者經(jīng)實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)驗證發(fā)現(xiàn)有8種表達下調和7種表達上調的circRNA，其中circ_0043144的異常表達水平最為明顯。通過建立沉默載體干預人視網(wǎng)膜色素上皮細胞(human retinal pigment epithelial cells，ARPE-19)觀察circRNA功能缺失對細胞功能的影響，結果發(fā)現(xiàn)circ_0043144的表達沉默可減少ARPE-19細胞的增殖和遷移能力，進一步表明circ_0043144的異常表達可能在PVR形成過程中起到關鍵作用。

2.2 circRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，是全球青壯年人群視力喪失的最主要原因[33]。DR的基本病理變化包括血-視網(wǎng)膜屏障破壞、視網(wǎng)膜水腫和出血、繼發(fā)性視網(wǎng)膜新生血管生成等。DR的發(fā)病機制與氧化應激、炎癥等密切相關。近年研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾對DR的發(fā)生有重要影響，ncRNAs作為表觀遺傳的調節(jié)機制之一，也引起研究人員的廣泛關注。

研究發(fā)現(xiàn)，在DR患者的血清樣本中有30種circRNA的表達明顯上調[34]。circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體及視網(wǎng)膜纖維血管增殖膜樣本中均有異常表達，circ_0005015沉默可以明顯抑制人視網(wǎng)膜微血管內皮細胞的出芽、遷移和成管能力[35]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3可以吸附miR-519-3p進而調控基質金屬蛋白酶-2(matrix metallo proteinase-2，MMP-2)、信號轉導及轉錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的表達影響細胞功能。在鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠模型中，circHIPK3沉默可以減輕無細胞毛細血管的形成和血管滲漏等視網(wǎng)膜微血管功能障礙[36]，為circRNA在血管生成和維持內皮細胞功能中的調控作用提供了依據(jù)。在視網(wǎng)膜毛細血管中，周細胞和毛細血管內皮細胞共同參與維持微血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性，兩者由共同的基底膜包繞，周細胞位于毛細血管外周，其丟失為DR最早期的病理改變。Liu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖或高氧脅迫刺激下，cPWWP2A在周細胞內表達明顯上調，而在內皮細胞中的表達水平?jīng)]有明顯變化。沉默該circRNA可以抑制周細胞的增殖、遷移能力，用高糖處理過的周細胞培養(yǎng)液與內皮細胞共培養(yǎng)可使內皮細胞的遷移和成管能力增強，表明周細胞可能通過旁分泌的cPWWP2A調控內皮細胞的功能。在體實驗中，cPWWP2A沉默引起視網(wǎng)膜無細胞血管和血管滲漏增多，炎癥反應增強，且周細胞在視網(wǎng)膜毛細血管系統(tǒng)中的覆蓋率降低。該研究再次證實了內皮細胞與周細胞之間的相互作用關系，并為circRNA對周細胞功能的調控以及其對內皮細胞功能的間接作用提供了新的研究思路。上述研究表明，circRNA參與DR早期及晚期的發(fā)生發(fā)展過程，因此可以作為診斷DR的潛在生物標記物和治療DR的分子靶標。

2.3 circRNA與年齡相關性黃斑變性年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是中老年人群中主要的致盲性眼病之一，隨著人口老齡化加劇，ARMD的患病率呈明顯上升趨勢[38]。ARMD分為萎縮性和滲出性兩種類型，滲出性ARMD的特點為出現(xiàn)新生血管并滲入視網(wǎng)膜色素上皮層下。由于形成的脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)尚不成熟，結構不完整且易滲漏，較易引起視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜下水腫、出血以及一系列瘢痕性改變，因此該型更容易導致嚴重的視力損傷。

Liu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在激光誘導的CNV小鼠模型的脈絡膜組織中，有2種異常高表達和4種異常低表達的circRNA?；虮倔w論(gene ontology，GO)分析顯示，這些circRNA定位于細胞核，參與免疫應答和神經(jīng)傳遞等生物過程，KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析表明信號富集于細胞外基質受體(extracellular matrix receptor，ECM-receptor)相互作用途徑及趨化因子信號通路。這說明CNV的發(fā)生發(fā)展過程與眾多circRNA的異常表達有關，這為滲出性ARMD的相關研究提供了新思路。此外，Zhou等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在激光誘導的CNV小鼠模型的脈絡膜組織中，cZBTB44的表達水平明顯上調，經(jīng)體外實驗證明cZBTB44表達沉默可以降低內皮細胞的活力，減少增殖，降低遷移和成管能力，在低氧脅迫情況下也表現(xiàn)出相同的結果。在體實驗結果表明，在激光誘導的CNV小鼠模型中，沉默cZBTB44的表達可以抑制小鼠CNV的發(fā)生發(fā)展。該研究認為，cZBTB44可以充當miR-578海綿來抑制后者對CNV的負向調控作用從而參與血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)及血管細胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達調控，最終誘導CNV的發(fā)生和發(fā)展。因此，cZBTB44對CNV的形成和靶向治療具有重要的參考價值。

2.4 circRNA與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是一種以視網(wǎng)膜缺血缺氧、新生血管增殖伴纖維化改變?yōu)樘攸c的早產(chǎn)兒眼底疾病。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，早產(chǎn)兒成活率增高，ROP已成為發(fā)達國家兒童失明的重要原因。隨著對ROP研究的不斷深入，近年關于ROP的相關臨床與基礎研究也越來越多。

Yang等[41]通過生物信息學分析預測出兩種可能參與ROP病理過程的circRNA。Cao等[42]經(jīng)基因芯片微陣列分析及qRT-PCR發(fā)現(xiàn)在氧誘導的小鼠視網(wǎng)膜病變模型的視網(wǎng)膜中有4種circRNA明顯異常表達，并繪制了ceRNA調控網(wǎng)絡，說明circRNA-miRNA-mRNA之間的相互作用具有復雜多樣性。但circRNA在ROP中的研究還不多，而且以上兩項研究樣本量有限，可能會出現(xiàn)統(tǒng)計誤差，因此仍需進一步探討。

2.5 circRNA與角膜新生血管角膜新生血管是指在感染性角膜炎、創(chuàng)傷、化學燒傷和自身免疫性疾病等病理情況下從角膜緣血管網(wǎng)生成并向角膜基質延伸的新生血管[43]。角膜的無血管性是維持其生理功能的結構基礎，過多的新生血管可能會嚴重影響患者的視功能。目前，角膜新生血管的治療主要是應用糖皮質激素及非甾體抗炎藥，但治療效果欠佳，circRNA的研究可能會為角膜新生血管的治療帶來新的方向。

研究發(fā)現(xiàn)，在堿燒傷小鼠模型的角膜樣本中有200多種異常表達的circRNA[44]，隨機抽取其中20種通過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)8種表達下調和8種表達上調的circRNA，其中cKifap3與cZFP609的異常表達最明顯。此外，此研究還發(fā)現(xiàn)在化學燒傷及角膜炎患者的角膜樣本中cKifap3的表達水平明顯下調，cZFP609的表達水平明顯上調。體外研究證實cKifap3表達沉默可以增強人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和成管能力，表明cKifap3與cZFP609可能參與調控角膜新生血管的形成。此外，研究表明，cZFP609可以吸附miR-184通過干預Akt和VEGF信號通路參與角膜新生血管的形成[45]。

3總結與展望

ENCODE計劃[46]使得人們對ncRNAs有了新的認識，目前已知的circRNA已超過30 000個[47]，但多數(shù)circRNA的起源、特征與生物學功能還未得到闡明。此類RNA是人體內重要的調控分子，可參與多種病理生理狀態(tài)的復雜調節(jié)過程，因其結構穩(wěn)定且具有高度保守性和組織特異性等特點，circRNA逐漸成為研究的熱點。circRNA在腫瘤、心血管領域的研究已取得諸多進展，但與眼部疾病的相關研究還不多，且多局限于離體水平，因此亟需建立更多系統(tǒng)有效的研究方法與動物模型。隨著circRNA數(shù)據(jù)庫的建立、生化方法和二代深度測序的迅速發(fā)展，相信circRNA將為眼底新生血管及其他相關增生性眼病的病因學及治療學提供新的研究方向及理論基礎，并為開發(fā)治療眼部增生性疾病提供新的藥物治療靶點和新思路。