山溪鯢屬的水樣環(huán)境DNA分析方法的建立

馬紅英，張 晗，鄧 捷，趙 虎，孔 飛，姜 維，張紅星，王啟軍

山溪鯢屬的水樣環(huán)境DNA分析方法的建立

馬紅英，張 晗，鄧 捷，趙 虎，孔 飛，姜 維，張紅星，王啟軍*

(陜西省動(dòng)物研究所，陜西省秦嶺珍稀瀕危動(dòng)物保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西安 710032)

通過(guò)優(yōu)化建立一套符合山溪鯢屬物種環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）分析的操作方法，為后期山溪鯢屬資源調(diào)查及保護(hù)提供理論依據(jù)。以太白山溪鯢為研究對(duì)象，在室內(nèi)養(yǎng)殖條件下，進(jìn)行水樣過(guò)濾及目標(biāo)物種線粒體細(xì)胞色素b（Cytb）基因的擴(kuò)增，根據(jù)測(cè)序序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，來(lái)判定水樣DNA中目標(biāo)物種的歸屬。結(jié)果表明：（1）通過(guò)酒精直接浸泡、錫箔紙包裹、唾液收集管收集這3種方法對(duì)過(guò)濾養(yǎng)殖水后的濾膜進(jìn)行貯存，發(fā)現(xiàn)酒精直接浸泡法可增加后期eDNA的提取量；（2）在進(jìn)行目的片段的PCR擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)高保真Mix的擴(kuò)增成功率大于普通Mix；（3）應(yīng)用屬間特異引物進(jìn)行不同物種擴(kuò)增后，可通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育分析來(lái)確定種間的分類。通過(guò)優(yōu)化首次建立了山溪鯢屬物種的水樣eDNA分析方法，可為后期生活在相同水質(zhì)且種間分化較小的物種進(jìn)行eDNA分析提供參考。

環(huán)境DNA；山溪鯢屬；系統(tǒng)發(fā)育分析

山溪鯢屬（）隸屬于兩棲綱（Amphibia)有尾目（Caudata）小鯢科（Hynobiidae），有重要的藥用價(jià)值，也因此被大量獵殺[1-2]，目前該物種已被列入中國(guó)國(guó)家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國(guó)家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物名錄》。我國(guó)存在7個(gè)山溪鯢種群，分別為山溪鯢（）、西藏山溪鯢（)、鹽源山溪鯢（）、龍洞山溪鯢（）、無(wú)斑山溪鯢（）、弱唇褶山溪鯢（）和太白山溪鯢（），而在陜西境內(nèi)存在的山溪鯢屬有3種，分別為山溪鯢、西藏山溪鯢和太白山溪鯢[3]。

黑河是陜西省西安市周至縣境內(nèi)渭河的最大支流[4]，海拔跨度大（600～3 500 m以上），與山溪鯢屬生存的生態(tài)吻合[3]。不僅如此，黑河流域大部分地區(qū)森林茂密，有多處被劃為國(guó)家自然保護(hù)區(qū)，水源充沛，水質(zhì)清純，幾乎沒(méi)有任何污染，是西安市民飲用水和附近農(nóng)民的農(nóng)田灌溉的主要水源[5]。

了解黑河水域中的山溪鯢屬的資源分布情況，可選擇環(huán)境DNA（environmental DNA，eDNA）這種方便快捷的研究方式[6]。水樣環(huán)境DNA是指水生和半水生物種通過(guò)皮膚粘液、尿液、糞便及相關(guān)殘留物釋放到水環(huán)境中的DNA分子印跡[6]。Ficetola是最早將eDNA技術(shù)應(yīng)用到水生物種（青蛙）上，鑒定了其在自然環(huán)境中的分布狀況[6]，隨后eDNA技術(shù)在水生生物上使用越來(lái)越頻繁，涉及到的研究方向也越來(lái)越多樣化，如保護(hù)生物學(xué)調(diào)研[7-9]、物種入侵調(diào)研[10-16]、物種資源分布及多樣性調(diào)研[17-22]及特定環(huán)境中的生物量調(diào)研[23]。eDNA的技術(shù)流程主要是從水樣的獲得、eDNA的提取及目標(biāo)物種的鑒定這些方面進(jìn)行的。水樣獲得會(huì)根據(jù)水質(zhì)和試驗(yàn)條件進(jìn)行水樣直接冷凍[6,7,9,14]和水樣現(xiàn)場(chǎng)過(guò)濾冷 凍[8,11-12,17,21,23-25]。eDNA提取有多種方式，有用組織樣/血樣DNA提取試劑盒提取的[6,7,9,11,14,17,22-25]，有用水樣專用DNA提取試劑盒提取的[10,16,18,20-21]，有用傳統(tǒng)的苯酚-氯仿-異戊醇方法提取的[19]，還有一些研究將多種提取方法進(jìn)行比較[8,15,26]，但就所有的eDNA提取研究中使用率最高且提取效果最優(yōu)的還屬DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, Germany)這個(gè)試劑盒。目標(biāo)物種鑒定方面會(huì)根據(jù)種間特異引物進(jìn)行常規(guī)PCR或qPCR，前者將目的條帶進(jìn)行測(cè)序后在NCBI中進(jìn)行比對(duì)確定是否為目標(biāo)物種的序列[6,8,15,26]，后者通過(guò)擴(kuò)增曲線來(lái)估測(cè)物種的存在或通過(guò)拷貝數(shù)來(lái)估測(cè)物種存在多少[9,11,13-14,17,21-22,24-25]。目標(biāo)物種鑒定方面還有根據(jù)屬間特異引物進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，隨后將目標(biāo)物種的序列與其他同屬物種序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)聚類結(jié)果來(lái)判定目標(biāo)物種的歸屬[16]。然而應(yīng)用eDNA分析技術(shù)對(duì)山溪鯢屬的資源調(diào)查目前尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本研究擬建立一套適用于山溪鯢屬水樣eDNA的分析方法，便于后期對(duì)山溪鯢屬物種進(jìn)行資源調(diào)查，可為山溪鯢屬的保護(hù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2020年9月，于陜西周至縣厚畛子鎮(zhèn)釣魚(yú)臺(tái)地區(qū)的黑河流域中發(fā)現(xiàn)2尾山溪鯢屬物種，參照《中國(guó)兩棲動(dòng)物彩色圖鑒》[27]和趙虎等[28]相關(guān)材料進(jìn)行鑒定，均為太白山溪鯢。將這兩尾太白山溪鯢裝入已盛有3 L黑河水的養(yǎng)殖箱中，并在當(dāng)天帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行人工養(yǎng)殖，養(yǎng)殖箱規(guī)格為50 cm×38 cm×22 cm。

在實(shí)驗(yàn)室條件下養(yǎng)殖2 d后，所有太白山溪鯢自然死亡。根據(jù)姜維等的研究方法用0.45 μm 孔徑的硝酸纖維素濾膜（cellulose nitrate，CN）過(guò)濾養(yǎng)殖箱中的水樣，將濾膜取出后分別用酒精直接浸泡法[29]、錫箔紙包裹浸泡法[30]、唾液收集管收集法[22]進(jìn)行儲(chǔ)存，每種儲(chǔ)存方法設(shè)計(jì)2個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)過(guò)濾的水樣大約500 mL。同時(shí)過(guò)濾相同體積的滅菌去離子水，設(shè)置2個(gè)空白對(duì)照。將所有收集到的濾膜置于–20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 太白山溪鯢Cytb基因部分序列擴(kuò)增引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 組織樣采集及其DNA提取 采集自然死亡的兩條太白山溪鯢的肌肉組織各5份，使用血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)）進(jìn)行組織DNA的提取。取5 μL DNA溶液，利用1 %瓊脂凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與篩選 參照NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中太白山溪鯢基因的部分序列（GenBank 登錄號(hào)：EU296330.1），應(yīng)用primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，鑒于相關(guān)研究中提到水樣eDNA擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不易大于400 bp[7]，因此本研究設(shè)計(jì)了4對(duì)目的片段長(zhǎng)度在100～300 bp之間的引物，并委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行引物合成。參照馬紅英研究中的內(nèi)容進(jìn)行所有引物的梯度PCR擴(kuò)增[31]，其中Tm設(shè)置范圍為46～59 ℃。所有引物信息見(jiàn)表1。

1.2.3 水樣eDNA的提取與檢測(cè) 鑒于相關(guān)研究經(jīng)驗(yàn)所得，本研究也使用提取效果較優(yōu)的DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, Germany)進(jìn)行水樣DNA的提取[22,25,29,32-33]，除最后一步使用50 μL無(wú)菌ddH2O進(jìn)行洗脫外，其余步驟與該試劑盒說(shuō)明書(shū)一致。取10 μL DNA溶液，利用1%瓊脂凝膠電泳和核酸分析儀進(jìn)行檢測(cè)，剩余溶液–20℃保存。

1.2.4 水樣eDNA的PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的確定 選取3個(gè)提取效果較好的目標(biāo)水樣eDNA作為模板，2個(gè)目標(biāo)物種DNA為陽(yáng)性對(duì)照，2個(gè)去離子水樣eDNA為陰性對(duì)照。

比較高保真Mix與常規(guī)Mix之間的擴(kuò)增效率。反應(yīng)體系參考說(shuō)明書(shū)，其中常規(guī)Mix反應(yīng)體系為：10 μL 2×Taq MasterMix（匯天東方，北京），7 μL無(wú)菌ddH2O，2 μL DNA模板，上下游引物各0.5 μL。高保真Mix反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×T10 FastLong PCR Mix（匯天東方，北京），9 μL無(wú)菌ddH2O，2.5 μL DNA模板，上下游引物各0.5 μL。

PCR反應(yīng)程序也因Mix不同而不同，常規(guī)Mix的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃變性8 min，50個(gè)循環(huán)（95 ℃，30 s；52 ℃，30 s；72 ℃，1 min），72 ℃延伸8 min。高保真Mix的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性3 min，50個(gè)循環(huán)（94 ℃，10 s；52 ℃，10 s；72 ℃，10 s），72 ℃延伸3 min。

擴(kuò)增結(jié)果用2%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，隨機(jī)挑選陽(yáng)性擴(kuò)增，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)序結(jié)果分析 將測(cè)序合格的樣品序列通過(guò)ChromasProV1.4.1軟件轉(zhuǎn)化存儲(chǔ)為FASTA格式；利用Mega軟件將測(cè)序結(jié)果與NCBI下載的山溪鯢、太白山溪鯢、西藏山溪鯢的Cytb序列進(jìn)行對(duì)比。應(yīng)用Mega軟件和BEAST軟件對(duì)所有序列進(jìn)行聚類分析[34-36]，進(jìn)一步確定本研究的目標(biāo)物種與其水樣DNA擴(kuò)增結(jié)果的歸屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 組織樣DNA檢測(cè)

提取的2條太白山溪鯢的各5個(gè)重復(fù)，除個(gè)別提取效果欠佳之外，其余都符合后續(xù)的試驗(yàn)要求（圖1）。

2.2 PCR引物篩選

隨機(jī)選取提取效果較優(yōu)的組織DNA作為模板，對(duì)合成的4對(duì)引物進(jìn)行篩選，由圖2可知，4對(duì)引物都能進(jìn)行良好擴(kuò)增，52 ℃可作為所有引物的最佳退火溫度，而且引物P2的擴(kuò)增效果最好，在后期水樣eDNA擴(kuò)增中選取P2為目標(biāo)引物。

泳道1-5為太白山溪鯢個(gè)體一的組織DNA；泳道6-10為太白山溪鯢個(gè)體二的組織DNA；M為Marker。

Figure 1 Electrophoresis result of genomic DNA sample

P1-P4為所有引物，具體信息見(jiàn)表1；M為Marker；A-F為設(shè)置的不同退火溫度，對(duì)應(yīng)值分別為：46 ℃、49 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、59 ℃。

Figure 2 Primer screening result

H、S為陽(yáng)性對(duì)照；M為Marker；1-1為唾液收集管收集法儲(chǔ)存的濾膜eDNA；1-2為酒精直接侵泡法存儲(chǔ)的濾膜eDNA；1-3為錫箔紙包裹存貯的濾膜eDNA；B為陰性對(duì)照。

Figure 3 Electrophoresis result of environment DNA sample

2.3 水樣eDNA的提取與檢測(cè)

使用DNeasy blood and tissue kit（Qiagen, Germany）試劑盒對(duì)酒精直接浸泡法、錫箔紙包裹浸泡法和唾液收集管收集法進(jìn)行儲(chǔ)存的濾膜進(jìn)行eDNA提?。楸苊饨徊嫖廴舅畼覦NA提取和組織樣DNA提取在不同時(shí)間段和不同操作間進(jìn)行），結(jié)合凝膠電泳圖（圖3）和核酸分析儀檢測(cè)結(jié)果，不同的濾膜存儲(chǔ)方法的DNA提取效果的優(yōu)先級(jí)為：酒精浸泡法（818 ng·μL-1）>錫箔紙包裹法（655 ng·μL-1）>唾液收集管收集法（252 ng·μL-1）。

上半部分為普通Mix擴(kuò)增結(jié)果，下半部分為高保真Mix擴(kuò)增結(jié)果；1、2為陽(yáng)性對(duì)照；3、4、5為目標(biāo)物種水樣eDNA擴(kuò)增結(jié)果；6為陰性對(duì)照；M為Marker。

Figure 4 PCR results of different Mixes for water eDNA sample

2.4 水樣eDNA的PCR檢測(cè)

選3個(gè)提取效果較好的目標(biāo)水樣eDNA、2個(gè)目標(biāo)物種DNA及1個(gè)去離子水樣eDNA作為擴(kuò)增模板，分別應(yīng)用高保真Mix和普通Mix對(duì)本研究中的4對(duì)引物（見(jiàn)表1）進(jìn)行擴(kuò)增，比對(duì)不同Mix的擴(kuò)增效率，結(jié)果如圖4所示，使用高保真Mix擴(kuò)增效果更高，且4對(duì)引物中P2特異性更強(qiáng)，擴(kuò)出了大部分的目標(biāo)水樣的eDNA。

2.5 測(cè)序結(jié)果的聚類分析

將使用高保真Mix及P2引物對(duì)擴(kuò)出的水樣eDNA樣本進(jìn)行大量擴(kuò)增，同時(shí)也將2條通過(guò)形態(tài)鑒定推斷為太白山溪鯢的目標(biāo)樣本進(jìn)行擴(kuò)增后，送去北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)無(wú)論組織樣序列還是水樣序列都只比對(duì)到山溪鯢屬物種上，說(shuō)明這3種山溪鯢屬物種差異較小，且屬間特異引物的特異性好，后期通過(guò)分子系統(tǒng)學(xué)方法對(duì)具體種進(jìn)行分類。本研究將新測(cè)得的序列和GenBank中下載的所有山溪鯢、西藏山溪鯢和太白山溪鯢的Cytb基因序列進(jìn)行比對(duì)，分別使用Mega軟件和BEAST軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，通過(guò)聚類發(fā)現(xiàn)本研究測(cè)序得到的水樣序列和組織樣序列都與GenBank中的太白山溪鯢聚在一起（圖5），結(jié)合外形判定可進(jìn)一步斷定本研究收集到的是2尾太白山溪鯢，同時(shí)水樣eDNA中擴(kuò)增出的序列也是如此。因此在種間差異較小的物種間可結(jié)合eDNA和系統(tǒng)發(fā)育分析的方法對(duì)其分布及歸屬進(jìn)行判定。

(a) (b)

Figure 5 Molecular Phylogenetic analysis by Maximum Likelihood method (a) and Bayes method (b)

3 討論與結(jié)論

3.1 水樣采集時(shí)間的確定

在自然水體環(huán)境中eDNA的獲取成功與否與目標(biāo)物種在對(duì)應(yīng)水域的存在與否是直接相關(guān)的[8,12-13]。本研究前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，山溪鯢屬在7月左右發(fā)現(xiàn)率高，理論來(lái)講進(jìn)入旱期后由于代謝加快，eDNA會(huì)有一定的獲取量，然而2020年的整個(gè)暑期雨季持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，在很長(zhǎng)一段時(shí)間的調(diào)研中只發(fā)現(xiàn)了本研究采集到的這一次，因此不排除雨季引起的洪水將山溪鯢屬物種沖到大河流域中，發(fā)生自然災(zāi)害性的死亡，使其數(shù)量急劇減少。因此采集自然環(huán)境水樣，應(yīng)選擇雨量少且干燥炎熱的季節(jié)。

3.2 濾膜的不同保存方法對(duì)eDNA獲取存在一定的影響

大部分關(guān)于eDNA分析流程的研究中會(huì)對(duì)水樣過(guò)濾方式及eDNA提取方式進(jìn)行比較[8,15,25-26,37]，很少有對(duì)濾膜保存方式進(jìn)行比較的研究，本研究首次對(duì)常用的濾膜保存方式進(jìn)行了對(duì)比，在同一種過(guò)濾及eDNA提取方式的前提下，酒精浸泡法所獲得的eDNA濃度最高，質(zhì)量也最好（818 ng·μL-1），其次為錫箔紙包裹法（655 ng·μL-1）和唾液收集管收集法（252 ng·μL-1）。Goldberg的研究中應(yīng)用eDNA技術(shù)分析了淡水中山蛙和大鯢的分布情況，該研究是首次將過(guò)濾后的濾膜放入95%乙醇中冷凍保存的，且成功提取到了這些物種的eDNA[8]。其他使用酒精浸泡濾膜的類似研究中，所過(guò)濾的水質(zhì)都為淡水資源[11,21,25]，因此可以認(rèn)為酒精直接浸泡法適用于保存過(guò)濾了淡水的濾膜。而錫箔紙包裹的類似研究中，涉及到的水樣為海水[12]或本身水質(zhì)偏酸[24]的水域。唾液收集管收集濾膜的研究只有陳治等[22]的研究中出現(xiàn)過(guò)，其過(guò)濾的是近海水域的海水，在該研究中認(rèn)為唾液收集管收集的濾膜樣本能更好的獲得eDNA，這與本研究結(jié)果相反，這可能與研究對(duì)應(yīng)的水質(zhì)不同有關(guān)。綜合以上推測(cè)水質(zhì)清澈的水域過(guò)濾后將濾膜用95%酒精浸泡的貯存方法有助于eDNA的獲取。

3.3 影響eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的主要因素

對(duì)成功獲取的eDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，發(fā)現(xiàn)前人的研究有的用不同型號(hào)的Taq 酶[15,20,26,29]，有的直接用PCR Mix[8]，兩種方法都成功擴(kuò)增了目的條帶。由于使用PCR Mix可將操作過(guò)程最少的暴露在試驗(yàn)空氣中，有助于目的條帶的擴(kuò)增，因此本研究也采用了Mix混合液，且同時(shí)將兩種不同的Mix做了比較，發(fā)現(xiàn)高保真Mix能更好的擴(kuò)增出水樣eDNA的目的條帶，因此擴(kuò)增過(guò)程中酶或Mix的使用在eDNA的分析過(guò)程中也是至關(guān)重要的。

3.4 線粒體Cytb基因及系統(tǒng)發(fā)育分析技術(shù)在本研究中的重要性

線粒體DNA的高拷貝數(shù)使其廣泛應(yīng)用于eDNA分析中，尤其是Cytb基因[6,10,12,19]，不僅如此，Cytb基因還被認(rèn)為是解決系統(tǒng)發(fā)育分析類問(wèn)題中比較可信的研究之一[38]。已有一些研究在山溪鯢屬物種中通過(guò)Cytb基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析， Fu等的研究中應(yīng)用Cytb基因分別構(gòu)建了我國(guó)西藏地區(qū)以及西南地區(qū)山溪鯢屬物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)現(xiàn)存的山溪鯢屬進(jìn)行了分類[39-40]；也有專門(mén)針對(duì)西藏山溪鯢、太白山溪鯢和無(wú)斑山溪鯢這些特定種的系統(tǒng)發(fā)育分析，且都是應(yīng)用Cytb基因探究了這些山溪鯢種群在不同地域或氣候條件下的群體分類以及群體分化時(shí)間[38,41-44]。以上研究都是通過(guò)陽(yáng)性DNA擴(kuò)增的目標(biāo)基因進(jìn)行聚類分析，且結(jié)果都可信。本研究將eDNA擴(kuò)增的Cytb序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，也同樣得到了可信的物種歸屬判定。

通過(guò)本研究得出后期在野外水體環(huán)境中進(jìn)行山溪鯢屬鑒定的流程：在山溪鯢活動(dòng)高峰期（干旱少雨季）進(jìn)行水樣的采集，使用0.45 μm 孔徑的硝酸纖維素濾膜（CN）過(guò)濾之后用酒精浸泡法保存濾膜，在2周以內(nèi)使用DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, Germany)進(jìn)行DNA的提取，采用高保真Mix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將陽(yáng)性擴(kuò)增送去測(cè)序，成功測(cè)得的序列與已有的三種山溪鯢屬的序列進(jìn)行聚類分析，以便明確采集到的水體中可能存在的山溪鯢屬物種。

[1] 金義文, 劉炯宇, 江建平, 等. 中藥材羌活魚(yú)基原考訂[J]. 中藥材, 2005, 28(9): 838-841.

[2] 張佑民, 劉興連, 孫長(zhǎng)銘. 陜西水生野生動(dòng)植物[M]. 西安: 西安地圖出版社, 2006.

[3] 黃棨通, 龔大潔, 張海軍, 等. 我國(guó)山溪鯢屬分布及保護(hù)對(duì)策[J]. 野生動(dòng)物學(xué)報(bào), 2017, 38(4): 682-688.

[4] 趙阿妮. 黑河濕地保護(hù)與開(kāi)發(fā)利用研究[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2005.

[5] 劉睿翀. 陜西黑河流域地表水與地下水耦合模擬研究[D]. 西安: 長(zhǎng)安大學(xué), 2015.

[6] FICETOLA G F, MIAUD C, POMPANON F, et al. Species detection using environmental DNA from water samples[J]. Biol Lett, 2008, 4(4): 423-425.

[7] DEJEAN T, VALENTINI A, DUPARC A, et al. Persistence of environmental DNA in freshwater ecosystems[J]. PLoS One, 2011, 6(8): e23398.

[8] GOLDBERG C S, PILLIOD D S, ARKLE R S, et al. Molecular detection of vertebrates in stream water: a demonstration using Rocky Mountain tailed frogs and Idaho giant salamanders[J]. PLoS One, 2011, 6(7): e22746.

[9] BIGGS J, EWALD N, VALENTINI A, et al. Using eDNA to develop a national citizen science-based monitoring programme for the great crested newt ()[J]. Biol Conserv , 2015, 183: 19-28.

[10] JERDE C L, MAHON A R, CHADDERTON W L, et al. “Sight-unseen” detection of rare aquatic species using environmental DNA[J]. Conserv Lett , 2011, 4(2): 150-157.

[11] GOLDBERG C S, SEPULVEDA A, RAY A, et al. Environmental DNA as a new method for early detection of New Zealand mudsnails ()[J]. Freshw Sci , 2013, 32(3): 792-800.

[13] EICHMILLER J J, BAJER P G, SORENSEN P W. The relationship between the distribution of common carp and their environmental DNA in a small lake[J]. PLoS One, 2014, 9(11): e112611.

[14] SECONDI J, DEJEAN T, VALENTINI A, et al. Detection of a global aquatic invasive amphibian, Xenopus laevis, using environmental DNA[J]. Amphibia-Reptilia, 2016, 37(1): 131-136.

[15] GEERTS A N, BOETS P, VAN DEN HEEDE S, et al. A search for standardized protocols to detect alien invasive crayfish based on environmental DNA (eDNA): a lab and field evaluation[J]. Ecol Indic , 2018, 84: 564-572.

[16] CLUSA L, GARCíA-VáZQUEZ E. A simple, rapid method for detecting seven common invasive fish species in Europe from environmental DNA[J]. Aquat Conserv : Mar Freshw Ecosyst , 2018, 28(3): 619-629.

[17] THOMSEN P F, KIELGAST J, IVERSEN L L, et al. Detection of a diverse marine fish fauna using environmental DNA from seawater samples[J]. PLoS One, 2012, 7(8): e41732.

[18] 徐念, 常劍波. 長(zhǎng)江中下游干流環(huán)境DNA樣本魚(yú)類物種檢測(cè)的初步研究[J]. 水生態(tài)學(xué)雜志, 2016, 37(5): 49-55.

[19] YAMANAKA H, MINAMOTO T. The use of environmental DNA of fishes as an efficient method of determining habitat connectivity[J]. Ecol Indic, 2016, 62: 147-153.

[20] 張愛(ài)菊, 郝雅賓, 郭愛(ài)環(huán), 等. 基于高通量測(cè)序技術(shù)的魚(yú)類環(huán)境DNA研究中通用引物的篩選驗(yàn)證[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2019, 31(10): 1615-1623.

[21] 吳昀晟, 唐永凱, 李建林, 等. 環(huán)境DNA在長(zhǎng)江江豚監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2019, 26(1): 124-132.

[22] 陳治, 宋娜, 源利文, 等. 舟山近海水樣環(huán)境DNA獲取方法的建立[J]. 水生生物學(xué)報(bào), 2020, 44(1): 50-58.

[23] TAKAHARA T, MINAMOTO T, YAMANAKA H, et al. Estimation of fish biomass using environmental DNA[J]. PLoS One, 2012, 7(4): e35868.

[24] TSUJI S, YAMANAKA H, MINAMOTO T. Effects of water pH and proteinase K treatment on the yield of environmental DNA from water samples[J]. Limnology, 2017, 18(1): 1-7.

[25] HINLO R, GLEESON D, LINTERMANS M, et al. Methods to maximise recovery of environmental DNA from water samples[J]. PLoS One, 2017, 12(6): e0179251.

[26] DEINER K, DE WALSER J C, M?CHLER E, et al. Choice of capture and extraction methods affect detection of freshwater biodiversity from environmental DNA[J]. Biol Conserv , 2015, 183: 53-63.

[27] 費(fèi)梁, 葉昌媛, 江建平. 中國(guó)兩棲動(dòng)物彩色圖鑒[M]. 成都: 四川科學(xué)技術(shù)出版社, 2010.

[28] 趙虎, 王啟軍, 姜維, 等. 太白山溪鯢形態(tài)特征測(cè)量與分析研究[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué), 2017, 36(2): 622-629.

[29] 姜維, 王啟軍, 鄧捷, 等. 以川陜哲羅鮭為目標(biāo)物種的水樣環(huán)境DNA分析流程的優(yōu)化[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2016, 27(7): 2372-2378.

[30] TAKAHARA T, MINAMOTO T, DOI H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e56584.

[31] 馬紅英. 利用DNA組學(xué)技術(shù)對(duì)晉江馬起源的研究[D]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 2019.

[32] PILLIOD D S, GOLDBERG C S, ARKLE R S, et al. Estimating occupancy and abundance of stream amphibians using environmental DNA from filtered water samples[J]. Can J Fish Aquat Sci, 2013, 70(8): 1123-1130.

[33] GOLDBERG C S, SEPULVEDA A, RAY A, et al. Environmental DNA as a new method for early detection of New Zealand mudsnails ()[J]. Freshw Sci , 2013, 32(3): 792-800.

[34] DRUMMOND A J, RAMBAUT A. BEAST: Bayesian evolutionary analysis by sampling trees[J]. BMC Evol Biol, 2007, 7: 214.

[35] DRUMMOND A J, SUCHARD M A, XIE D, et al. Bayesian phylogenetics with BEAUti and the BEAST 1.7[J]. Mol Biol Evol, 2012, 29(8): 1969-1973.

[36] KUMAR S, STECHER G, TAMURA K. MEGA7: molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Mol Biol Evol, 2016, 33(7): 1870-1874.

[37] MINAMOTO T, NAKA T, MOJI K, et al. Techniques for the practical collection of environmental DNA: filter selection, preservation, and extraction[J]. Limnology, 2016, 17(1): 23-32.

[38] 梁佳軒. 基于Cytb和D-loop區(qū)序列分析太白山溪鯢的譜系地理學(xué)[D]. 西安: 陜西師范大學(xué), 2010.

[39] FU J Z, WANG Y Z, ZENG X M, et al. Genetic diversity of eastern Batrachuperus (Caudata: Hynobiidae)[J]. Copeia, 2001, 2001(4): 1100-1107.

[40] FU J Z, ZENG X M. How many species are in the genus Batrachuperus? A phylogeographical analysis of the stream salamanders (Family Hynobiidae) from southwestern China[J]. Mol Ecol , 2008, 17(6): 1469-1488.

[41] LU B, ZHENG Y C, MURPHY R W, et al. Coalescence patterns of endemic Tibetan species of stream salamanders (Hynobiidae:)[J]. Mol Ecol, 2012, 21(13): 3308-3324.

[42] 王貴虎, 丁義晶, 閆季澤, 等. 秦嶺地區(qū)北方山溪鯢的遺傳多樣性和種群分化[J]. 西北大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2013, 43(6): 915-920.

[43] 丁義晶, 王貴虎, 陳振寧, 等. 青海省發(fā)現(xiàn)兩棲綱小鯢科無(wú)斑山溪鯢[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志, 2014, 49(3): 428-431.

[44] HUANG Z S, YU F L, GONG H S, et al. Phylogeographical structure and demographic expansion in the endemic alpine stream salamander (Hynobiidae:) of the Qinling Mountains[J]. Sci Rep, 2017, 7: 1871.

[DOI] 10.13610/j.cnki.1672-352x.20211105.016

Establishment of analysis method for environment DNA offrom water samples

MA Hongying, ZHANG Han, DENG Jie, ZHAO Hu, KONG Fei, JIANG Wei, ZHANG Hongxing, WANG Qijun

(Shaanxi Key Laboratory for Animal Conservation, Shaanxi Institute of Zoology, Xi’an 710032)

This study established the method of environmental DNA (eDNA) analysis ofthrough a series of optimization, to provide a theoretical basis for resource investigation and protection ofin future research. This study takes() as the research object to filter water from the aquaculture tank, and genus-specific primer used for the amplification of Cytb gene, afterthat phylogenetic tree was conducted according to sequence analysis to determine the belonging of target species in water. The main results as follows: (1) Three membrane storage methods (like membrane directly socked in alcohol, membrane wrapped in tinfoil and membrane collected with saliva collection tube) have been compared, found that membrane directly socked in alcohol can increase the eDNA yield compared with the other; (2) The PCR amplification efficiency of high-fidelity Mix is higher than ordinary in eDNA analysis; (3) Classification of those species that amplified using genus-specific primer were conducted on a phylogenetic analysis. [Conclusion]This study is the first to establish an optimal method for obtaining eDNA offrom water samples, which provides reference for eDNA extraction of other species who lived in similar waters and have less genetically diverse.

eDNA；；phylogenetic analysis

S931.3

A

1672-352X (2021)05-0784-06

H. Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds[J]. PLoS One, 2013, 8(2): e56584.

2021-11-8 9:59:16

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20211105.1129.032.html

2021-03-01

陜西省科學(xué)院博士啟動(dòng)專項(xiàng)：“利用水樣eDNA分析研究周至黑河水域山溪鯢的資源分布”（2020k-19）資助。

馬紅英，博士，助理研究員。E-mail：mhying7916@163.com

通信作者:王啟軍，副研究員。E-mail：wqjab@126.com