淺談蜂王漿中抗生素殘留檢測方法

王 琦，陳東海，王進(jìn)州，張 發(fā)，王 志

（吉林省養(yǎng)蜂科學(xué)研究所，吉林 吉林 132108）

抗生素是由微生物或高等動(dòng)植物在低濃度下分泌的小分子天然有機(jī)化合物，是能夠干擾其他細(xì)胞發(fā)育功能的化學(xué)物質(zhì)[1]，具有一定的抑菌或殺菌作用?？股匕凑栈瘜W(xué)結(jié)構(gòu)大致可分為β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類、氨基葡糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、多肽類等[2]；而按照用途又可分為人用抗生素和獸用抗生素兩種，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、畜牧業(yè)、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域。蜂病是蜜蜂養(yǎng)殖業(yè)的棘手問題之一，而抗生素的出現(xiàn)大大降低了蜂病所帶來的損失。如美洲幼蟲腐臭病、白堊病、微孢子蟲病等蜜蜂常見疾病均可通過抗生素得到有效控制或治療。

有研究表明，抗生素類藥物的吸收率并不高，約有85%的抗生素會(huì)經(jīng)受藥者新陳代謝而排出體外[3]。蜂王漿是經(jīng)由蜂巢內(nèi)哺育蜂的頭部腺體分泌到體外的分泌物，因此在蜂王漿生產(chǎn)期間（或前不久） 使用抗生素類藥物，可使抗生素殘留在蜂王漿內(nèi)。陳昌利等[4]研究發(fā)現(xiàn)，給蜂群飼喂250 mg 四環(huán)素后50 d，蜂王漿中的四環(huán)素殘留才能完全達(dá)標(biāo)，土霉素則需要60 d。雖然按照規(guī)定用法定量使用抗生素能夠?qū)⒎渫鯘{內(nèi)的抗生素含量控制在合格（安全） 水平，但在養(yǎng)蜂生產(chǎn)上濫用抗生素的現(xiàn)象卻層出不窮[5]。這主要?dú)w結(jié)于獸藥抗生素具有防治動(dòng)物疫病和促進(jìn)生長的雙重功效[6]。這些抗生素在一系列傳遞后最終排放到環(huán)境中，可引起致病菌獲得抗生素耐藥性等不利影響[7]。因此，在蜂王漿銷售前，嚴(yán)格的抗生素檢測措施是必不可少的，而如何方便、快速、精準(zhǔn)的定性定量分析蜂王漿中的抗生素殘留一直是該領(lǐng)域的研究重點(diǎn)。本文對(duì)蜂王漿中抗生素殘留的幾種主要檢測方法進(jìn)行了綜述。

1 蜂王漿中的抗生素殘留

20 世紀(jì)40 年代，青霉素的發(fā)現(xiàn)在第二次世界大戰(zhàn)中大放異彩，它優(yōu)異的抗菌消炎功效拯救了無數(shù)人的生命。而在隨后的70 多年間，各種各樣的抗生素類藥物被廣泛應(yīng)用在醫(yī)療、獸醫(yī)、養(yǎng)殖等領(lǐng)域。抗生素類蜂藥一經(jīng)問世便被諸多養(yǎng)蜂者視為“萬能藥”，相伴而生的便是盲目用藥、過量用藥、防病用藥、生產(chǎn)期用藥等一系列不科學(xué)用藥，出現(xiàn)“藥殘”現(xiàn)象，嚴(yán)重影響蜂產(chǎn)品品質(zhì)[8]。養(yǎng)蜂業(yè)常用的抗生素類藥物主要有：青霉素、頭孢菌素、林可霉素、四環(huán)素、鏈霉素、紅霉素、替米考星、土霉素、金霉素、多西環(huán)素、喹諾酮類、卡那霉素、氯霉素、泰樂菌素、β-內(nèi)酰胺等。如鹽酸土霉素可用于治療美洲幼蟲腐臭病和歐洲幼蟲腐臭病、使用制霉菌素治療白堊病、煙曲霉素治療孢子蟲病等[9]。

2 檢測方法

2.1 液相色譜法

液相色譜法是一種分析速度快、分離效能高、自動(dòng)化的分析方法，具有高柱效、高選擇性、分析速度快、靈敏度高、重復(fù)性好、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，是蜂王漿內(nèi)抗生素殘留的主要檢測方法。裝置由固定相和流動(dòng)相組成，固定相置于色譜柱中，種類繁多，如吸附劑離子交換樹脂等；流動(dòng)相為各種溶劑。待測樣隨流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱后，因各組分間對(duì)固定相的吸附能力、分配系數(shù)等因素的差異（因固定相種類而定） 使得各組分從色譜柱中流出時(shí)間不同，從而實(shí)現(xiàn)組分的分離。然后各組分進(jìn)入檢測器（紫外、熒光、示差折光檢測器和質(zhì)譜儀） 中進(jìn)行定量分析。

物質(zhì)均由一種或多種元素組成，而不同元素之間的差異便是核電荷數(shù)不同，因此兩個(gè)不同元素的離子質(zhì)量存在差異。質(zhì)譜法是將樣品電離轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子后根據(jù)其不同的質(zhì)荷比大小分離并進(jìn)行分析。質(zhì)譜儀靈敏度高、結(jié)構(gòu)分析性能強(qiáng)，除對(duì)待測樣品進(jìn)行獨(dú)立定性或定量分析外，還可作為高效液相色譜的檢測器使用，即高效液相色譜- 質(zhì)譜法（HPLC-MS 或LC-MS）。

GB/T21164-2007[10]中規(guī)定了液相色譜法檢測蜂王漿中鏈霉素、雙清鏈霉素殘留量的方法，該方法使用庚烷磺酸鈉-磷酸鈉混合液提取，C18 為固定相，甲醇為流動(dòng)相，經(jīng)熒光檢測器檢測，使用外標(biāo)法定量。周碧青等[11]使用高效液相色譜法測定了蜂王漿中3 種四環(huán)類抗生素殘留，該方法采用Na2EDTA-Mellvaine 緩沖液提取后經(jīng)SPE 固相萃取純化，使用紫外檢測器進(jìn)行測定。

而在國標(biāo)法中，液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法得到了廣泛應(yīng)用。如GB/T 22945-2008[12]中使用該方法將鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素提取后經(jīng)苯磺酸型和羥酸型固相萃取柱，串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測蜂王漿中三種抗生素殘留。Zhang 等[13]使用pH 6.0 磷酸鹽緩沖液提取,經(jīng)HLB 小柱凈化富集后,采用高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)蜂王漿中紅霉素及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分析。此外，林可霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、螺旋霉素、克林霉素、吉他霉素、交沙霉素[14]（GB/T 22946-2008）、土霉素、四環(huán)素、金霉素、多西環(huán)素[15](GB/T 23409-2009)等抗生素均可采用液相色譜法-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測。

3.2 酶聯(lián)免疫法

酶聯(lián)免疫法是一種特殊的試劑分析方法，試劑主要包括固相的抗體或抗原、酶標(biāo)記的抗體或抗原、顯色劑三部分，因酶具有高的催化頻率，該方法具有高的靈敏度。酶聯(lián)免疫法使用酶分子標(biāo)記抗體或抗原（保留抗體或抗原免疫學(xué)特性的同時(shí)又保留了酶的活性） 與固相的抗體或抗原特異性結(jié)合，通過顯色液發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)溶液的顏色變化對(duì)待測樣進(jìn)行定性或定量分析。

邢淑婕[16]使用自制的土霉素酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測了蜂王漿中土霉素殘留含量，發(fā)現(xiàn)所有樣品中均有土霉素殘留，殘留量可達(dá)到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的限量標(biāo)準(zhǔn)；此外，平行使用的結(jié)果表明，酶聯(lián)免疫法的靈敏度遠(yuǎn)高于TLC 法（薄層色譜法）。趙暉等[17]使用四環(huán)素酶聯(lián)免疫檢測盒測定了出口蜂產(chǎn)品中抗生素含量，結(jié)果表明當(dāng)蜂蜜和蜂王漿中四環(huán)素濃度為0.025 mg/kg 時(shí)，10 次檢測均為陽性，可滿足對(duì)出口蜂王漿的檢測要求（四環(huán)素含量<0.05 mg/kg），不存在漏選的現(xiàn)象。行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2058-2008[18]、SN/T 2059-2008[19]和SN/T 2060-2008[20]中也規(guī)定了使用酶聯(lián)免疫法檢測蜂王漿中氯霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素和泰樂菌素殘留的所需儀器、試劑和操作規(guī)范等。

2.3 放射受體分析法

該方法與酶聯(lián)免疫法類似，受體（具有特定氨基酸序列和構(gòu)型的蛋白質(zhì)） 可與使用放射性核素標(biāo)記的配體發(fā)生特異性結(jié)合，通過非標(biāo)記配體與標(biāo)記配體對(duì)受體的競爭關(guān)系，根據(jù)已知的非標(biāo)記配體濃度來推知待測樣品濃度[21]。

SN/T 2664-2010[22]中采用放射受體分析法檢測了蜂王漿中四環(huán)素類抗生素殘留，標(biāo)記配體為[3H]標(biāo)記的金霉素，將提取出的四環(huán)素類抗生素稀釋后與配體共同競爭結(jié)合特異的受體位點(diǎn)，經(jīng)反應(yīng)后加入閃爍劑測定β 粒子數(shù)放射性量值，計(jì)數(shù)cmp 值，該值與蜂王漿中四環(huán)素殘留呈反比。

3 展望

簡要綜述了幾種蜂王漿中抗生素殘留的檢測方法，其中高效液相色譜法在蜂王漿抗生素殘留的檢測中使用最為廣泛，可檢測絕大多數(shù)抗生素，精度高、出峰快。該方法的短板主要在于儀器的檢測器，高效液相色譜的檢測器大致可分為紫外檢測器、熒光檢測器、示差折光檢測器和質(zhì)譜儀幾種，其中紫外、熒光檢測器為選擇型檢測器，只對(duì)特定的待測樣品響應(yīng)，其他待測樣無響應(yīng)或響應(yīng)過小，不具備普適性；而且示差折光檢測器對(duì)樣品濃度具有較高要求，不能使用梯度洗脫；相較而言，質(zhì)譜儀更適合作為檢測器使用（這也是絕大多數(shù)的檢測方法或標(biāo)準(zhǔn)使用高效液相色譜-質(zhì)譜法的原因），但其價(jià)格昂貴，售價(jià)都在幾十萬元至上百萬元不等。目前關(guān)于酶聯(lián)免疫法和放射受體分析法檢測蜂王漿中抗生素殘留的研究相對(duì)較少。尤其是放射受體分析法，在國內(nèi)文獻(xiàn)中，目前筆者僅找到了使用該方法檢測四環(huán)素的相關(guān)文獻(xiàn)。