中藥在調(diào)控肝卵圓細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及機制研究進展

王楚皓，馮 斌，白 雪，陶 山，李 倩，陳 陽，史曉燕，段麗芳，范 妤

(1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

肝卵圓細(xì)胞(hepatic oval cell,HOC)是一種肝臟內(nèi)的多能干細(xì)胞，正常狀態(tài)下具有向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化的潛能[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，HOC易受某些致癌因素影響異常增殖惡性轉(zhuǎn)化成為致癌靶點，提示HOC在肝硬化轉(zhuǎn)肝癌的過程中發(fā)揮重要作用[3]。探究調(diào)控HOC的惡性轉(zhuǎn)化作用的機制成為當(dāng)前研究肝癌防治機制的熱點；在阻止或逆轉(zhuǎn)HOC惡性轉(zhuǎn)化中的作用中，多種中藥及其活性成分發(fā)揮了有效作用。本文就在肝硬化轉(zhuǎn)肝癌過程中HOC的惡性轉(zhuǎn)化作用展開綜述，同時總結(jié)目前中醫(yī)藥在抑制HOC惡性轉(zhuǎn)化的研究現(xiàn)狀，以期為HOC在肝癌發(fā)生機制的研究提供理論參考。

1 肝卵圓細(xì)胞

HOC呈卵圓形，體積小，核漿比例大，核卵圓形，胞漿嗜堿性且染色淺，是肝臟內(nèi)的一種多能干細(xì)胞，在細(xì)胞因子的作用下具有向肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞甚至向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化的潛能。目前認(rèn)為HOC不僅分布于肝小葉內(nèi)，還存在于Hering管及門靜脈周圍[4-5]。在正常成體肝臟中HOC處于靜止?fàn)顟B(tài)，不易檢測到，但當(dāng)肝臟受損嚴(yán)重或肝臟細(xì)胞增殖能力降低時被激活，并增殖分化為肝實質(zhì)細(xì)胞，發(fā)揮修復(fù)受損肝臟，重建肝臟結(jié)構(gòu)及功能?；罨腍OC可見多種特異性蛋白的表達：①膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物，CK-7、CK-8、CK18、CK19、卵圓細(xì)胞標(biāo)記物(OV)-6、GSTπ、連接蛋白(connexin)-43、A6；②幼稚肝細(xì)胞標(biāo)志物，AFP、GGT、PKM2；③造血干細(xì)胞標(biāo)志物，Thy-1、c-kit、CD34、干細(xì)胞抗原(Sca)-1；④神經(jīng)上皮細(xì)胞標(biāo)志物，嗜鉻粒蛋白A、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子、甲狀旁腺素相關(guān)蛋白[6]。

2 HOC與肝硬化、肝癌關(guān)系密切

2.1HOC的活化 HOC增殖分化的現(xiàn)象稱為膽管反應(yīng)，是一種對肝膽細(xì)胞損傷的修復(fù)反應(yīng)。其激活與細(xì)胞微環(huán)境關(guān)系密切，1978年Raymond Schofield首次提出細(xì)胞微環(huán)境定義，通過特定的細(xì)胞外基質(zhì)和龕細(xì)胞提供特殊的微環(huán)境，對維持干細(xì)胞的高增殖力和誘導(dǎo)定向分化起關(guān)鍵作用。目前HOC活化相關(guān)因素有：①來源于肝星狀細(xì)胞的信號(Notch、TNF-α、TGF-β、HGF、EGF、IL-6等)；②來自于巨噬細(xì)胞的信號(Wnt、TWEAK、TGF-β)；③炎癥因子(LIF、抑瘤素M、淋巴毒素-β)；④受損肝細(xì)胞直接作用(Hedgehog)；⑤來源于內(nèi)皮細(xì)胞信號(SDF-1)；⑥層粘邊蛋白[7-8]。當(dāng)肝實質(zhì)受損、微環(huán)境改變時，HOC被激活且大量增殖，首先出現(xiàn)在Hering管及門靜脈周圍，隨后遷移至肝臟實質(zhì)，在通往中央靜脈的路徑上不斷成熟和向肝系或膽系分化，修復(fù)和重建肝臟。肝系分化過程包括成肝細(xì)胞(表達CK19肝樣肝細(xì)胞，其體積大小介于HOC和肝細(xì)胞之間)、具有間質(zhì)與肝膽表型的肝祖細(xì)胞(CK19、CK7表達陽性)、中間型肝細(xì)胞(CK19陰性、CK7陽性)、肝細(xì)胞；膽系分化包括反應(yīng)性小膽管、膽管上皮細(xì)胞。HOC的增殖與炎癥程度呈正相關(guān)，在中、重度肝實質(zhì)炎癥時，可見中間型肝細(xì)胞包圍著HOC的現(xiàn)象[7，9-11]。

2.2活化的HOC參與肝硬化的形成 有研究表明肝假小葉的周圍伴隨著膽管反應(yīng)，線粒體DNA基因分型顯示膽管反應(yīng)中的HOC與再生結(jié)節(jié)中的肝細(xì)胞有共同的起源，提示在肝硬化階段，活化HOC參與了肝再生結(jié)節(jié)的形成[12]。肝硬化是多種因素所致慢性肝損傷致肝纖維化的最終結(jié)果，與肝星狀細(xì)胞活化為成纖維細(xì)胞關(guān)系密切。肝星狀細(xì)胞分泌的肝細(xì)胞生長因子(HGF)在體內(nèi)外都可促進HOC的增殖；活化的間充質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生TGF-β是最有效的肝促纖維化細(xì)胞因子， 其與avβ6整聯(lián)蛋白的聯(lián)合可調(diào)節(jié)HOC的功能[13]。成纖維細(xì)胞也可通過表達Jagged1，激活HOC的Notch受體，促進其分化[14]。此外，免疫反應(yīng)與炎癥因子也被證實參與此過程中，Ji等[15]研究證實白細(xì)胞介素-6(IL-6)是HOC增殖所必需，其發(fā)揮作用的途徑有兩種：一是通過促進HGF和TWEAK促炎性腫瘤壞死因子家族成員的表達，調(diào)節(jié)HOC和巨噬細(xì)胞相互作用，通過FN14受體對HOC具有促有絲分裂的作用；二是通過激活JAK/STAT3信號通路直接激活HOC增殖?？梢?，慢性肝損傷可激活HOC的增殖和分化，伴隨著肝纖維化的發(fā)展與炎癥因子的持續(xù)存在，HOC不斷增殖分化，被動地參與了肝硬化的形成。

2.3肝硬化中HOC惡性轉(zhuǎn)化參與肝癌的發(fā)生 肝硬化被認(rèn)為是肝癌癌前病變，慢性肝損傷、炎癥和纖維化是肝癌癌前微環(huán)境的特點。HOC作為肝干細(xì)胞在肝臟損傷時激活增生并參與組織修復(fù)，是肝臟在受損時的自我保護機制，但由于其具有高度分化的能力以及持久的增殖活性，在惡劣的肝組織微環(huán)境誘導(dǎo)下，極易導(dǎo)致HOC惡性轉(zhuǎn)化，從而推進肝癌的進程[2]。研究顯示CK19陽性肝癌患者高表達HOC其他細(xì)胞標(biāo)記物(FRT7、CD133、GSTP1)，且CK19陽性肝癌患者比CK19陰性肝癌患者的瘤周膽管反應(yīng)更為明顯，血清AFP顯著升高[16]。在乙肝致肝細(xì)胞癌患者中，同樣觀察到CK19陽性肝癌患者的癌前病灶主要由HOCs和中間型肝細(xì)胞組成，腫瘤大小、瘤周肝組織的炎癥和纖維化程度與膽管反應(yīng)分級顯著相關(guān)[17]。付廣文等[18]用免疫組化法計數(shù)不同肝病組肝組織中HOC內(nèi)膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物和肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達，結(jié)果顯示CK-7、CK8/18、CK19在HOC中的表達情況為：對照組<肝血管瘤組<良性肝病合并肝硬化組<肝癌組<肝癌合并肝硬化組，表明HOC增殖數(shù)目與肝臟病變發(fā)展呈正相關(guān)；且HOC參與了原發(fā)性肝癌的生長、細(xì)胞分化調(diào)控。可見HOC參與肝硬化的形成，并受微環(huán)境改變的影響而趨于向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

2.4多條信號通路在HOC惡性分化致癌的過程中發(fā)揮調(diào)控作用 目前公認(rèn)的肝癌發(fā)生機制有兩種：①成熟肝細(xì)胞去分化致癌變；②肝干細(xì)胞異常分化致癌變[19]。有文獻報道HOC的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化、Wnt/β-catenin通路、Notch通路、TGF-β通路、miR216a/PTRN-Akt通路都參與了HOC的惡性轉(zhuǎn)化過程。

2.4.1HOC的上皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程，此時E-黏鈣蛋白下調(diào)而N-黏鈣蛋白上調(diào)，現(xiàn)研究已發(fā)現(xiàn)EMT是癌癥進展中的重要過程。而HOC作為肝臟干細(xì)胞，其組織化學(xué)特征具有肝細(xì)胞Hepbar1、膽管細(xì)胞CK19、肝祖細(xì)胞OV-6 等標(biāo)記物的表達[20]。在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，TGF-β1可促進HOC發(fā)生EMT，使其具有致纖維化作用[21]，Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的EMT過程不僅使HOC參與肝纖維化，而且可能參與癌變。Dong等[20]通過裸鼠皮下移植HOC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過EMT過程后，HOC細(xì)胞分化為間充質(zhì)腫瘤組織，且在癌前期變化的階段，HOC大多變?yōu)樾「渭?xì)胞，小肝細(xì)胞是肝細(xì)胞的前身，少數(shù)小肝細(xì)胞在此環(huán)境下會繼續(xù)不典型增生，使其具有癌細(xì)胞特點進一步發(fā)展最終形成肝細(xì)胞癌[23]。

2.4.2Wnt/β-catenin通路 經(jīng)典的Wnt/β-catenin通路可促進HPCs分化為肝細(xì)胞，而非經(jīng)典的Wnt信號通道在HOC中的激活足以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為HCC[17，24]。Imrich等[25]發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路發(fā)生突變和異常激活后，過表達上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)可促進HOC異常分化獲得CSC特征，向HCC轉(zhuǎn)變。有研究表明[26-27]，HOC中存在一個包含HNF4a和Wnt/β-catenin-snail軸的負(fù)反饋通路，阻止EMT和HOC向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。HNF4α是維持細(xì)胞上皮表型的重要轉(zhuǎn)錄因子，可抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，而snail基因是Wnt/β-catenin通路的下游轉(zhuǎn)錄因子，是EMT啟動子。β-catenin可能存在于其胞膜、胞質(zhì)、胞核，形成活性復(fù)合物。激活HOC時，β-catenin總量和活性顯著增加，在細(xì)胞質(zhì)中積累并進入胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子激活下游靶基因。因此當(dāng)Wnt/β-catenin通路異常時可促使HOCEMT相關(guān)標(biāo)志物表達增加，獲得LCSC特征。Ring1作為多梳妝蛋白的成員，在癌變和干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮著重要作用。其過度表達激活Wnt/β-catenin通路，可使HOC出現(xiàn)增殖異常、核仁比例增大等低分化肝癌形成的表現(xiàn)，促使HOC向肝癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)化。此外，Ring1還可通過降解P53促進癌細(xì)胞的增殖和存活[28]。

2.4.3Notch通路 Notch信號通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、再生等過程起著關(guān)鍵作用。Hes1是Notch信號通路的主要下游靶基因，常將其表達的水平作為評價Notch信號活性的指標(biāo)。在Solt_Farber實驗大鼠模型中，可觀察到Notch1、Hes1在對照組不表達，而在模型組表達明顯，提示肝細(xì)胞癌前病變伴有Notch通路的激活[29]。在CK19陽性HCC患者中，Notch信號通路(Notch1、Notch2、Notch3、JAG1、JAG2)上調(diào)明顯，肝細(xì)胞特異性基因(HNF4α、ABCC2)表達減少，過表達上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)，從而促進HOC異常分化獲得CSC特征[16]。

2.4.4TGF-β通路 TGF-β通路是轉(zhuǎn)化生長因子介導(dǎo)的一系列信號傳遞的過程，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化中起著關(guān)鍵作用。TIC標(biāo)志物的表達與肝硬化上調(diào)TGF-β水平密切相關(guān)，TGF-β水平的升高可促HOC通過miR216a/PTRN-Akt依賴通路獲得TICs特征，改變HOC表型，促進HCC的發(fā)生發(fā)展[30-31]。此外，庫普弗細(xì)胞被證實除促進HOC增殖外，對于HOC向LCSC轉(zhuǎn)化也有影響。庫普弗細(xì)胞是肝炎性細(xì)胞因子TNF-α的主要來源。TNF-α通過影響泛素D和CHK2觸發(fā)HOCDNA損傷和染色體不穩(wěn)定性，并通過TNFR1/Src/STAT3通路增強HOC的自我更新，促進HOC向LCSC轉(zhuǎn)化[32]。

3 中藥調(diào)控HOC惡性轉(zhuǎn)化在防治肝癌中的作用及機制研究進展

中藥是天然的化學(xué)分子庫。研究證實，中藥復(fù)方、單味藥及其活性成分可通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡、抑制黏附侵襲能力、抑制腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)機體免疫功能、增效減毒、逆轉(zhuǎn)耐受等作用參與肝硬化及肝癌的防治[33-35]。針對HOC參與肝臟修復(fù)、易受微環(huán)境影響成為癌細(xì)胞潛在來源的特點，目前中藥治療以改善肝臟微環(huán)境、參與調(diào)控Notch、Wnt/β-catenin等信號通路誘導(dǎo)HOC向成熟分化，以達到防治肝癌的目的。

3.1調(diào)節(jié)信號通路誘導(dǎo)HOC成熟分化 苦參堿是由豆科植物苦參中提取的生物堿。其體外培養(yǎng)WB-F344HOC株，可通過下調(diào)Wnt-1表達誘導(dǎo)HOC向肝細(xì)胞方向分化[36]。Yang等[37]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿干預(yù)后的大鼠HOC增殖模型中表達AFP細(xì)胞數(shù)量減少、強度減弱，并證實該藥物可通過誘導(dǎo)下調(diào)Notch1 mRNA、Jagged1 mRNA的表達，以劑量依賴性的方式抑制HOCNotch通路，使具有高度分化潛能的HOC向成熟肝細(xì)胞方向分化。黃芩苷被證實可通過β-catenin通路逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抑制癌細(xì)胞的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。此外，黃芩苷在治療2-AFF/PH模型中，通過其抗氧化的作用抑制NF-κB信號通路，誘導(dǎo)增殖的HOC向成熟的肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞分化[38]。扶正化瘀方通過下調(diào)Notch信號通路，誘導(dǎo)干細(xì)胞向成熟肝細(xì)胞分化，減少EMT抑制在肝細(xì)胞分化成熟過程中間充質(zhì)細(xì)胞和膽管細(xì)胞的形成，可降低癌細(xì)胞的運動性、侵襲性和逃避免疫細(xì)胞的能力[39]。解毒涼血方臨床上用于重型肝炎及肝衰竭的治療，在Solt_Farber模型中，可見治療組較模型組 CD34、Notch蛋白表達降低，ALB蛋白表達上調(diào)，提示其具有誘導(dǎo)HOC向成熟肝細(xì)胞分化的作用[40]。

3.2改善肝臟微環(huán)境 中藥復(fù)方包含多種化學(xué)因子，其多靶點、多作用的整體治療特點可通過提升人體免疫力、改善微環(huán)境達到治療疾病的目的。微環(huán)境對于細(xì)胞分化方向尤為關(guān)鍵，肝臟組織結(jié)構(gòu)不能完全的再生和修復(fù)可導(dǎo)致肝臟再生微環(huán)境的異常，與誘導(dǎo)HOC向HCC轉(zhuǎn)化有著直接的關(guān)系。因此中藥復(fù)方通過調(diào)控胞間信號通路來改變惡劣的微環(huán)境，以此促進誘導(dǎo)HOC正常分化是防治肝癌的重要手段。清肝化瘀方(苦參、白花蛇舌草、半枝蓮、醋郁金、白術(shù)、醋莪術(shù))通過調(diào)控ERK-MAPK、TGF-β1/Smads等信號通路作用，改善Solt_Farber模型肝臟微環(huán)境，減少炎癥因子，使表達肝癌細(xì)胞表型的HOCAFP表達明顯減少、ALB表達增多，誘導(dǎo)HOC向成熟肝細(xì)胞方向分化的同時恢復(fù)肝細(xì)胞的功能[41]。中醫(yī)認(rèn)為脾主運化，為后天之本。肝硬化及肝癌患者臨床上有消化系統(tǒng)癥狀，加之久病致虛，故用四逆散加四君子湯疏肝理氣，在調(diào)和肝脾的基礎(chǔ)上更加注重健補脾胃，以此整體改善機體功能。四逆散加四君子湯可使HOC內(nèi)HGFR、EGFR、CTGFR、TGF-β、FGFR表達增加，以HGF為中心的細(xì)胞因子體系改善肝臟微環(huán)境，通過整體對HOC的增殖、分化進行調(diào)節(jié)以防治肝癌的發(fā)生發(fā)展[42]。

3.3誘導(dǎo)惡性轉(zhuǎn)化的HOC凋亡或自噬 苦參堿除可誘導(dǎo)HOC向成熟肝細(xì)胞分化外，還可通過抑制HOC的過度增殖，阻滯肝癌的發(fā)生發(fā)展。張偉碩等[43]建立Den+Solt-FarberSD大鼠模型后給予苦參堿干預(yù)治療發(fā)現(xiàn)苦參堿干預(yù)可以促進HOC凋亡，同時減少或阻斷HOC向肝癌細(xì)胞方向分化。謝步善[44]研究表明苦參堿通過下調(diào)HOCS6磷酸化水平，誘導(dǎo)HOC產(chǎn)生mTOR依賴性自噬，并證明p53失活通過調(diào)節(jié)AMPK激酶，參與到苦參堿誘導(dǎo)的自噬體的調(diào)控。

4 總結(jié)及展望

HOC具有向肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞分化的能力，在正常成體肝組織中呈靜息狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生肝損傷時，HOC激活并參與肝臟再生修復(fù)及肝硬化形成的過程。由于微環(huán)境的改變，HOC的過度增殖和異常分化，使其成為肝細(xì)胞癌的潛在來源?，F(xiàn)研究表明HOC在肝硬化及肝癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。因此如何抑制HOC的異常增殖和分化成為防治肝癌的重要部分。隨著中藥藥理的發(fā)展，越來越多的中藥被用于防治腫瘤疾病，通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡、抑制黏附侵襲能力、抑制腫血管生成、調(diào)節(jié)機體免疫功能、增效減毒、逆轉(zhuǎn)耐受等作用在抗腫瘤的治療中取得顯著成果，此外多靶點多作用的整體調(diào)節(jié)對慢性疾病具有很好的療效。眾多研究者針對HOC在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用和癌化的主要靶點，篩選中藥有效成分進行深入研究，發(fā)現(xiàn)多種中藥復(fù)方、單味藥及其活性成分可通過調(diào)控HOC抑制肝癌的發(fā)生發(fā)展。目前，中藥主要通過調(diào)節(jié)信號通路或改善肝臟微環(huán)境以此誘導(dǎo)HOC向成熟肝細(xì)胞分化,恢復(fù)肝臟功能，阻滯肝癌的發(fā)展。參與該過程的信號通路包括Notch、Wnt、Hedgehog 等信號通路。此外，還可誘導(dǎo)HOC凋亡或自噬，以阻止細(xì)胞癌變的發(fā)生。綜上，HOC在肝癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，同時中藥對HOC防治肝癌進展有一定的作用，但對臨床肝癌患者或肝硬化進展性肝癌患者的臨床療效仍需進一步的驗證。就目前而言，中藥應(yīng)用于HOC防治肝癌的前景非常廣闊。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。