環(huán)狀RNA在動(dòng)物肌肉發(fā)育中的研究進(jìn)展

楊麗麗，張瓊文，張其偉，陳 婷，江明生

(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530000)

0 引言

環(huán)狀RNA是從lncRNA分離出的一種新的非編碼RNA，在真核生物中高度表達(dá)。環(huán)狀RNA的結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，不同于lncRNA、miRNA的結(jié)構(gòu)，lncRNA、miRNA具有游離的5′端帽子結(jié)構(gòu)和 3′端 Poly(A)尾巴結(jié)構(gòu)，而circRNA是5′端和3′端連接在一起，形成一個(gè)環(huán)狀RNA。通過mRNA前體剪接形成，由內(nèi)含子或外顯子或內(nèi)含子-外顯子環(huán)化產(chǎn)生，不同的環(huán)化方式，其功能作用不同。在后生動(dòng)物中，環(huán)狀RNA以組織特異性的方式表達(dá)。過去的幾十年，環(huán)狀RNA被認(rèn)為是剪接的副產(chǎn)品，無任何價(jià)值、沒有功能作用。但近10年來的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA不但有用，而且在生物體中參與生物體的各種生命活動(dòng)，如參與機(jī)體的正常生理活動(dòng)、Wnt信號(hào)通路、機(jī)體代謝通路的調(diào)控，發(fā)揮著重要作用。最近幾年，隨著RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，生物信息學(xué)工具的出現(xiàn)、不斷更新、完善，環(huán)狀RNA進(jìn)入RNA的研究前沿，環(huán)狀RNA的研究越來越多。

1 環(huán)狀RNA的生物學(xué)特性

1.1 環(huán)狀RNA的起源

1976年，sanger和他的同事在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)了環(huán)狀RNA[1]。1992年，在人類中發(fā)現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA，被稱為雜化外顯子[2]。1993年，Cocquerelle和他的同事研究確定了將這種帶有雜化外顯子的非聚腺苷化RNA確定為共價(jià)封閉環(huán)狀RNA，同時(shí)研究還證明環(huán)狀RNA定位于細(xì)胞質(zhì)中[3]；同年Capel的研究表明環(huán)狀RNA主要在細(xì)胞質(zhì)中，具有組織特異性[4]。2010年開始，隨著RNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和生物信息學(xué)工具的出現(xiàn)，circRNA的研究進(jìn)入前沿。2010年的幾項(xiàng)研究表明，數(shù)千種環(huán)狀RNA在后生動(dòng)物中表達(dá)[5-8]，盡管大多數(shù)circRNA表達(dá)水平低，但有些卻很豐富。20世紀(jì)90年代，在高等真核生物中表達(dá)的第一個(gè)內(nèi)源性環(huán)狀RNA才被鑒定出來[9]。隨著高通量RNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，顯示環(huán)狀RNA廣泛表達(dá)于各種生物體、發(fā)育階段和組織中[5-7，10]。

1.2 環(huán)狀RNA的形成機(jī)制

環(huán)狀RNA是一類共價(jià)閉合環(huán)狀RNA。1987年，Price和他的同事的研究發(fā)現(xiàn)circRNA通過反向剪接將下游5′端剪接位點(diǎn)連接到上游3′端位點(diǎn)[11]，形成環(huán)狀RNA。隨后，Kjems的研究發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA是由單細(xì)胞真核生物中的剪接內(nèi)含子和古菌中的核糖體內(nèi)含子產(chǎn)生的[12]。2016年2月份，有研究表示真核細(xì)胞中的circRNA來源于mRNA前體(pre-mRNA)的反向剪接而成。與線性剪接相比，反向剪接的剪接效率慢[13]。2017年，Piwecka M和Conn VM的研究，發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA的產(chǎn)生通常是由內(nèi)含子重復(fù)序列促進(jìn)的，內(nèi)含子重復(fù)序列彼此堿基配對(duì)，使插入的剪接位點(diǎn)接近[14，15]，這類環(huán)狀RNA為內(nèi)含子環(huán)狀RNA[16]。之后，有相關(guān)研究報(bào)道，包括Quaking 1(QKI)、muscleblind(MBL)、FUS和nuclear factor 90(NF90)在內(nèi)的RBPs通過與側(cè)位內(nèi)含子結(jié)合配對(duì)，促進(jìn)外顯子序列的循環(huán)[17]，這類環(huán)狀RNA為外顯子環(huán)狀RNA[7]。Zhang等人最近的一項(xiàng)研究表明，備用的5′供體剪接位點(diǎn)和3′受體剪接位點(diǎn)可以從單個(gè)基因座產(chǎn)生多個(gè)環(huán)狀RNA[18]，這類環(huán)狀RNA為外顯子-內(nèi)含子(EI)環(huán)狀RNA[19]。

2 環(huán)狀RNA基本功能

早前研究，發(fā)現(xiàn)了大量環(huán)狀RNA。最初，研究者發(fā)現(xiàn)其是剪接的副產(chǎn)品，被認(rèn)為是無功能的。隨著RNA-seq和生物學(xué)信息的發(fā)展，越來越多的環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)具有潛在功能，最近的研究證明環(huán)狀RNA在生物機(jī)體、后生動(dòng)物中起多種作用。環(huán)狀RNA主要有以下4種基本功能。

2.1 作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA

通過結(jié)合miRNA而抑制miRNA的功能。環(huán)狀RNA中存在miRNA的多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá)。2016年，yang和他的同事研究表明，ciRS-7具有miR-7的74個(gè)miRNA結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)ciRS-7過表達(dá)時(shí)，能大量結(jié)合miR-7而導(dǎo)致miR-7靶基因表達(dá)水平上升，相反，抑制ciRS-7的表達(dá)時(shí)，miR-7靶基因表達(dá)水平降低[20，21]。這個(gè)例子就很好地證明circRNA具有多個(gè)miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)能調(diào)節(jié)多個(gè)miRNA的活性。

2.2 轉(zhuǎn)錄和剪接的調(diào)節(jié)因子

在細(xì)胞核內(nèi)參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控，通過與mRNA異構(gòu)體競(jìng)爭(zhēng)性剪切從而調(diào)控線性mRNA的表達(dá)水平[22]。研究報(bào)道，Ci-ANKRD52和ci-SIRT7可以通過與RNA PoI II相互作用調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平[23]。Li的研究結(jié)果證實(shí)單個(gè)基因座產(chǎn)生的環(huán)狀RNA為外顯子-內(nèi)含子(EI)環(huán)狀RNA或EIciRNA，EIciRNA主要位于細(xì)胞核內(nèi)，Shan等人研究證明，EIciRNA在細(xì)胞核中，與U1 snRNP相互作用并促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄[24]。

2.3 與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合

研究報(bào)道，環(huán)狀RNA可以與某些RNA結(jié)合蛋白，作為蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互調(diào)節(jié)的支架分子影響蛋白的表達(dá)[25]，從而調(diào)控蛋白的功能。有研究證明，circ-Foxo3可結(jié)合NDM2和p53，促進(jìn)p53泛素化修飾和降解，導(dǎo)致細(xì)胞PUMA上調(diào)增加細(xì)胞凋亡敏感性[26]；circ-Foxo3通過與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(也稱為細(xì)胞分裂蛋白激酶2或CDK2)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1(或p21)結(jié)合而抑制了細(xì)胞周期進(jìn)程三元復(fù)合體。CDK2與細(xì)胞周期蛋白A和細(xì)胞周期蛋白E相互作用以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)入，而p21則抑制這些相互作用并阻止細(xì)胞周期進(jìn)程[27]。

2.4 環(huán)狀RNA具有編碼潛能

早期研究報(bào)道，環(huán)狀RNA不能翻譯蛋白。但隨著技術(shù)的發(fā)展，有研究證明具有核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列(IRES)的circRNA具有編碼潛能，環(huán)狀RNA通過與核糖體相互作用，參與蛋白的翻譯。2017年，Legnini的研究表明，circ-ZNF609可以翻譯蛋白并調(diào)控肌肉發(fā)育，Circ-ZNF609包含一個(gè)從起始密碼子開始的可讀框，與線性轉(zhuǎn)錄本相同，并終止于在環(huán)化過程中創(chuàng)建的幀內(nèi)STOP密碼子，circ-ZNF609與重鏈多核糖體相關(guān)，并以剪接依賴性和帽依賴性的方式翻譯成蛋白質(zhì)[28]。2017年P(guān)amudurti的研究證實(shí)circ-Mb1可以翻譯蛋白質(zhì)，2018年陳雅露的文章提到的研究結(jié)果證實(shí)circ-FBXW7具有翻譯功能[29]。

3 環(huán)狀RNA調(diào)控動(dòng)物肌肉發(fā)育

已有多項(xiàng)研究報(bào)告了環(huán)狀RNA在醫(yī)學(xué)疾病、肌肉發(fā)育中的生物學(xué)功能，環(huán)狀RNA可以結(jié)合miRNA而抑制miRNA的功能，即環(huán)狀RNA可海綿化miRNA；環(huán)狀RNA可以在細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控mRNA的表達(dá)水平；環(huán)狀RNA也可以調(diào)控蛋白，通過與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，影響蛋白結(jié)構(gòu)；環(huán)狀RNA具有編碼功能，但是，相關(guān)研究報(bào)道較少。在動(dòng)物肌肉發(fā)育中研究較多的是環(huán)狀RNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源作用。

3.1 circ RNA-RBFOX2、circSVIL、 circFGFR2調(diào)控雞肌肉發(fā)育

為了探究circRNA雞骨骼肌發(fā)育中的機(jī)制，Ouyang 等[30，31]對(duì)雞3個(gè)發(fā)育時(shí)期(胚胎11 d，胚胎16 d和出生后1 d)腿肌的circ RNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，共鑒定13，377個(gè)circ RNAs，其中3，036個(gè)表達(dá)豐度較高，462個(gè)呈顯著性差異表達(dá)，在946個(gè)外顯子circ RNAs中發(fā)現(xiàn)有150個(gè)已知的miRNA的結(jié)合位點(diǎn)。進(jìn)一步分析 circ RNA -RBFOX2和circSVIL在雞骨骼肌中的調(diào)控作用。circ RNA -RBFOX2具有miR-206和miR-1a-3p的結(jié)合位點(diǎn)。通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在circ RNA -RBFOX2存在的條件下，miR-206和miR-1a-3p敲低能力顯著下降，接著通過circ RNA -RBFOX2過表達(dá)或敲低，qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，circ RNA -RBFOX2過表達(dá)，miR-206和miR-1a-3p的表達(dá)水平下降，反之上升。為了進(jìn)一步驗(yàn)證circ RNA -RBFOX2是否調(diào)控miR-206的靶基因，根據(jù)軟件預(yù)測(cè)，熒光素酶檢測(cè)，CCND2定為miR-206的靶基因。最后通過過表達(dá)敲低，發(fā)現(xiàn)CCND2是miR-206的靶點(diǎn)，并且隨著circ RNA -RBFOX2過表達(dá)而上升。circSVIL來源于雞2號(hào)染色體上SVIL外顯子6-14，Ouyang研究發(fā)現(xiàn)CircSVIL在雞的胚胎發(fā)育后期高表達(dá)，circSVIL有4個(gè)miR-203的結(jié)合位點(diǎn)，通過雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證了circSVIL與miR-203的相互作用[31]。結(jié)果證明，circSVIL通過使miR-203海綿化并增加靶標(biāo)c-JUN和MEF2C的表達(dá)來促進(jìn)成肌細(xì)胞增殖和分化?？傊琧ircSVIL通過螯合雞中的miR-203來促進(jìn)胚胎骨骼肌的發(fā)育，circ RNA -RBFOX2通過海綿化miR-206增強(qiáng)CCND2的表達(dá)，促進(jìn)了雞成肌細(xì)胞的增值。以上研究為環(huán)狀RNA在雞育種調(diào)控機(jī)制中提供了新的理論知識(shí)。

circFGFR2是由FGFR2外顯子3-6產(chǎn)生的基因，在雞胚骨骼肌發(fā)育中差異表達(dá)。為了解circFGFR2是如何影響雞骨骼肌發(fā)育的機(jī)制。Chen等[32]人通過細(xì)胞周期的流式細(xì)胞術(shù)分析和EdU分析來分析細(xì)胞增殖，通過分析分化標(biāo)志物基因的表達(dá)和肌球蛋白重鏈(MyHC)免疫熒光來確定細(xì)胞分化。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和EdU分析的結(jié)果表明，circFGFR2的過表達(dá)加速了成肌細(xì)胞和QM-7細(xì)胞的增殖，而用siRNA敲除circFGFR2則降低了這2種細(xì)胞的增殖。同時(shí)，circFGFR2的過表達(dá)加速了肌原性分化1(MYOD)，肌生成素(MYOG)和肌管的形成以及circFGFR2的敲低在成肌細(xì)胞中顯示出相反的作用。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)和生物素偶聯(lián)的miRNA下拉檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)一步表明，circFGFR2可以直接靶向miR-133a-5p的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)和miR-29b-1-5p的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步抑這兩個(gè)miRNA。此外，有研究證實(shí)，miR-133a-5p和miR-29b-1-5p均抑制成肌細(xì)胞的增殖和分化，而circFGFR2可以消除兩個(gè)miRNA的抑制作用。綜上，circFGFR2通過使miR-133a-5p和miR-29b-1-5p海綿化，可以促進(jìn)骨骼肌的增殖和分化。

3.2 circFGFR4、circFUT10、circLMO7、circTTN調(diào)控牛肌肉發(fā)育

Li等[33，34]分析了秦川牛胚胎時(shí)期和成年時(shí)期牛肌肉組織中差異表達(dá)的circFGFR4、circFUT10。為了探究其在肌肉中的調(diào)控機(jī)制，通過TargetScan 和RNAhybird軟件預(yù)測(cè)circFGFR4、circFUT10的靶向基因miR-107、miR-133a，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其相互作用，實(shí)時(shí)熒光定量和WB檢測(cè)表達(dá)量，觀察到circFGFR4海綿miR-107，circFGFR4的過度表達(dá)增加了Wnt3a的表達(dá)，而這種效應(yīng)被miR-107所消除；circFUT10通過直接結(jié)合miR-133a和抑制miR-133a的活性來調(diào)節(jié)成肌細(xì)胞的分化和細(xì)胞存活。綜上，circFUT10、circFGFR4的表達(dá)在肌肉組織中的調(diào)節(jié)可能成為控制牛肌肉發(fā)育的育種策略的潛在目標(biāo)。

Wei[35]為了探究circLMO7在牛肌肉發(fā)育中的功能，對(duì)其進(jìn)行了鑒定分析。首先通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)了circLMO7在不同組織中的表達(dá)，構(gòu)建了組織表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)circLMO7在背肌中表達(dá)量最高。接著探究了circLMO7在肌肉發(fā)育中的功能機(jī)制，發(fā)現(xiàn)circLMO7的過度表達(dá)抑制了牛原代成肌細(xì)胞的分化，它似乎是miR-378a-3p的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源性RNA，MiR-378 a-3p參與牛肌肉發(fā)育的作用已被預(yù)先表征。這與研究者預(yù)期的結(jié)果一致，circLMO7在細(xì)胞周期的S期增加了成肌細(xì)胞的數(shù)量，在G0/G1期減少了細(xì)胞的比例。此外，它促進(jìn)成肌細(xì)胞的增殖并保護(hù)它們免于凋亡。這項(xiàng)研究為骨骼肌發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了新的見解，并確定了一些未來需要探索其調(diào)控潛力的環(huán)狀RNA。

2019年，Xiaogang Wang[36]證明了circTTN在牛原代成肌細(xì)胞中的作用和調(diào)控機(jī)制。他們的研究首次確定了circTTN通過與miR-432作為ceRNA競(jìng)爭(zhēng)來調(diào)節(jié)牛成肌細(xì)胞的增殖和分化，從而激活I(lǐng)GF2/PI3K/AKT信號(hào)通路。circTTN過表達(dá)促進(jìn)牛原代成肌細(xì)胞增殖，干擾circTTN表達(dá)時(shí)，促進(jìn)牛原代成肌細(xì)胞分化。通過熒光素酶篩選和RNA免疫沉淀(RIP)分析，證實(shí)了circTTN與miR-432的相互作用。定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)和蛋白質(zhì)印跡分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-432表達(dá)的增加抑制了IGF2的表達(dá)，但這種作用被circTTN所緩解。

3.3 circTUT7調(diào)控豬肌肉發(fā)育

Hong L等研究了杜洛克豬在性交后第33、65和90 天胚胎肌肉發(fā)育中circRNA表達(dá)[37]。分析表明circRNA在胚胎肌肉發(fā)育中特異性表達(dá)。對(duì)circRNA的競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(ceRNA)網(wǎng)絡(luò)分析表明，circRNA調(diào)節(jié)肌肉通過充當(dāng)miRNA海綿來表達(dá)基因，circTUT7在ceRNA機(jī)制中調(diào)節(jié)HMG20B的表達(dá)。試驗(yàn)表明，circRNAs是動(dòng)態(tài)表達(dá)，并通過ceRNA方式與肌肉基因相互作用，提示其在胚胎骨骼肌發(fā)育中的關(guān)鍵功能。

3.4 circPAPD、circQKI調(diào)控羊肌肉發(fā)育

趙薇博士[38]在山羊背最長(zhǎng)肌6個(gè)發(fā)育時(shí)期鑒定出了14 655個(gè)circRNA，6 276個(gè)circRNA在6個(gè)發(fā)育階段共表達(dá)，有1 336個(gè)circRNA在不同發(fā)育階段兩兩之間存在顯著性差異。通過RT-PCR和qPCR驗(yàn)證了RNA-seq得到的circRNA的環(huán)化位點(diǎn)和表達(dá)量，證實(shí)了測(cè)序的可靠性。通過靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)與circRNA結(jié)合的miRNA包含miR-1、miR-206和miR-133等肌肉特異性的miRNA，說明circRNA可作為miRNA的分子海綿參與肌肉發(fā)育過程，利用GO和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，circPAPD7、circQKI參與細(xì)胞增殖分化過程。為進(jìn)一步研究其功能，通過構(gòu)建過表達(dá)載體和siRNA載體對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在SMSCs中過表達(dá)circPAPD7能極顯著上調(diào)增殖相關(guān)基因PCNA、Pax7以及miR-26a-5p靶基因EZH2的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞增殖，同時(shí)過表達(dá)circPAPD7顯著下調(diào)成肌分化相關(guān)基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和miR-26a-5p的表達(dá)并抑制肌管形成；抑制circPAPD7的表達(dá)則導(dǎo)致增殖相關(guān)基因及EZH2的表達(dá)下調(diào)并抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)成肌分化相關(guān)基因及miR-26a-5p的表達(dá)上調(diào)且肌管數(shù)增多。通過AgO2-RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證circPAPD7、miR-26a-5p及EZH2可通過ceRNA機(jī)制促進(jìn)山羊SMSCs的增殖并抑制分化。過表達(dá)circQKI后增殖相關(guān)基因PCNA和Pax7、成肌分化相關(guān)基因MyoD、MyoG、Myomaker、MyHC和來源基因QKI的表達(dá)均極顯著上調(diào)并促進(jìn)細(xì)胞增殖以及肌管的形成；抑制細(xì)胞內(nèi)源性circQKI的表達(dá)后，上述增殖、分化基因及來源基因QKI的表達(dá)均下調(diào)，同時(shí)新增細(xì)胞核及肌管數(shù)目減少。試驗(yàn)證明可通過上調(diào)circQKI基因的表達(dá)促進(jìn)山羊SMSCs的增殖和分化。

4 發(fā)展前景

2010年起，RNA測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，生物信息學(xué)方法的完善，大量環(huán)狀RNA被發(fā)現(xiàn)，被收入數(shù)據(jù)庫(kù)，意味著環(huán)狀RNA的研究有了新的發(fā)展，而不是被認(rèn)為無功能的剪接副產(chǎn)品。近幾年，環(huán)狀RNA的功能被越來越多的研究者探討、研究，且研究成果證明環(huán)狀RNA具有ceRNA機(jī)制、結(jié)合功能蛋白、m6A修飾、編碼潛能等功能。目前，環(huán)狀RNA的研究主要集中于醫(yī)學(xué)中疾病的研究，尤其腫瘤癌癥，如乳腺癌、大腸癌、胃癌、橫紋肌肉腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等，但在動(dòng)物肌肉發(fā)育的研究很少，且有些發(fā)現(xiàn)的、鑒定的circRNA功能機(jī)制仍不清楚，需進(jìn)一步探討、研究。在畜禽中發(fā)現(xiàn)新的circRNA，探索其功能機(jī)制，將會(huì)為分子生物學(xué)在動(dòng)物肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育研究提供一些新的資源和線索，為畜牧業(yè)提供一個(gè)新的發(fā)展領(lǐng)域，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展。