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    馬鈴薯細(xì)菌性病害及防治研究進(jìn)展

    2021-12-05 12:24:13曹貞菊陳明俊羅小波雷尊國(guó)
    中國(guó)馬鈴薯 2021年3期
    關(guān)鍵詞:軟腐病噬菌體塊莖

    曹貞菊,陳明俊,羅小波,尹 旺,雷尊國(guó),李 飛

    (貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所/貴州省馬鈴薯工程技術(shù)研究中心,貴州 貴陽(yáng) 550006)

    馬鈴薯(Solanum tuberosum L.)是人類(lèi)消費(fèi)的第一大非谷類(lèi)糧食作物,在保障發(fā)展中國(guó)家糧食安全方面具有巨大潛力[1]。目前,全球馬鈴薯種植面積超過(guò)1 900 萬(wàn)hm2,年產(chǎn)量約為3.88 億t。在中國(guó)和印度,約有13億人以新鮮馬鈴薯為主食,每人每年消費(fèi)約50 kg[2]。自2006年農(nóng)業(yè)部提出馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃以來(lái),中國(guó)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)逐年穩(wěn)步發(fā)展。但隨著馬鈴薯種植面積的擴(kuò)大,各類(lèi)病害也隨之而來(lái)。造成馬鈴薯葉片和塊莖損傷的病原體有病毒、真菌、線蟲(chóng)、昆蟲(chóng)、細(xì)菌等40多種[3-5]。這些病害對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)系統(tǒng)造成高達(dá)22%的直接或間接損失,并嚴(yán)重影響馬鈴薯塊莖的質(zhì)量和產(chǎn)量[6]。本文綜述了馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病和環(huán)腐病的發(fā)生特點(diǎn)和國(guó)內(nèi)外防治研究進(jìn)展,并就存在的問(wèn)題提出相應(yīng)的對(duì)策和建議。

    1 馬鈴薯軟腐病

    1.1 發(fā)生特點(diǎn)

    馬鈴薯軟腐病主要是由果膠桿菌屬Pectobacterium spp.和迪基氏桿菌屬Dickeya spp.細(xì)菌引起[7]。該病廣泛分布于中國(guó)馬鈴薯各優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū),嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和質(zhì)量。根據(jù)發(fā)病時(shí)期的不同,習(xí)慣將田間生育期引起馬鈴薯植株地下莖、塊莖和地上莖基部組織產(chǎn)生黑色腐爛癥狀的病害稱(chēng)為黑脛?。粚①A運(yùn)期造成馬鈴薯塊莖腐爛癥狀的病害稱(chēng)為軟腐病[8]。

    軟腐病主要是由果膠桿菌屬Pectobacterium spp.細(xì)菌分泌的果膠酶引起的,這些果膠酶降解植物中膜層和細(xì)胞壁中的果膠,破壞植物細(xì)胞壁,導(dǎo)致植物組織潮濕、腐爛并有惡臭[9]。病原菌往往不能完全降解細(xì)胞壁,因此,在浸軟的組織中仍然可以看到細(xì)胞輪廓。病原菌大量存在木質(zhì)部時(shí),可導(dǎo)致維管組織壞死。軟腐病通常發(fā)生于植物塊莖、根莖和鱗莖中,也可以發(fā)生在肉質(zhì)的植物組織中,如多汁的莖和葉,或葉子緊湊的蔬菜中,如生菜頭[10]。

    無(wú)論是由Pectobacterium spp.或Dickeya spp.引起的馬鈴薯塊莖軟腐病和黑脛病的癥狀都是相似的。在潮濕條件下病變從母塊莖向上移動(dòng)到莖稈,使塊莖和莖呈黏糊狀,并使其潮濕、腐爛。當(dāng)條件干燥時(shí),癥狀表現(xiàn)為莖、葉發(fā)育不良,發(fā)黃和枯萎[11]。土壤、病殘?bào)w、帶菌種薯和飛蟲(chóng)攜帶的病原菌是軟腐病重要的初侵染源[12,13]。通過(guò)接觸,健康塊莖極易被感染,并形成半流奶油狀物質(zhì),這些物質(zhì)在空氣中被氧化后會(huì)變黑,進(jìn)而產(chǎn)生腐爛難聞的魚(yú)腥味。軟腐病癥狀一旦出現(xiàn),就會(huì)迅速發(fā)展。當(dāng)條件適宜時(shí),接觸病原菌的塊莖會(huì)在2~3 d內(nèi)腐爛,而感染的植物在萎蔫癥狀出現(xiàn)后數(shù)小時(shí)內(nèi)死亡[14]。

    1.2 防治措施

    1.2.1 農(nóng)業(yè)防治

    軟腐病原體常見(jiàn)于環(huán)境中,特別是灌溉用水中,目前還沒(méi)有辦法消除木質(zhì)部或皮孔內(nèi)軟腐病原菌[9]。因此,軟腐病害控制很大程度上依賴(lài)預(yù)防。帶病種薯是馬鈴薯黑脛病和軟腐病的主要初染源,要嚴(yán)格對(duì)馬鈴薯種薯進(jìn)行專(zhuān)業(yè)認(rèn)證和分級(jí)來(lái)保證種薯質(zhì)量,并在種植、噴灑、捆莖、收割和分級(jí)貯藏時(shí),通過(guò)清洗和使用消毒機(jī)器清理等措施來(lái)進(jìn)行防控。例如,發(fā)苗期發(fā)現(xiàn)感病,及時(shí)處理發(fā)病植株和母薯,避免感染其他健康植株。收獲時(shí),對(duì)種薯的薯塊進(jìn)行嚴(yán)格分級(jí),及時(shí)清理掉帶病或有傷口薯塊。貯藏時(shí)控制貯藏溫度,低溫但不使薯塊結(jié)冰可有效阻止病原菌的入侵及繁殖。分級(jí)貯藏時(shí),需及時(shí)烘干薯塊表面,通入冷風(fēng)長(zhǎng)期貯藏,要防止溫度過(guò)高使薯塊發(fā)芽。Rutolo等[15]研究報(bào)告了在實(shí)驗(yàn)室和商業(yè)貯藏條件下,利用一系列氣體傳感器(特別是金屬氧化物、電化學(xué)、光電離和非色散紅外)對(duì)軟腐病菌進(jìn)行監(jiān)測(cè)。結(jié)果表明,大量的氣體傳感器對(duì)軟腐病的早期檢測(cè)有較高的準(zhǔn)確性。此外,合理施用鈣肥和氮肥也能有效降低Pectobacterium spp.和Dickeya spp.導(dǎo)致的植物軟腐病[16,17]。

    在育種方面,科學(xué)家們也做了一系列研究。Lebecka 和Michalak[18]評(píng)價(jià)了11 個(gè)馬鈴薯品種(‘Bryza’‘Denar’‘Glada’‘Irys’‘Jelly’‘Mieszko’‘Owacja’‘Satina’‘Sonda’‘Tajfun’和‘Vineta’)對(duì)馬鈴薯軟腐病菌D.solani的抗性,其中抗性最強(qiáng)的品種是‘Mieszko’‘Tajfun’和‘Sonda’。Lebecka和Czarniak[19]測(cè)試了10個(gè)馬鈴薯品種‘Brooke’‘Glada’‘Hermes’‘Irys’‘Lady Claire’‘Lady Rosetta’‘Omega’‘SmithComet’‘Verdi’和‘VR808’對(duì)D.solani和P.brasiliense sp.nov的抗性,發(fā)現(xiàn)‘Lady Rosetta’和‘Brooke’栽培品種的腐爛程度比‘Hermes’‘Lady Claire’和‘VR808’嚴(yán)重。Lebecka等[20]用26個(gè)已篩選出具P.atrosepticum抗性的二倍體雜交種,通過(guò)塊莖和黑脛反應(yīng),對(duì)高侵染性菌株D.solani進(jìn)行抗性篩選。有24個(gè)二倍體無(wú)性系在接種該菌后的塊莖反應(yīng)與已證明有Pectobacterium抗性的USA 249[短鏈球菌(+)馬鈴薯的體細(xì)胞雜種]無(wú)明顯差異;有17個(gè)無(wú)性系在抗黑脛病方面顯著優(yōu)于抗黑脛病品種‘Glada’。選定的二倍體中有11 個(gè)產(chǎn)生未減數(shù)配子(2n 配子),可用于提高四倍體馬鈴薯對(duì)Pectobacterium和Dickeya抗性。

    1.2.2 化學(xué)防治

    化學(xué)防治是最快速、有效殺滅病原菌的方法。目前,已開(kāi)發(fā)多種化學(xué)藥劑用于控制由Pectobacterium spp.和Dickeya spp.導(dǎo)致的馬鈴薯軟腐病和黑脛病。使用的大多數(shù)化學(xué)藥劑含有抗生素(主要是鏈霉素及其衍生物)、有機(jī)鹽和無(wú)機(jī)鹽等藥劑組合物。采用農(nóng)用鏈霉素進(jìn)行種薯處理是生產(chǎn)中應(yīng)用較為普遍的馬鈴薯黑脛病、軟腐病防控技術(shù)手段。種植前,將馬鈴薯塊莖浸泡在鏈霉素、次氯霉素或鏈霉素/汞化合物的混合物中,可以降低黑脛病和軟腐病發(fā)生率。用卡蘇加霉素、維吉尼亞霉素代替鏈霉素或使用殺菌劑(乙酸、硼酸和漂白粉)時(shí)也得到了類(lèi)似的結(jié)果[21]。此外,梁歡等[7]研究表明3%噻霉酮WP、20%葉枯唑WP和0.3%四霉素對(duì)馬鈴薯軟腐病具有較好的防控效果。但隨著農(nóng)業(yè)中使用合成化合物,包括抗生素的增多,會(huì)對(duì)人類(lèi)和環(huán)境造成危害,也會(huì)導(dǎo)致抗菌素耐藥性的產(chǎn)生[22]。隨著2017年農(nóng)用鏈霉素全面退市,篩選高效、低毒和低殘留的農(nóng)用鏈霉素替代殺菌劑成為馬鈴薯生產(chǎn)上亟待解決的問(wèn)題。

    1.2.3 生物防治

    生物防治策略包括利用拮抗菌株與病原菌之間的拮抗作用來(lái)抑制病原菌。這是防治植物病害中最有潛力和有效途徑之一,也是抗馬鈴薯病害生物農(nóng)藥研發(fā)的重要手段。但是,目前的防治應(yīng)用大多數(shù)集中在抑制活性上,對(duì)代謝產(chǎn)物中有效成分的分離提取研究報(bào)道較少。Youdkes等[23]測(cè)試了一種存在于陸生和水生環(huán)境中的小型、活躍細(xì)菌捕食者蛭弧菌(Bdellovibrio)及其類(lèi)似菌(BALOs)來(lái)控制馬鈴薯軟腐病。BALOs菌株HD100、109J和merRNA可以有效地捕食各種致病菌株 Dickeya spp.和Pectobacterium spp.,所有BALOs菌株都能有效降低軟腐病發(fā)生,甚至達(dá)到完全預(yù)防。Sana等[24]鑒定了一株具有強(qiáng)拮抗活性的、能產(chǎn)類(lèi)糖脂化合物的解淀粉芽孢桿菌菌株Ar10對(duì)軟腐菌的生物防治。用菌株Ar10 處理馬鈴薯塊莖72 h 后,病害癥狀明顯減輕(壞死深度/面積減少100%,重量減輕85.05%)。用發(fā)酵上清液處理馬鈴薯塊莖1 h后,也呈現(xiàn)出相同效果。Gerayeli等[25]從馬鈴薯根際分離鑒定出對(duì)馬鈴薯軟腐病有防治潛力的短小芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,對(duì)Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(Pcc)的防治效果為63.7%和47.8%。Hadizadeh等[26]使用TaqMan 實(shí)時(shí)PCR 研究馬鈴薯內(nèi)生菌Serratia plymuthica A30對(duì)馬鈴薯黑脛病致病菌Dickeya solani的拮抗性,結(jié)果表明該拮抗菌能使軟腐病發(fā)病率降低58.5%,并能以潛伏感染的形式傳給后代。采收后用生防劑處理馬鈴薯塊莖可降低貯藏期間軟腐病的嚴(yán)重程度,并可預(yù)防大田栽培過(guò)程中軟腐菌從母塊莖向后代傳播。Maciag等[27]建立了一個(gè)由5株拮抗細(xì)菌組成的人工組合“五大拮抗菌”(GF)菌群,分別為:Plyratia strain A294、Enterobacter amnigenus strain A167、Rahnella aquatilis strain H145、Serratia rubidaea strain H440和S.rubidaea strain H469。開(kāi)發(fā)了由這5種拮抗菌組成的液體和粉末制劑,通過(guò)與病原菌混合處理馬鈴薯塊莖,發(fā)現(xiàn)軟腐病的嚴(yán)重性和發(fā)病率各降低62.75%和48.61%。Salem 和Abd El-Shafea[28]研究了枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis),熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescence),銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和鏈霉菌(Streptomyces spp.)4 種生物制劑對(duì)2 種軟腐病原菌Erwinia carotovora subsp.carotovora(Ecc1 和Ecc2)進(jìn)行拮抗分析,發(fā)現(xiàn)鏈霉菌屬對(duì)Ecc1和Ecc2具有最強(qiáng)的抑制作用,其次是熒光假單胞菌,枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌。同時(shí),使用生物制劑可降低菌株Ecc1和Ecc2的病害嚴(yán)重程度。

    此外,許多植物提取物,如萜烯、生物堿、類(lèi)黃酮等成分都具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)或抑菌活性,這些提取物具有低毒性、殘留少、污染少等優(yōu)點(diǎn),目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者在這方面已經(jīng)開(kāi)展了較多研究工作。Sampietro 等[29]從阿根廷西北部提取具抗菌活性的富含黃酮類(lèi)化合物的蜂膠,能有效地降低E.carotovora subsp.引起的馬鈴薯軟腐病的發(fā)生率和嚴(yán)重程度。Habibeh等[30]發(fā)現(xiàn)植物天然化合物新型香精油(EOs)在體外和體內(nèi)條件下均能有效防治軟腐病。Ndivo等[31]研究了印度楝樹(shù)(Azadirachta indica M.)、大蒜(Allium sativum M.)和蘆薈(Aloe secundiflora Engl.)提取物對(duì)馬鈴薯品種‘Kenya Mpya’‘Sherekea’和‘Purple Gold’軟腐菌生長(zhǎng)的影響,所有提取物處理塊莖腐爛程度均顯著降低。其中大蒜的抑菌效果最高,蘆薈的抑菌效果最低。Shaheen和Issa[32]采用高效液相色譜法測(cè)定了駱駝蓬種子總生物堿提取物(TAE)對(duì)4 種植物病原菌(Ralstonia solanacearum system II、Erwinia amylovora、Pectobacterium carotovorum subsp.和Burkholderia gladioli)的體外抑菌活性。結(jié)果表明300 μg/mL 的濃度提取物顯示出最好的軟腐病菌抑制效果。

    1.2.4 噬菌體防治

    Mallmann和Hemstreet[33]于1924年首次發(fā)現(xiàn)了與植物病原菌相關(guān)的噬菌體,當(dāng)時(shí)他們分析證明了白菜濾液能抑制引發(fā)白菜腐爛病原菌Xanthomonas campestris pv.的生長(zhǎng)。Moore[34]提出可以利用噬菌體作為病害控制劑。此后不久,噬菌體成功用于預(yù)防由Erwinia carotovora subsp.引起的馬鈴薯塊莖腐爛病[35]。盡管早期結(jié)果令人鼓舞,但噬菌體治療法并未被證明是一種可靠且有效的植物病害控制方法[36-39]。

    近年來(lái),使用噬菌體作為生物防治劑來(lái)靶向預(yù)防植物病原獲得了越來(lái)越多的關(guān)注[40,41]。噬菌體是一種細(xì)菌病毒,其能特異地侵入和溶解細(xì)菌細(xì)胞,從而有效減少細(xì)菌數(shù)量[42],對(duì)真核細(xì)胞沒(méi)有直接負(fù)面影響。感染后,溶菌噬菌體進(jìn)行快速?gòu)?fù)制,隨后溶解宿主細(xì)胞,并釋放大量子代病毒到環(huán)境中[40]。當(dāng)細(xì)菌數(shù)量較多且環(huán)境條件有利時(shí),噬菌體感染會(huì)導(dǎo)致其數(shù)量顯著增加。一個(gè)好的噬菌體混合物在控制植物病原細(xì)菌方面非常有效,并且在化學(xué)藥劑失去效力后仍能長(zhǎng)期發(fā)揮作用[43,44]。與其他控制措施相比,這是一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)。噬菌體的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是他們可以感染抗生素或重金屬抗性細(xì)菌[40]。

    Voronina 等[45]確定了一種新的自噬病毒亞科Phimunavirus 屬的一個(gè)獨(dú)立系統(tǒng)發(fā)育分支的podovirus PP16噬菌體,能廣泛感染馬鈴薯軟腐病和黑脛病菌株。噬菌體PP16在植物體內(nèi)外均能有效侵染細(xì)菌。田間試驗(yàn)表明,用噬菌體PP16 處理種薯后,植株萌發(fā)率顯著提高。Byth等[46]分離鑒定了29種對(duì)軟腐病致病菌有毒力的噬菌體,選取其中6種形成噬菌體“雞尾酒”。對(duì)多種致病菌進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明噬菌體“雞尾酒”裂解93%的測(cè)試菌株,使軟腐病發(fā)生率和嚴(yán)重程度分別降低61%和64%。Peter等[47]從中國(guó)武漢收集的土壤和水樣中分離出的11個(gè)噬菌體,用于侵染從肯尼亞納庫(kù)魯縣分離出引起馬鈴薯軟腐病癥狀P.carotovorum病原菌,結(jié)果表明噬菌體濃度和施用時(shí)間是有效控制軟腐病的關(guān)鍵因素。在接種病原菌之前或之后1 h內(nèi),以1×109噬菌斑形成單位(PFU)/mL的濃度施用噬菌體,可使軟腐病癥狀降低90%。

    1.2.5 其他防治方法

    納米顆粒也是一種很有前景的抗菌劑,如銀納米結(jié)構(gòu)(AgNPs),其已被證明可以殺滅650 種致病菌、真菌和病毒,并可與其他拮抗細(xì)菌結(jié)合[22]。Anna 等[48]使用dc-APGD合成了由果膠(Pectin,PEC)或十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS)穩(wěn)定的PEC-AgNPs 和SDS-AgNPs,并測(cè)試其對(duì)Dickeya spp.和Pectobacterium spp.的抑菌活性,其最低抑菌濃度分別為5.5和0.753 mg/L。Hossain等[49]利用假單胞菌無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)上清液綠色合成AgNPs,顯示出對(duì)D.dadantii生長(zhǎng)、游動(dòng)、生物膜形成和塊莖浸軟的抗菌活性。AgNPs(12 g/mL)和AgNO3(50 g/mL)具有較強(qiáng)的抗菌活性,抗菌活性隨AgNPs濃度的增加而增加。

    此外,群體感應(yīng)(Quorum sensing,QS),也可能成為控制植物病原菌的一種潛在策略。細(xì)菌的通訊系統(tǒng)是由化學(xué)信號(hào)分子介導(dǎo)的,這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為群體感應(yīng),這一過(guò)程的滅活稱(chēng)為群體淬滅(Quorum quenching,QQ)。其通過(guò)抑制信號(hào)合成,檢測(cè)酶催化降解以及修飾信號(hào)來(lái)干擾QS。N-?;呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl-homoserine lactones,AHLs)代表了一系列廣泛保守的QS信號(hào),涉及許多革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌病原體中毒力因子的產(chǎn)生。Alinejad等[50]研究鑒定QQ細(xì)菌作為Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(Pcc)病原菌的生物防治劑,在存有γ-己內(nèi)酯(Gamma-caprolactone,GCL)情況下,從根際分離獲得能降解?;?高絲氨酸內(nèi)酯信號(hào)分子的分離株,根據(jù)其表型特征和16S rRNA測(cè)序分析,這些分離株被鑒定為Pseudomonas,Bacillus 和Erwinia,并引入了根際假單胞菌Pseudomonas rhizosphaerae 作為QQ 藥劑。對(duì)照于接種Pcc,接種Bacillus pumilus,Pseudomonas fluorescens 和Pseudomonas sp.的馬鈴薯塊莖軟腐病降低了98%。Fan等[51]分離了可降解AHL的細(xì)菌菌株,并評(píng)估了最有效的菌株對(duì)抗QS介導(dǎo)的病原體的潛力。結(jié)果顯示,在蘿卜和馬鈴薯切片上,降解AHL的細(xì)菌Ochrobactrum intermedium D-2可有效抑制病原菌Pectobacterium carotovorum subsp.carotovorum(Pcc)的生長(zhǎng)。

    2 馬鈴薯環(huán)腐病

    2.1 發(fā)生特點(diǎn)

    馬鈴薯環(huán)腐病是由Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(Cms)引起的造成重大經(jīng)濟(jì)損失的一種檢疫性病害。Clavibacter michiganensis(Cm)是革蘭氏陽(yáng)性需氧棒狀桿菌,沒(méi)有菌絲也不產(chǎn)孢子,主要存在于木質(zhì)部維管中,能引起萎蔫、莖潰爛、維管變色等系統(tǒng)性癥狀[52]。Cm又根據(jù)宿主特異性、生化和遺傳特征分為6個(gè)亞種。Cm.subsp.sepedonicus(Cms)侵染馬鈴薯;Cm.subsp.michiganensis(Cmm)感染番茄,Cm.subsp.nebraskensis(Cmn)誘導(dǎo)玉米萎蔫病和枯萎?。籆m.subsp.tessellarius(Cmt)引起小麥斑點(diǎn)??;Cm.subsp.insidiosus(Cmi)引起紫花苜蓿的萎蔫和發(fā)育不良;Cm.subsp.phaseoli(Cmp)引起菜豆細(xì)菌性系統(tǒng)病害[53]。Cmm、Cms和Cmi均受?chē)?yán)格檢疫控制[52]。該菌典型的毒力因子包括胞外纖維素酶、敏感反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白、分泌酶和胞外多糖等[54]。除Cms外,其他亞種由于類(lèi)胡蘿卜素的存在而被染成黃色到橙色,并且通常由于胞外多糖的產(chǎn)生而顯現(xiàn)出黏液菌落形態(tài)[52]。

    馬鈴薯環(huán)腐病病原體既存在于植物內(nèi)部,也存在于土壤中。其癥狀一般在生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)出現(xiàn)。首先表現(xiàn)為葉片褪綠,顏色變淺,莖葉萎蔫直至黃化枯死??菟篮笄o稈為綠色,葉片黃化但不脫落,維管束變?yōu)辄S褐色。塊莖上由于維管組織破壞,而有棕色的裂縫,邊緣是紅色的[55],切開(kāi)病薯塊莖并擠壓時(shí),有奶酪狀物質(zhì)從維管環(huán)中流出,并伴有揮發(fā)性氣味散出。Blasioli等[56]研究發(fā)現(xiàn)Cms釋放出揮發(fā)性化合物為2-丙醇和3-甲基丁酸,主要來(lái)源于細(xì)菌代謝中的氨基酸降解、碳水化合物和脂肪酸氧化。在馬鈴薯塊莖中,病原菌代謝會(huì)改變健康薯塊散發(fā)的揮發(fā)性化合物模式。此外,Cms 病害是潛伏性的,即使無(wú)癥狀也能感染。

    2.2 防治措施

    2.2.1 農(nóng)業(yè)防治

    Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus(Cms)是一種不易控制的病原菌,其傳播的一個(gè)重要原因是帶病種薯。防治馬鈴薯環(huán)腐病最有效的農(nóng)業(yè)防治方法之一是通過(guò)對(duì)病原菌進(jìn)行早期檢測(cè),這在馬鈴薯生產(chǎn)、加工和分配中尤為重要。然而,Cms通常在低濃度下也能生存,可導(dǎo)致病原菌在馬鈴薯中潛伏數(shù)代。因此,為了達(dá)到可靠、靈敏的馬鈴薯環(huán)腐病檢測(cè)需求,歐洲和地中海植物保護(hù)組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)委員會(huì)建議使用至少兩種基于不同生物學(xué)特性的診斷測(cè)試,包括致病性測(cè)試和適當(dāng)?shù)纳?、生化、血清學(xué)或分子檢測(cè)[57]。一些血清學(xué)方法,如免疫熒光法(Immunofluorescence assay,IFA)和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于檢測(cè)Cms。然而,血清學(xué)方法由于低靈敏度和會(huì)導(dǎo)致交叉污染而受到一定限制。單克隆方法的應(yīng)用顯著提高了免疫熒光分析型血清實(shí)驗(yàn)的特異性,但會(huì)導(dǎo)致靈敏性降低、成本升高。為了促進(jìn)檢測(cè)工作,Przewodowski和Przewodowska[58]使用3株不同酸性細(xì)菌胞外多糖(Extracellular polysaccharides,EPS)水平的Cms菌株混合產(chǎn)生抗原,開(kāi)發(fā)具有免疫特性的多克隆兔抗Cms IgG抗體,無(wú)論其EPS水平如何,均可通過(guò)免疫方法檢測(cè)Cms。這種新抗體使Cms的免疫診斷更加敏感可靠,并且這種抗體可以用于許多類(lèi)型的免疫分析。

    近年來(lái),基于DNA的分子方法已廣泛應(yīng)用于植物病原的診斷?;贒NA的PCR方法高度敏感,但不具備現(xiàn)場(chǎng)簡(jiǎn)便診斷,尤其是需要在嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行。接著科學(xué)家們開(kāi)發(fā)了基于DNA的檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法為田間應(yīng)用提供了便利。由于其獨(dú)特的引物設(shè)計(jì),可以比傳統(tǒng)的擴(kuò)增方法在更短的時(shí)間內(nèi)創(chuàng)造出更多的擴(kuò)增產(chǎn)物,而不需要一個(gè)溫度循環(huán),并且可以在不需要實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的情況下使用簡(jiǎn)單的加熱器進(jìn)行應(yīng)用。Sagcan和Kara[59]優(yōu)化了Cms病原菌的LAMP檢測(cè)方法。采用了比色法和橫向側(cè)流試驗(yàn)條(Lateral flow device,LFD)法對(duì)陽(yáng)性樣品進(jìn)行檢測(cè),不需要任何成像設(shè)備。通過(guò)簡(jiǎn)單的DNA分離方法和反應(yīng)混合物的凍干,可以得到一種適合現(xiàn)場(chǎng)研究的方法。

    2.2.2 化學(xué)防治

    目前已開(kāi)發(fā)了很多化學(xué)源性的藥劑用于馬鈴薯環(huán)腐病害防控。播種前用農(nóng)用鏈霉素、甲基托布津和滑石粉混合拌種;發(fā)病期用硫酸鏈霉素、25%絡(luò)氨銅水劑500 倍液、50%百菌通可濕性粉劑400 倍液、或47%加瑞農(nóng)可濕性粉劑700倍液等藥劑進(jìn)行處理。另外,化學(xué)殺菌劑如漂白劑、季銨鹽、高錳酸鉀、硫酸銅、二氧化氯、碘和含酚化合物也能達(dá)到控制Cms的效果[60]。Alla等[60]研究了系統(tǒng)除草劑二氯苯氧乙酸(2,4-D)、敵草?。―iuron)、草甘膦(Glyphosate)、二氯吡啶酸(Clopyralid)、三氟硝草醚(Fluorodifen),以及商品制劑“青金石”(Lazurite)、“利多米金”(Ridomil Gold)和線粒體抑制農(nóng)藥類(lèi)似物單碘乙酸鈉等農(nóng)藥對(duì)Cms生物膜形成的影響。結(jié)果表明,接觸單碘乙酸鈉和青金石制劑后,Cms生物膜形成減少,這可能是由于這些制劑的殺菌作用。2,4-D和利多米金制劑促進(jìn)生物膜的形成。系統(tǒng)除草劑敵草隆、草甘膦、二氯吡啶酸、三氟硝草醚對(duì)細(xì)菌生物膜形成過(guò)程無(wú)明顯影響。

    2.2.3 生物防治

    馬鈴薯Cms病害是在植物生長(zhǎng)過(guò)程中以馬鈴薯莖枯萎的形式出現(xiàn),也是細(xì)菌細(xì)胞在莖內(nèi)聚集形成生物膜的結(jié)果。利用以天然化合物為基礎(chǔ)的制劑,開(kāi)發(fā)有效、安全的馬鈴薯Cms防治方法是很有前途的。Jin等[61]研究了海帶提取物對(duì)Cms的抑菌活性,所有十九個(gè)分級(jí)分離物均對(duì)Cms有抑菌活性,而三級(jí)分離物(Fr.3)的抗菌活性最高,其主要成分是烷烴、酯、酸和醇,結(jié)果表明,海帶提取物對(duì)Cms有抑菌潛力。高以宸等[62]用紅蓼揮發(fā)油植物源殺菌劑處理馬鈴薯種薯和幼苗,分析對(duì)Cms的防治效果,結(jié)果顯示種薯各項(xiàng)發(fā)芽指標(biāo)均顯著增加,馬鈴薯幼苗各生長(zhǎng)指標(biāo)及各葉綠素含量均顯著高于對(duì)照組,病情指數(shù)顯著低于對(duì)照組,且稀釋0~80倍的該殺菌劑也能達(dá)到同樣的效果。

    此外,納米復(fù)合材料生物制劑也有很好的Cms防治效果。Perfileva等[63]研究從藥用大擔(dān)子菌靈芝、豬苓、硫酸菌、香菇和平菇中提取的硒復(fù)合材料對(duì)Cms的活力和生物膜形成能力的影響。Cms與生物復(fù)合材料共同孵育后,細(xì)菌細(xì)胞活性受到損害。其中以香菇和靈芝的胞外代謝產(chǎn)物為基礎(chǔ)的生物復(fù)合物活性最高。將真菌來(lái)源的生物聚合物添加到細(xì)菌懸浮液中后發(fā)現(xiàn)Cms形成生物膜的能力明顯依賴(lài)于生物復(fù)合類(lèi)型,在許多情況下,Cms形成生物膜的能力大大降低。Perfileva等[64]又發(fā)現(xiàn)以阿拉伯半乳聚糖(Se/AG)和淀粉(Se/St)為基質(zhì)的硒納米復(fù)合材料(NC):Se/AG NC(含6.4%的硒)和Se/St NC(含12.0%的硒)對(duì)馬鈴薯植株的健康和Cms侵染均無(wú)不良影響,但對(duì)其生長(zhǎng)、葉片數(shù)量和營(yíng)養(yǎng)成分均有促進(jìn)作用。Se/AG NC通過(guò)增加活性氧含量和增加過(guò)氧化物酶活性來(lái)提高馬鈴薯植株的免疫狀態(tài),從而對(duì)馬鈴薯植株產(chǎn)生了有利影響。并且已經(jīng)證明經(jīng)過(guò)納米復(fù)合材料殺菌處理后,該納米復(fù)合材料不會(huì)在馬鈴薯植株中存留,表明Se/AG NC和Se/St NC可作為潛在藥劑用于Cms的防治。

    3 研究展望

    自2015年馬鈴薯主食化戰(zhàn)略實(shí)施以來(lái),馬鈴薯產(chǎn)量逐年增加。據(jù)統(tǒng)計(jì),中國(guó)是世界馬鈴薯總產(chǎn)量最多的國(guó)家。2019 年中國(guó)馬鈴薯種植面積達(dá)到478.95 萬(wàn)hm2,單位面積產(chǎn)量達(dá)到19 139.7 kg/hm2,總產(chǎn)量為9 193.8 萬(wàn)t,占全球總產(chǎn)量的24.91%[65]。馬鈴薯兼具食用、加工、飼料等功能,有助于改善和豐富中國(guó)人民的營(yíng)養(yǎng)膳食結(jié)構(gòu)。馬鈴薯細(xì)菌性軟腐病和環(huán)腐病是馬鈴薯生產(chǎn)中的重要病害,嚴(yán)重阻礙馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展。即使近年來(lái)有很多新技術(shù)、新方法研究有助于馬鈴薯農(nóng)業(yè)綜合管理和實(shí)踐,但病害的發(fā)生導(dǎo)致馬鈴薯減產(chǎn)嚴(yán)重。因此,尋找馬鈴薯軟腐病和環(huán)腐病的防治新方法是非常必要的,這不僅能夠減少產(chǎn)量損失也能夠減少昂貴的、破壞環(huán)境的化學(xué)藥劑使用。

    目前為止,沒(méi)有一種方法能徹底的消除馬鈴薯細(xì)菌性病害,而大多都是以預(yù)防為主。在病害早期階段或沒(méi)有癥狀的時(shí)候進(jìn)行檢測(cè)是非常重要的。需依靠高通量、特定和靈敏的技術(shù)達(dá)到檢測(cè)目的,大多數(shù)基于免疫和核酸的技術(shù)已經(jīng)證明能滿(mǎn)足基本檢測(cè)要求。然而,這些方法很大程度上都局限于實(shí)驗(yàn)室研究,需要復(fù)雜的設(shè)備和經(jīng)驗(yàn)豐富的人員操作,從取樣到最終結(jié)果,費(fèi)力又耗時(shí),因此需要開(kāi)發(fā)更多精確且快速的馬鈴薯軟腐病和環(huán)腐病檢測(cè)技術(shù)[66,67]。

    農(nóng)業(yè)必須適應(yīng)氣候變化并提高生產(chǎn)系統(tǒng)的復(fù)原力,隨著化學(xué)工業(yè)發(fā)展,農(nóng)藥的過(guò)度使用,導(dǎo)致病原體對(duì)農(nóng)藥的耐藥性上升。而氣候變化的影響及農(nóng)業(yè)發(fā)展的需要,馬鈴薯種薯的跨區(qū)域運(yùn)輸,導(dǎo)致病原體通過(guò)種薯傳播而出現(xiàn)在新區(qū)域中[68]。這就要加大種薯的分級(jí)、分選監(jiān)管力度。同時(shí),也要開(kāi)展更多無(wú)污染、綠色健康環(huán)保的植物源生物制劑研究,如微生物制劑、噬菌體、納米復(fù)合材料等,用于馬鈴薯軟腐病和環(huán)腐病的防治。此外,也可采用更傳統(tǒng)、直接的育種方法,篩選或培育出抗馬鈴薯軟腐病和環(huán)腐病的優(yōu)質(zhì)馬鈴薯材料,達(dá)到從源頭上減少藥劑使用目的,從而有利于促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)性發(fā)展。

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