血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障體外模型構(gòu)建研究進(jìn)展

袁 晨，張 梅，謝學(xué)軍

0引言

血-視網(wǎng)膜屏障(blood-retinal barrier，BRB)是視網(wǎng)膜重要的生理結(jié)構(gòu)，能夠調(diào)節(jié)眼血管床和視網(wǎng)膜組織間液體和分子運(yùn)動(dòng)，防止大分子和其它有害物質(zhì)滲入視網(wǎng)膜，在維持正常血管功能的生理屏障、保持視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜神經(jīng)元微環(huán)境方面具有重要的作用[1]。BRB包括內(nèi)層視網(wǎng)膜屏障和外層視網(wǎng)膜屏障兩部分。由于血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障(inner BRB，iBRB)功能的損害是引起糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜血管性疾病發(fā)生的主要原因，因此該領(lǐng)域研究正愈加被關(guān)注。闡明iBRB的結(jié)構(gòu)組成及功能并建立一個(gè)理想的體外模型對(duì)推進(jìn)生理生化、病理藥理及臨床等方面的研究具有較大的理論與臨床意義。

1血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的結(jié)構(gòu)組成

iBRB是由單層緊密附著的視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(retinal microvascular endothelial cell，RMEC)、周細(xì)胞(pericytes cell，PC)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes cell，AC)及基底膜共同構(gòu)成的神經(jīng)血管單位，它存在于視網(wǎng)膜神經(jīng)層的血管與神經(jīng)組織之間，是一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)[2]。

1.1視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞位于視網(wǎng)膜血管內(nèi)壁，形態(tài)扁平，單層生長(zhǎng)，具有復(fù)雜的緊密連接(tight junctions，TJs)，提示RMEC是屏障內(nèi)皮細(xì)胞，能嚴(yán)格篩選藥物及外源性物質(zhì)的通透；RMEC具有豐富的線粒體，能為細(xì)胞主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)提供高能量，所以RMEC對(duì)維持血管的正常通透和物質(zhì)的正常轉(zhuǎn)運(yùn)起到了關(guān)鍵性作用。RMEC是構(gòu)成iBRB和維持其功能完整性至關(guān)重要的結(jié)構(gòu)，與其直接接觸的星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞共同保持著iBRB的完整及致密性。RMEC不僅能夠確保視網(wǎng)膜的營(yíng)養(yǎng)及氧氣的供應(yīng)，還有助于iBRB將循環(huán)產(chǎn)生的毒素分子、炎癥免疫細(xì)胞等排出體外，以達(dá)到保護(hù)視網(wǎng)膜的作用[3]。所以，RMEC在保證正常的iBRB、正常的微血管功能方面發(fā)揮著十分重要的作用。

1.2周細(xì)胞PC是廣泛分布于全身毛細(xì)血管壁的結(jié)構(gòu)細(xì)胞，典型的成熟組織內(nèi)周細(xì)胞位于微血管內(nèi)皮細(xì)胞的外側(cè)壁，兩者間存在著緊密連接、縫隙連接、針-槽復(fù)合體和黏著斑等多種連接方式，并由共同的基底膜包繞，維持了血管壁的完整性[4-6]。PC不僅提供機(jī)械支持，而且與內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成微血管和組織間隙的屏障，并通過(guò)物理接觸與旁分泌信號(hào)與內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行相互作用，調(diào)節(jié)血-視網(wǎng)膜屏障的通透性、視網(wǎng)膜血流以及應(yīng)激反應(yīng)，是維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要因素[7-9]。視網(wǎng)膜具有很高的PC密度，PC與內(nèi)皮細(xì)胞的比例約為1∶1，PC在不同組織器官分布密度的差異與其調(diào)控毛細(xì)血管屏障、內(nèi)皮增殖及維持毛細(xì)血管張力及直徑等生理作用是一致的[10-11]。普遍認(rèn)為，PC數(shù)量越多，被覆蓋率越高，微血管的屏障功能就越好[12-13]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，同血-腦屏障的發(fā)育相似，PC可能通過(guò)為視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞形成屏障特性提供合適的微環(huán)境而參與iBRB的早期形成。雖然iBRB的緊密性主要是由內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密而黏附的連接介導(dǎo)的，但PC已被證明是iBRB的重要組成部分[14]。

1.3星形膠質(zhì)細(xì)胞RMEC被PC覆蓋，而PC又由AC支持[15]。視網(wǎng)膜中的AC包括原漿型星形膠質(zhì)細(xì)胞、纖維型星形膠質(zhì)細(xì)胞，還有脊椎動(dòng)物視網(wǎng)膜中特有的視網(wǎng)膜Müller膠質(zhì)細(xì)胞[16](retinal Müller glial cell，RMGC)，RMGC僅在視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)，并且是唯一的幾乎覆蓋整個(gè)視網(wǎng)膜厚度的視網(wǎng)膜細(xì)胞。AC的突起發(fā)出分支，借助血管足附著于血管壁上，形成毛細(xì)血管的外圍界膜，不僅維持了視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的完整性[17]，而且在內(nèi)皮細(xì)胞由非屏障細(xì)胞向屏障細(xì)胞轉(zhuǎn)變的誘導(dǎo)、維持和增強(qiáng)屏障特性等方面發(fā)揮著重要的作用[18-20]。同時(shí)，AC還具有很強(qiáng)的分泌作用，通過(guò)分泌各種因子(如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-b、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管生成素-1等)，調(diào)節(jié)iBRB的屏障作用，并調(diào)節(jié)血管張力和血流量[21-23]。所以說(shuō)，AC在維持iBRB結(jié)構(gòu)和特性方面均起著關(guān)鍵作用。

1.4基底膜基底膜是iBRB的重要組成部分，它是位于RMEC和PC之外的一層無(wú)定形的連續(xù)性膜結(jié)構(gòu)，兩者通過(guò)共享的基底膜連接進(jìn)行交流，起到調(diào)節(jié)和限制物質(zhì)交換的作用，是血液和組織間的一道屏障[24]。基底膜由3個(gè)并列蛋白組成，它們分別為結(jié)構(gòu)蛋白(膠原蛋白和彈性蛋白)、特殊蛋白質(zhì)(纖連蛋白和層黏連蛋白)和蛋白聚糖[25]，這些蛋白又由不同的細(xì)胞外基質(zhì)分子組成。除了內(nèi)皮細(xì)胞自身可合成部分基底膜成分以外，PC和AC也是這些細(xì)胞外基質(zhì)的重要來(lái)源，它們共同參與形成并維持視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的基底膜[26]?；啄さ钠茐膭?shì)必影響iBRB的屏障功能。

1.5緊密連接研究發(fā)現(xiàn)，屏障功能最重要的部件是TJs[27]。TJs是功能性的細(xì)胞間結(jié)構(gòu)，它們封閉細(xì)胞間隙，在相鄰細(xì)胞之間形成屏障，通過(guò)不斷地密封和解封，以調(diào)節(jié)液體、離子和小分子等的運(yùn)輸，控制內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞旁通透性[28]。除了對(duì)細(xì)胞旁通道的屏障功能外，TJs還具有另一種屏障功能，阻礙頂端和基底外側(cè)膜蛋白和脂質(zhì)的擴(kuò)散，從而參與細(xì)胞極性[29]。TJs是由含有跨膜蛋白(封閉蛋白Claudin、閉鎖蛋白Occludin和連接黏附分子JAM)和外周胞質(zhì)蛋白(如帶狀閉合蛋白zonula occludens1-3，ZO1-3)的多蛋白復(fù)合物形成的獨(dú)特組合[30]。屏障功能的改變與TJs蛋白的蛋白表達(dá)、磷酸化、泛素化和亞細(xì)胞分布的改變有關(guān)[31]。現(xiàn)已有大量研究證明，TJs是iBRB的結(jié)構(gòu)及功能的重要基礎(chǔ)，視網(wǎng)膜病變能夠?qū)е耇Js的改變，從而對(duì)iBRB造成破壞[32-35]。

2血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障的功能

iBRB通過(guò)視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接及周細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞等其它細(xì)胞的參與形成了結(jié)構(gòu)屏障，這種“屏障”起到了視網(wǎng)膜和血液循環(huán)之間選擇性分隔的作用，并維持了高度專業(yè)化的神經(jīng)緊密連接環(huán)境。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是，BRB并不是分子從循環(huán)到視網(wǎng)膜交換的絕對(duì)障礙。相反，它提供了一種選擇性機(jī)制，允許和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入視網(wǎng)膜，并且排除和阻止?jié)撛谖ｋU(xiǎn)性物質(zhì)通過(guò)，以便視網(wǎng)膜可以順利調(diào)節(jié)其內(nèi)環(huán)境，以應(yīng)對(duì)不同的新陳代謝需求。iBRB是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化的結(jié)構(gòu)，可以通過(guò)多種途徑和細(xì)胞間的相互作用來(lái)調(diào)控視網(wǎng)膜在生理、病理情況的功能，如對(duì)緊密連接蛋白[36-37]、轉(zhuǎn)運(yùn)載體[38-39]及酶類[40-41]的調(diào)控。iBRB功能的改變與許多病理過(guò)程聯(lián)系緊密，若屏障功能遭到破壞，會(huì)引發(fā)甚至加劇許多視網(wǎng)膜血管性疾病的發(fā)生發(fā)展，如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞、葡萄膜炎等。所以，iBRB結(jié)構(gòu)的完整和功能的維持是擁有正常視力所必需的。

3血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障體外模型的構(gòu)建

建立體外iBRB模型是重要的研究手段，便于我們能對(duì)iBRB病理生理狀態(tài)進(jìn)行更加深入的研究。只有使用比較理想的體外模型，所得出的結(jié)論才能更接近體內(nèi)實(shí)際情況，預(yù)測(cè)才更具有實(shí)際意義。一個(gè)理想的體外iBRB模型不僅要有和體內(nèi)一致的細(xì)胞形態(tài)和生理結(jié)構(gòu)分布，還要具有盡可能多的iBRB的生理特征?，F(xiàn)體外iBRB模型的建立在不斷發(fā)展和完善。

3.1 RMEC模型

3.1.1單視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞模型RMEC是iBRB的核心成員，單獨(dú)培養(yǎng)的RMEC能夠較好地保持在體特征，基本可以模擬iBRB功能，這是最簡(jiǎn)單可行也是最常見(jiàn)的用于研究iBRB通透性的體外模型。目前使用的RMEC來(lái)源各異，國(guó)內(nèi)外已可以將人、鼠、豬、兔、山羊、恒河猴和牛的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，其中對(duì)于iBRB的研究常采用人、鼠和牛來(lái)建立體外模型，通常采用機(jī)械的方法或者某些消化酶來(lái)分離視網(wǎng)膜微血管，并通過(guò)添加不同生長(zhǎng)因子、磁珠標(biāo)記法、物理刮除法等密度沉降分離法等來(lái)得到純度較高的內(nèi)皮細(xì)胞。體外RMEC單層模型大多是在靜態(tài)系統(tǒng)培養(yǎng)條件下，將RMEC直接接種于培養(yǎng)皿或跨膜小室(Transwell)上培養(yǎng),待細(xì)胞成功融合會(huì)呈現(xiàn)單層鋪路石樣排列，并出現(xiàn)接觸抑制，可通過(guò)PECAM-1、CD31、Ⅷ因子等特異性標(biāo)記物進(jìn)行鑒定，通過(guò)測(cè)量跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(TEER)、HRP通透性等方法進(jìn)行生理特性的鑒定[42-43]。

3.1.2二元培養(yǎng)模型iBRB上的各種細(xì)胞均有自身獨(dú)特的空間定位，這是細(xì)胞之間進(jìn)行相互作用以及維持屏障功能的基礎(chǔ)。研究認(rèn)為隨著時(shí)間的推移，單獨(dú)培養(yǎng)的RMEC會(huì)逐漸喪失iBRB在體內(nèi)的許多特性，有學(xué)者選擇將RMEC與組成iBRB的其它細(xì)胞進(jìn)行共同培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)RMEC加入其它細(xì)胞后能更好模擬體內(nèi)微環(huán)境狀態(tài)，具有更好的屏障特性。Tretiach等[44]測(cè)量了在小孔徑(0.4μm)和大孔徑(3μm)聚碳酸酯Transwell過(guò)濾器上的牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞單培養(yǎng)的電阻，并將其與內(nèi)皮細(xì)胞和Müller細(xì)胞的共培養(yǎng)進(jìn)行了比較，然后將每組中電阻最高和最低的制劑固定并在培養(yǎng)8～9d后進(jìn)行電子顯微鏡檢查，發(fā)現(xiàn)在0.4μm濾膜上，盡管共培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞和Müller細(xì)胞在濾膜兩側(cè)之間沒(méi)有直接接觸，但共培養(yǎng)組的TEER顯著高于內(nèi)皮細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)，表明在內(nèi)皮細(xì)胞附近的Müller細(xì)胞對(duì)屏障功能有積極的影響，而不僅僅是內(nèi)皮細(xì)胞和Müller細(xì)胞的相加作用。之后Tretiach等[45]又通過(guò)對(duì)TEER和菊粉通量測(cè)量，發(fā)現(xiàn)在常氧條件下，RMEC與RMGC共培養(yǎng)組較RCEC單層具有更佳的屏障功能。郭斌[46]將RMEC與RMGC在微孔膜上共培養(yǎng)建立了體外大鼠iBRB模型，發(fā)現(xiàn)RMGC可以促進(jìn)RMEC之間的TJs形成，提高屏障功能。通過(guò)多位學(xué)者的研究，得出了RMEC與RMGC共培養(yǎng)模型制備的方法一般是將RMEC與RMGC分別接種于0.4μm孔徑微孔膜的Transwell小室的內(nèi)、外底面，共培養(yǎng)后兩種細(xì)胞均能貼壁生長(zhǎng)，由于微孔膜的存在，細(xì)胞之間可以進(jìn)行相互作用但并未直接接觸，示蹤劑通透性試驗(yàn)和TEER可證實(shí)內(nèi)皮屏障的形成。

周細(xì)胞在iBRB中同樣具有重要的作用，近年來(lái)，有學(xué)者將RMEC與周細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)用于研究?jī)煞N細(xì)胞之間的聯(lián)系、可溶性分子的交換或仿生組織微環(huán)境內(nèi)的相互作用。Diana等介紹了三種人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HREC)與牛視網(wǎng)膜周細(xì)胞(BRP)共培養(yǎng)的方式，其中包括了二維(2D)直接和間接共培養(yǎng)方法[47]。直接培養(yǎng)的方式是將HREC與BRP按1∶1的比例在培養(yǎng)板中共培養(yǎng)，間接培養(yǎng)是將周細(xì)胞接種在6孔或24孔板上過(guò)夜，第2d將內(nèi)皮細(xì)胞以1∶1的比例接種在相應(yīng)的Transwell上腔中繼續(xù)培養(yǎng)，從而將兩種細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)。

3.1.3三元培養(yǎng)模型Nakagawa等[48]采用大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和周細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)不同共培養(yǎng)模型的TEER值明顯不同:三元共培養(yǎng)>周細(xì)胞二元共培養(yǎng)>膠質(zhì)細(xì)胞二元共培養(yǎng)>腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞單培養(yǎng)，由于iBRB與血-腦屏障(BBB)高度的相似性，學(xué)者們?cè)诖嘶A(chǔ)上建立了iBRB的三元培養(yǎng)模型。Wilkerson等[49]將原代HREC、視網(wǎng)膜周細(xì)胞和Müller細(xì)胞分別以3∶1∶1的比例在載玻片中建立iBRB的Tricell培養(yǎng)模型。更多的三元培養(yǎng)模型是將3種細(xì)胞同時(shí)接種在Transwell培養(yǎng)池中，RMEC被接種在微孔膜上方，周細(xì)胞在膜下方貼膜接種，星形膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)池底部貼壁接種，同樣可以使用熒光示蹤劑及TEER測(cè)量等方法對(duì)屏障完整性進(jìn)行評(píng)定[15，50]。

3.2永生化細(xì)胞模型自從Greenwood等[51]提出了“由大鼠BBB和BRB衍生的永生細(xì)胞系是研究特殊細(xì)胞屏障有用工具”的觀點(diǎn)后，以Hosoya等[52-53]為代表的一些學(xué)者進(jìn)行了更為深入的研究，他們成功建立的條件永生的視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞系(TR-iBRB)，具有視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的特性。這種由Tg大鼠建立的屏障細(xì)胞系具有體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)功能，不僅是藥物轉(zhuǎn)運(yùn)至視網(wǎng)膜的良好體外模型，并且是篩選可能傳遞至視網(wǎng)膜的藥物的良好模型[54]。Shen等[55]將TR-iBRB細(xì)胞接種在可滲透膜濾膜上生長(zhǎng)，通過(guò)測(cè)定一些藥物化合物成分在跨培養(yǎng)細(xì)胞層的轉(zhuǎn)運(yùn)，以確定表觀滲透系數(shù)(Papp)，發(fā)現(xiàn)此模型為預(yù)測(cè)整個(gè)BRB的滲透性提供了有用的工具，但該模型對(duì)眼后部候選藥物的高通量篩選和排序在治療眼病方面的有效性需要通過(guò)與活體數(shù)據(jù)的相關(guān)性進(jìn)行進(jìn)一步的論證。2000年，Hosoya從Tg大鼠中獲得了九種永生化的大鼠視網(wǎng)膜毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞系(TR-iBRBs)，并將其命名為T(mén)R-iBRB1-9，到目前為止TR-iBRB2應(yīng)用最為廣泛。Kubo等[56]根據(jù)初始吸收率(V)和Papp，研究了BRB滲透率與膜滲透率之間的關(guān)系，其中對(duì)TR-iBRB2細(xì)胞的攝取研究表明，它在基于體外分析的被動(dòng)擴(kuò)散和載體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的系統(tǒng)BRB通透性評(píng)估中具有很好的應(yīng)用前景。TR-iBRBs取材于具有溫度敏感的SV40大T抗原基因的轉(zhuǎn)基因大鼠(Tg大鼠)中，溫度維持在33℃時(shí)，TR-iBRBs細(xì)胞將永生并迅速生長(zhǎng)。這種細(xì)胞能夠表現(xiàn)出內(nèi)皮特征性的紡錘狀纖維狀形態(tài)，同時(shí)還表達(dá)vonWillebrand因子作為內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物，并且是乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的清除劑受體。

3.3通過(guò)3D細(xì)胞外基質(zhì)建立iBRB體外模型迄今為止，大多數(shù)基于細(xì)胞的測(cè)定法都使用傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)方法，即將細(xì)胞培養(yǎng)在平面環(huán)境中，但在體內(nèi)，細(xì)胞則被其他細(xì)胞、組織和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)重重包圍。盡管歷史悠久的2D細(xì)胞培養(yǎng)已被證明是用于細(xì)胞研究的一種有價(jià)值的方法，但2D細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)法充分考慮細(xì)胞的自然3D環(huán)境，其局限性已得到越來(lái)越多的認(rèn)識(shí)。于是，研究人員開(kāi)始嘗試3D細(xì)胞培養(yǎng)，并觀察它與2D培養(yǎng)的差異。而最近幾年出現(xiàn)了三維水凝膠、ECM和固體支架所建立的3D培養(yǎng)模型[57-58]，已經(jīng)有越來(lái)越多的證據(jù)表明3D細(xì)胞培養(yǎng)與2D培養(yǎng)系統(tǒng)相比可以更準(zhǔn)確地表示細(xì)胞在組織中駐留的實(shí)際微環(huán)境。Diana等將豬小腸做成ECM支架，先在支架上接種5×104個(gè)HREC，孵育2h后，加入等量的BRP，使兩種細(xì)胞共培養(yǎng)以研究它們?cè)?D仿生環(huán)境中的相互作用[47]。Beharry等[17]分別將HREC和人視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞(HRA)在Transwel(2D)及AlgiMatrix、Geltrex基質(zhì)等2種可生物降解的3D水凝膠支架上共培養(yǎng)，其中AlgiMatrix是一種非動(dòng)物來(lái)源的海綿，由冷凍干燥的海藻酸凝膠制成。接種細(xì)胞前，將細(xì)胞重懸，并加入10%(v/v)的AlgiMatrix固化緩沖液。用細(xì)胞懸液接種在海綿上。5min后，再向海綿中加入不含固化緩沖液的培養(yǎng)基，進(jìn)行孵育。對(duì)于HREC和HRA的共培養(yǎng)，首先接種HRA，48h后，將海綿翻轉(zhuǎn)用于接種HREC；Geltrex基質(zhì)是一種基底膜提取物，含有IV型膠原、層黏連蛋白和其他基質(zhì)蛋白和生長(zhǎng)因子，在15℃以上5～10min內(nèi)形成凝膠先將Geltrex基底膜在4℃下解凍過(guò)夜。第2d，培養(yǎng)皿表面包被Geltrex基質(zhì)，置于培養(yǎng)箱30min后先接種HRA，48h后在HRA上直接接種HREC，使兩種細(xì)胞共培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較后，他們發(fā)現(xiàn)HRA增強(qiáng)和促進(jìn)間歇性缺氧狀態(tài)下HREC的反應(yīng)，并且在3D支架上培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出較少的氧化應(yīng)激反應(yīng)，所以認(rèn)為在3D支架上共培養(yǎng)的HREC和HRA可能概括了動(dòng)態(tài)iBRB的藥物反應(yīng)，在臨床眼科藥物的發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)上有很好的應(yīng)用前景。

4總結(jié)和展望

由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)耗時(shí)耗力，且存在動(dòng)物種屬差異、倫理限制等多種復(fù)雜因素的干擾，而體外模型更加可控、經(jīng)濟(jì)，故體外模型的建立具有十分重要的意義。選取適合的體外培養(yǎng)模型是實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵，這就需要根據(jù)研究目的并結(jié)合各種模型的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行選擇。

單層RMEC模型能夠較好地保持在體特性，其顯著優(yōu)點(diǎn)是易操控并可表達(dá)多種重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可應(yīng)用于研究信號(hào)通路、轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)、藥物的高通量篩選以及結(jié)合親和力的測(cè)量。因RMEC培養(yǎng)技術(shù)已比較成熟，應(yīng)用較廣泛，故它是藥理學(xué)研究中最常用的體外培養(yǎng)模型之一。但原代培養(yǎng)的RMEC需多次重復(fù)傳代純化才能獲得足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，且這種模型結(jié)構(gòu)單一，其忽略了其它細(xì)胞群之間的信號(hào)傳導(dǎo)和機(jī)械性刺激的致敏性調(diào)節(jié)，且不易形成單層TJs，很大程度限制了長(zhǎng)期維持iBRB模型特性的能力。同時(shí)模型TEER較低，滲透性較高，與體內(nèi)實(shí)際情況差距較大。

據(jù)以往研究可知，周細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞均在調(diào)節(jié)RMEC緊密連接及維持iBRB結(jié)構(gòu)和功能方面起著重要的作用。這種將細(xì)胞共培養(yǎng)的多元培養(yǎng)形式所反映的細(xì)胞間的移動(dòng)以及動(dòng)態(tài)的相互作用與體內(nèi)更加相似，能夠增加iBRB的緊密連接，更加充分地模擬在體微環(huán)境，體現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞的屏障作用，同時(shí)在展示結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的研究中更具有代表性。多細(xì)胞共培養(yǎng)模型可通過(guò)對(duì)各種細(xì)胞之間及細(xì)胞與內(nèi)環(huán)境之間的相互作用進(jìn)行研究，也可進(jìn)一步探究藥物對(duì)細(xì)胞的作用和疾病的損傷機(jī)制。但由于各種細(xì)胞的培養(yǎng)較復(fù)雜，成本較高，共培養(yǎng)操作步驟較為繁瑣，在模型的廣泛應(yīng)用方面具有一定的局限性。并且這些模型培養(yǎng)的細(xì)胞往往缺乏極性，故只具有部分屏障功能，只適合于進(jìn)一步的物質(zhì)通透性研究。

永生化細(xì)胞是已知增殖效果好，能保留親本重要形態(tài)、特性及功能的細(xì)胞，而且可以避免原代細(xì)胞提取過(guò)程的繁瑣步驟，也排除了其他細(xì)胞的污染，有利于細(xì)胞的純化。模型的來(lái)源穩(wěn)定，制備成本較低，效率高。但是此種模型分化程度較低，并不能完全體現(xiàn)iBRB的特點(diǎn)。而且模型滲漏性較高，TEER值小，不宜進(jìn)行通透性篩選試驗(yàn)，多通過(guò)細(xì)胞攝取試驗(yàn)研究生理或病理?xiàng)l件下iBRB的轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制[59]。

通過(guò)3D細(xì)胞外基質(zhì)建立的iBRB體外模型比2D培養(yǎng)系統(tǒng)更具有生理學(xué)意義，可較好地表現(xiàn)出細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用，并且能更好地模擬細(xì)胞在組織中生長(zhǎng)及作用的實(shí)際微環(huán)境，能更加準(zhǔn)確地反映出體內(nèi)細(xì)胞的各種反應(yīng)。細(xì)胞在三維支架上的共培養(yǎng)模型可以作為臨床前藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)的強(qiáng)大仿生模型，可以應(yīng)用于新藥開(kāi)發(fā)及篩選的最初幾個(gè)階段用于靶點(diǎn)識(shí)別，藥物劑量?jī)?yōu)化，以及在后期Ⅱ/Ⅲ期試驗(yàn)中減少藥物毒性和治療失敗等多方面[60]。水凝膠基質(zhì)，是一種水溶性聚合物，由于其高含水量，與玻璃體液體相似，因此非常適合眼科應(yīng)用。而且它們另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以保護(hù)藥物，延長(zhǎng)平均停留時(shí)間，并能持續(xù)給藥。但這種3D微環(huán)境也存在著許多缺陷。例如缺乏剪切應(yīng)力或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，氧氣、營(yíng)養(yǎng)以及可溶性的生長(zhǎng)因子的分布在整個(gè)培養(yǎng)層中可能會(huì)是不均勻的，而且凝膠也會(huì)隨著介質(zhì)的擴(kuò)散出現(xiàn)梯度[61]。

隨著對(duì)iBRB生理、病理的研究逐漸深入，在體外建立iBRB模型的研究也從簡(jiǎn)單的單細(xì)胞培養(yǎng)逐步發(fā)展到多元共培養(yǎng)、永生化細(xì)胞系及3D細(xì)胞外基質(zhì)等方法，iBRB模型的模擬程度越來(lái)越高，具有更多的功能性，并且更貼近體內(nèi)微環(huán)境。但目前所有的體外iBRB模型各有其優(yōu)缺點(diǎn)，使得體外iBRB模型的研究需不斷完善，以便為人們?cè)诳蒲械缆飞先〉酶噙M(jìn)展提供更好的基礎(chǔ)。