調(diào)控動(dòng)物生殖功能的lncRNAs研究進(jìn)展

李海玲,方富貴

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

LncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200 nt的RNA分子，既往被認(rèn)為是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，不具有生物學(xué)功能[1]。然而，近年來(lái)的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量的lncRNA參與調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育過程，其中包括細(xì)胞分化與凋亡過程、激素水平、器官發(fā)育、X染色體失活以及對(duì)基因組印記的調(diào)控[2]。但迄今為止，只有一小部分lncRNAs的功能與作用機(jī)制被闡明。如定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了lncRNA-Ftx通過上調(diào)MGC80-3細(xì)胞HK2促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[3]；通過直接調(diào)控miR-27a/Smurf1軸，Xist的下調(diào)可在體內(nèi)外減輕SCI模型的凋亡和炎癥損傷[4]；lncRNA LEGLTBC作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)miR-34a/ sirt1介導(dǎo)的糖毒性INS-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激和凋亡[5]。

目前已發(fā)現(xiàn)多種lncRNAs與動(dòng)物生殖功能息息相關(guān)。如一些lncRNAs與胚胎干細(xì)胞、精原干細(xì)胞等增殖分化和自我更新過程關(guān)系密切，還參與胚胎發(fā)育、卵子發(fā)生等過程，并在抑制乳腺癌、卵巢癌等生殖腫瘤過程中發(fā)揮重要作用[6]。因此，深入研究生殖系統(tǒng)中l(wèi)ncRNAs功能和機(jī)制將豐富我們對(duì)生殖系統(tǒng)發(fā)育、功能及其疾病的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也為相關(guān)藥物的研發(fā)提供新視角。本文主要綜述了已發(fā)現(xiàn)的與動(dòng)物生殖功能相關(guān)的lncRNAs及其作用機(jī)制，并對(duì)lncRNAs調(diào)控生殖的未來(lái)研究進(jìn)行展望，有助于理解lncRNA在動(dòng)物生殖調(diào)控中的功能與機(jī)制。

1 調(diào)控雄性動(dòng)物生殖的lncRNAs

在人、大鼠和小鼠特定發(fā)育階段的睪丸中已經(jīng)鑒定出許多l(xiāng)ncRNAs，其中一些lncRNAs的功能已經(jīng)被注釋和表征，例如睪丸特異性X連鎖基因(Testis specific x-linked，Tsx)，減數(shù)重組熱點(diǎn)基因(Meiotic recombination hot spot locus，Mrhl)和差異性甲基化區(qū)域(Differentially methylated region，Dmr)等，它們?cè)诓G丸發(fā)育和精子發(fā)生過程中發(fā)揮著重要的作用[2]。

1.1 Tsx

Tsx曾被認(rèn)為是一個(gè)位于染色體失活中心的蛋白質(zhì)編碼基因，但隨后被證明是一個(gè)lncRNAs，它的轉(zhuǎn)錄本在減數(shù)分裂中的生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞和腦組織中過表達(dá)[7]。小鼠和人類的X染色體失活需要存在一個(gè)cis作用位點(diǎn)，即X染色體失活中心(X-inactivation center，Xic)。這個(gè)位點(diǎn)控制X-染色體失活(X-chromosome inactivation，XCI)，并富含產(chǎn)生lncRNA的基因。在XCI過程中，上游位點(diǎn)Xite需要維持Tsx在未來(lái)活性X上的表達(dá)。Tsx位于Xite的正上游，其進(jìn)化前體為脊椎動(dòng)物的Fip112基因，由于其獨(dú)特的位置和進(jìn)化歷史，因此頗受關(guān)注[8]。

人和小鼠Tsx基因具有顯著的同源性，特別是在外顯子1、3、4、5和6中[9]。研究發(fā)現(xiàn)，Tsx突變雄性小鼠的睪丸體積明顯比野生型小，TUNEL分析顯示隨著動(dòng)物第一次進(jìn)行減數(shù)分裂，生殖細(xì)胞丟失，表明Tsx參與了雄性生殖細(xì)胞的發(fā)育；與此同時(shí)，Tsx在粗線期精母細(xì)胞中特異性表達(dá)，暗示其在生殖細(xì)胞減數(shù)分裂中具有一定的調(diào)控作用[7]。與在睪丸支持細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中的表達(dá)量相比，Tsx在粗線期精母細(xì)胞中表達(dá)量最高；同時(shí)TUNEL染色和突觸復(fù)合蛋白1(synaptonemal complex protein 1, SCP1)免疫熒光結(jié)合發(fā)現(xiàn)，小鼠Tsx基因敲除后，粗線期細(xì)胞的一個(gè)子集不適當(dāng)?shù)匕l(fā)生凋亡，敲除Tsx不影響減數(shù)分裂的XCI過程，提示Tsx在精子細(xì)胞中還有其他功能[10]。這些研究表明Tsx在精母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程中至關(guān)重要，但其具體作用機(jī)制還不清楚。

1.2 Mrhl

Mrhl全長(zhǎng)2.4 kb，它是從位于8.26號(hào)染色體減數(shù)分裂重組熱點(diǎn)位點(diǎn)(mrhl)的Phkb基因的第14個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來(lái)的，是一個(gè)多聚腺苷和未剪接的RNA轉(zhuǎn)錄本，表達(dá)于肝臟、腎臟、脾臟和睪丸[11]。Kataruka等[12]研究小組繪制了Mrhl RNA 的染色質(zhì)占用圖，并表明Mrhl調(diào)節(jié)幾種基因的表達(dá)，其中許多基因在精子發(fā)生以及Wnt信號(hào)傳導(dǎo)中起關(guān)鍵作用，其中的基因之一是Sox8，MrhlRNA與Sox8啟動(dòng)子的結(jié)合伴隨著其他調(diào)控因子的裝配，包括Myc-Max-Mad轉(zhuǎn)錄因子、輔抑制因子Sin3a和輔激活因子Pcaf。在Wnt信號(hào)中，Sox8直接調(diào)控減數(shù)分裂前期和減數(shù)分裂標(biāo)志物的表達(dá)。精原細(xì)胞中Wnt信號(hào)的延長(zhǎng)激活導(dǎo)致了整體染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變和干細(xì)胞標(biāo)志物水平的降低。2008年，Ganesan等研究發(fā)現(xiàn)Mrhl通過兩種分子機(jī)制調(diào)控精子發(fā)生。首先，在Drosha的作用下，Mrhl可被剪接成一個(gè)80 nt大小的中間體RNA，這些RNA位于GC1精原細(xì)胞系的細(xì)胞核內(nèi)，可能與染色質(zhì)相互作用[13]。其次，Mrhl通過與 Ddx5/p68蛋白相互作用實(shí)現(xiàn)負(fù)調(diào)控Wnt信號(hào)通路，這個(gè)信號(hào)通路在哺乳動(dòng)物精子發(fā)生至關(guān)重要[14]。當(dāng)Mrhl的表達(dá)下調(diào)時(shí)，酪氨酸磷酸化的p68蛋白從核內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到胞質(zhì)中，使β-連環(huán)蛋白(β-catenin)向核內(nèi)移位并且活化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子TCF4，形成β-連環(huán)蛋白-TCF4復(fù)合物，其與目標(biāo)基因啟動(dòng)子的Wnt反應(yīng)元件(Wnt responsive elements，WRE)相結(jié)合，通過招募共激活因子(co-activators)或共抑制因子(co-repressors)調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)。由于Wnt信號(hào)通路能夠?qū)е录?xì)胞分化，抑制細(xì)胞增殖，因此Mrhl在精原細(xì)胞的分裂和分化調(diào)控中發(fā)揮重要作用[15]。這些研究表明Mrhl對(duì)精原細(xì)胞的分裂和分化至關(guān)重要。仍需要對(duì)基因敲除小鼠進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以確定Mrhl在精子發(fā)生中的調(diào)節(jié)作用。

1.3 Dmr

Dmr是一種過表達(dá)于睪丸的lncRNA，其基因位于小鼠5號(hào)染色體的G2位點(diǎn)和大鼠12號(hào)染色體的p11處。張等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Dmr基因能夠與來(lái)自小鼠19號(hào)染色體的Dmrt1(Dsx-and Mab3-related transcription factor-1)基因反式剪接，形成新的Dmrt1-Dmr嵌合轉(zhuǎn)錄物，該轉(zhuǎn)錄物編碼一個(gè)羧基末端改變的蛋白質(zhì)。在原代支持細(xì)胞培養(yǎng)物中過表達(dá)Dmr增加了這種改變形式的Dmrt1蛋白的豐度，降低了Dmrt1亞型的豐度，并導(dǎo)致Dmrt1靶基因的表達(dá)受損，模擬了Dmrt1功能表型的喪失[17]。很明顯，反式剪接對(duì)Dmrt1有負(fù)調(diào)控作用；但不清楚的是，非典型亞型是否具有自身的調(diào)控活性。Dmrt1是一種保守的轉(zhuǎn)錄因子，可以通過上調(diào)精卵發(fā)生特異表達(dá)螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific basic helix-loop-helix 1，Sohlh1)以維持支持因子的周期性表達(dá)來(lái)促進(jìn)精原細(xì)胞發(fā)育，也可以通過抑制維甲酸(retinoic acid，RA)依賴性的視黃酸激活基因8(stimulated by retinoic acid gene 8，Stra8)因子的表達(dá)，從而間接抑制RA的轉(zhuǎn)錄以阻止精原細(xì)胞過早減數(shù)分裂[18]。Dmrt1在包括人類在內(nèi)的多種脊椎動(dòng)物和無(wú)脊椎動(dòng)物物種中被認(rèn)為與性別決定有關(guān)，并同時(shí)作為轉(zhuǎn)錄抑制因子和激活因子[17]。通過特異性敲除支持細(xì)胞中的Dmrt1基因，發(fā)現(xiàn)Dmrt1基因能夠通過影響支持細(xì)胞的成熟而影響精子發(fā)生[19]。由此可見，Dmr可通過調(diào)節(jié)Dmrt1來(lái)影響精母細(xì)胞的發(fā)生與發(fā)育。雄性超甲基化(male hypermethylated，MHM)是與家禽Z染色體相關(guān)的基因座，在雄性生殖細(xì)胞中被甲基化并在轉(zhuǎn)錄上沉默，但在雌性生殖細(xì)胞中甲基化程度較低并轉(zhuǎn)錄成長(zhǎng)鏈非編碼RNA。在雄性動(dòng)物中，MHM過表達(dá)會(huì)降低決定睪丸的基因Dmrt1的表達(dá)，導(dǎo)致胚胎死亡率增加[20]。但目前尚不清楚這些對(duì)比結(jié)果是由于特定分析系統(tǒng)的特殊性，還是反映了Dmr控制的調(diào)節(jié)范圍。

1.4 其 他

越來(lái)越多的lncRNAs被發(fā)現(xiàn)與精子發(fā)生緊密相關(guān)，并參與雄性生殖細(xì)胞增殖、分化的調(diào)控過程，如在精子成熟過程中發(fā)揮調(diào)控作用的lncRNA HongrES2[6]，對(duì)精原干細(xì)胞多能性和分化產(chǎn)生影響的lncRNA AK052984、lncRNA AK011429、lncRNA AK005651、lncRNA AK028326，對(duì)精原細(xì)胞分化產(chǎn)生影響的Spga lncRNA1和Spga lncRNA2，對(duì)精母細(xì)胞減數(shù)分裂產(chǎn)生影響的lncRNA Kcnqlot1和Air[21]。雖然在精子發(fā)生的特定階段有少數(shù)lncRNAs 的調(diào)控功能已得到確定，但還有很多與雄性生殖相關(guān)的lncRNAs及其具體的作用途徑和機(jī)制有待闡明。

2 調(diào)控雌性動(dòng)物生殖的lncRNAs

雌性生殖生物學(xué)的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多基因參與的過程，涉及到生殖嵴的發(fā)育、卵子發(fā)生、卵子成熟、卵子激活、胚胎發(fā)育等一系列生殖生物學(xué)事件[22]。隨著高通量測(cè)序及基因芯片技術(shù)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)越來(lái)越多的lncRNAs如Gtl2、核富含豐富的轉(zhuǎn)錄本1(Nuclear paraspeckle assembly transcript 1，Neat1)和母本印記表達(dá)轉(zhuǎn)錄本H19(imprinted maternally expressed transcript，H19)等在雌性生殖生物學(xué)發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色。

2.1 Gtl2

Gtl2是母本表達(dá)的長(zhǎng)非編碼RNA，位于鼠類12q染色體，其人源同系物Meg3基因在2000年被首次發(fā)現(xiàn)，定位于人類14號(hào)染色體14q32.2，長(zhǎng)度約為1.6 kb(GenBank NR-002766)[23]?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示Meg3由10個(gè)外顯子組成，并且可以通過可變剪切產(chǎn)生多種轉(zhuǎn)錄本[24]。在哺乳動(dòng)物中，DNA甲基化(DNA methylation)是一種關(guān)鍵的表觀遺傳修飾形式[25]。在小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，母源Dlk1與Gtl2基因間差異甲基化區(qū)域 (intergenic differentially methylated region，IG-DMR)發(fā)生去甲基化，可促進(jìn)lncRNA Gtl2的轉(zhuǎn)錄[26]。而lncRNA Gtl2可通過一些潛在的機(jī)制，如抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶的作用或招募DNA去甲基化因子(如Tet蛋白)等，使得 IG-DMR 處于非甲基化的狀態(tài)，導(dǎo)致Dlk1與Gtl2基因在不同親本中差異性表達(dá)，從而參與基因組印記的調(diào)節(jié)[27]。Dlk1-Gtl2印記位點(diǎn)位于小鼠12號(hào)染色體遠(yuǎn)端，由多個(gè)母系表達(dá)的lncRNA和多個(gè)父系表達(dá)的蛋白編碼基因組成，這個(gè)位點(diǎn)的印記在胚胎發(fā)育和產(chǎn)后生長(zhǎng)中起著至關(guān)重要的作用[26]。且對(duì)于Gtl2表達(dá)模式的研究多集中于小鼠，在小鼠中，Gtl2在胚胎發(fā)育中具有時(shí)空特異性和組織特異性表達(dá)，亞細(xì)胞定位多見于細(xì)胞核，Gtl2在小鼠E3.5 d即出現(xiàn)表達(dá)并且為印記表達(dá)[28]。2010年，哈佛醫(yī)學(xué)院研究組敲除Gt12第一外顯子到第五外顯子共5 kb區(qū)域進(jìn)行了研究試驗(yàn)[26]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，母本Gtl2缺失導(dǎo)致小鼠圍產(chǎn)期死亡和骨骼肌缺損，提示Gtl2在胚胎發(fā)育中起重要作用。同時(shí)母本Gtl2缺失也完全阻斷了下游母系表達(dá)基因的表達(dá)，導(dǎo)致IG-DMR甲基化。相比之下，父系遺傳缺失沒有這種效果。這些數(shù)據(jù)有力地表明，Gtl2及其下游母本基因的激活在調(diào)節(jié)Dlk1-Gtl2印記中起著重要作用，可能是通過維持IG-DMR的活性狀態(tài)。另有研究表明，Gtl2位點(diǎn)5'端的插入突變也會(huì)造成這一區(qū)間印記丟失[29]。研究中DNA甲基化是否在Gtl2表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮主要影響作用及其調(diào)控的具體作用機(jī)制仍有待闡明。

2.2 Neat1

Neat1是一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其在小鼠中的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度約3.2 kb。目前的研究主要發(fā)現(xiàn)其參與旁斑結(jié)構(gòu)的形成并且能與其他的蛋白質(zhì)-RNA復(fù)合體共同參與修飾和加工處理編碼蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄本等生物學(xué)過程[30]。目前，在人的胚胎干細(xì)胞里的研究結(jié)果顯示，Neat1主要通過RNA與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合體結(jié)構(gòu)來(lái)發(fā)揮功能。研究發(fā)現(xiàn)在未分化的人源胚胎干細(xì)胞中，Neat1缺乏且無(wú)法形成旁斑,Lin28(該基因?qū)τ诰S持干細(xì)胞多能性具有重要作用)可以在轉(zhuǎn)錄之后快速出核，翻譯產(chǎn)生干細(xì)胞維持所需要的Lin28蛋白質(zhì)，而在分化過程中，Neat1通過形成旁斑這一亞核結(jié)構(gòu)將Lin28mRNA滯留在亞核區(qū)，阻礙其出核翻譯表達(dá)，表明Neat1具有調(diào)控人源胚胎干細(xì)胞的命運(yùn)決定的重要作用[31]。Nakagawa等[32]發(fā)現(xiàn)排卵正常的Neat1敲除小鼠是隨機(jī)性不孕，單側(cè)移植野生型卵巢或黃體酮改變了表型，表明黃體功能障礙和低水平黃體酮是導(dǎo)致生育率下降的主要原因。盡管Neat1在大多數(shù)成人組織中表達(dá)微弱，但在黃體中高度表達(dá)。然而，近半數(shù)Neat1基因敲除小鼠的黃體組織嚴(yán)重受損[33]。Hupalowska等[34]研究發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物早期發(fā)育階段，合子中母本和合子Neat1 RNA的缺失導(dǎo)致16至32細(xì)胞階段的發(fā)育停滯，同時(shí)它的旁斑p54nrb的缺失也會(huì)導(dǎo)致16至32細(xì)胞周期的停滯，這與p54nrb基因敲除的胚胎致死率一致。Neat1受一種負(fù)性細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑p53的調(diào)控，研究從27名反復(fù)流產(chǎn)(recurrent miscarriage，RM)患者和配對(duì)的健康對(duì)照組中檢測(cè)出6種候選lncRNA在絨毛組織中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這些lncRNA的表達(dá)已被p53調(diào)節(jié)，而且RM患者組織樣本中的Neat1水平顯著降低[35]。這些結(jié)果提示Neat1對(duì)黃體形成和處于亞健康狀態(tài)的妊娠至關(guān)重要。

2.3 H19

LncRNAH19是母源等位基因中表達(dá)的印記基因，過表達(dá)于人胚胎發(fā)育階段，出生后表達(dá)下調(diào)，僅在骨骼肌和心肌中微量表達(dá)。H19是miRNA-675的前體，與胰島素樣生長(zhǎng)因子2 (insulin-likegrowthfactor-2，IGF2)反義。H19 lncRNA通過miRNA-675反式調(diào)控骨骼肌的分化和再生[36]。最近一項(xiàng)研究分析了H19在人滋養(yǎng)層細(xì)胞中的過度表達(dá)，并用CCK-8技術(shù)檢測(cè)了細(xì)胞增殖。然后，用基質(zhì)試劑通過transwell法檢測(cè)H19對(duì)人滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵襲能力。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)顯示，lncRNA-H19在早期自然流產(chǎn)患者絨毛組織和人工流產(chǎn)患者絨毛組織中過表達(dá)。此外，lncRNA-H19的上調(diào)抑制了HTR8/SV新滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖，lncRNA-H19的過表達(dá)表明HTR8/SVneo滋養(yǎng)層細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力降低。LncRNA-H19抑制早期胎盤生長(zhǎng)和早期營(yíng)養(yǎng)層細(xì)胞，可能導(dǎo)致早期自然流產(chǎn)[37]。胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)的嬰兒圍產(chǎn)期發(fā)病和死亡的風(fēng)險(xiǎn)較高，H19基因在胎盤絨毛中大量表達(dá)，其在妊娠晚期調(diào)控組織病理學(xué)異常反應(yīng)中起重要作用[38]。纖維組織可能導(dǎo)致一些子宮內(nèi)膜異位相關(guān)癥狀的起源，如慢性盆腔疼痛和不孕。H19/miR-216a-5p/ACTA2通路的改變可能介導(dǎo)了子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞(endometrial stromal cells，ESC)的侵襲和遷移，研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜異位癥患者的H19和α平滑肌肌動(dòng)蛋白(actin alpha 2，ACTA2)水平明顯高于對(duì)照組，且子宮內(nèi)膜異位癥患者的H19和ACTA2水平呈正相關(guān)。熒光素酶檢測(cè)表明，H19通過競(jìng)爭(zhēng)抑制miR-216a-5p結(jié)合位點(diǎn)來(lái)調(diào)控ACTA2的表達(dá)[39]。這些研究表明H19在滋養(yǎng)層細(xì)胞的生殖及運(yùn)動(dòng)能力與胚胎發(fā)育中起調(diào)控作用，具體的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

2.4 其他

目前報(bào)道的其他與雌性生殖有關(guān)的lncRNAs還有：在妊娠后動(dòng)物乳腺的發(fā)育及泌乳過程產(chǎn)生影響的lncRNA Pinc[40]，在卵巢發(fā)育過程起作用的lncRNA lncov1、lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274，對(duì)卵母細(xì)胞成熟和胚胎發(fā)育產(chǎn)生影響的lncRNA AK124742[41]，和在山羊初情期中特異性表達(dá)的lncRNA XLOC_777127、lncRNA XLOC_113511、lncRNA XLOC_446331[42]。目前這些lncRNAs的了解主要來(lái)自測(cè)序，有些僅證明與表型相關(guān)，對(duì)生殖活動(dòng)方面的調(diào)控功能以及具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究證實(shí)。

3 展 望

綜上所述，目前已發(fā)現(xiàn)許多對(duì)調(diào)控精子發(fā)生、減數(shù)分裂、胚胎發(fā)育等生殖方面都有重要作用的lncRNAs。但有關(guān)調(diào)控生殖功能的lncRNAs研究才剛剛起步，仍有很多問題需要闡明：(1) 對(duì)lncRNA的研究主要集中于人和小鼠方面，與家畜繁殖相關(guān)的 lncRNA方面涉及較少；(2)生殖相關(guān)方面的 lncRNAs需進(jìn)一步拓展；(3)一些具有調(diào)控生殖功能的lncRNAs具體作用途徑和機(jī)制仍不清楚；(4)很多新發(fā)現(xiàn)與生殖有關(guān)的lncRNAs調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。