茶樹根系耐鋁內(nèi)生真菌的篩選鑒定

章順成，武平安，李 靜，丁 月，吳 昊，耿園明, 張寬朝，余 梅

茶樹根系耐鋁內(nèi)生真菌的篩選鑒定

章順成，武平安，李 靜，丁 月，吳 昊，耿園明, 張寬朝*，余 梅*

(安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，合肥 230036)

茶樹是典型的喜鋁耐鋁植物，其根系微生物在鋁元素的吸收轉化中起重要作用。從茶樹根系分離鑒定出一株耐鋁的內(nèi)生真菌，進行了顯微鏡形態(tài)鑒定及18S rDNA序列分析，分析了該菌株對不同重金屬的耐受程度，研究鋁對該菌生長的影響，并利用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜儀(ICP-AES)對該菌株耐受Al3+進行了研究分析。結果發(fā)現(xiàn)，顯微鏡形態(tài)觀察及18S rDNA序列表明該菌為粘紅酵母屬粘紅酵母（），命名為A3。粘紅酵母A3對不同重金屬的耐受性為：Al3+> Mn2+> Cu2+，其中鋁濃度可達250 mmol·L-1。當培養(yǎng)基中添加了150 mmol·L-1的Al3+，菌液pH值為2.0～3.0，粘紅酵母A3生長良好。ICP-AES結果顯示該菌株鋁離子含量與培養(yǎng)基中Al3+濃度呈正相關，說明該菌株在一定范圍內(nèi)對Al3+具有吸附作用；同時測定該菌株的含水量隨培養(yǎng)基中鋁含量增加而增大，揭示該菌株對鋁毒害的規(guī)避與其通過含水量的增加平衡細胞液有關系。分離的耐鋁真菌為茶樹的耐鋁機制提供新的思路，并為其定殖到其他作物規(guī)避鋁脅迫提供微生物資源，以提高植物的抗性，增加產(chǎn)量。

茶樹；耐鋁；內(nèi)生菌；粘紅酵母

植物內(nèi)生菌是指生活在植物細胞內(nèi)或細胞間隙的微生物資源[1]。植物與內(nèi)生菌之間可以相互作用，內(nèi)生菌可以誘導植物進行相關生物合成[2]，而且植物也選擇內(nèi)生菌并對其代謝進行調(diào)控[3]。在長期進化過程中，有些內(nèi)生菌在與植物共生時能夠調(diào)節(jié)植物對逆境的適應，如因受到重金屬脅迫、鹽分、干旱、高溫而引起的細胞毒害時，可以提升其適應環(huán)境脅迫的響應機制并促進植物生長[4-10]。對植物內(nèi)生菌的有效利用是內(nèi)生菌研究的方向之一，近年來農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中對內(nèi)生菌的應用也有一些進展[11]。植物內(nèi)生菌數(shù)量大，增值較快，利用植物內(nèi)生菌將其定殖到植物體內(nèi)，對提高植物的抗性、增加產(chǎn)量等有一定的應用前景[8]。

酸性土壤占世界可耕作土壤的 30% ～ 40%，且呈逐年上升趨勢，鋁毒是酸性土壤中作物生產(chǎn)的主要限制因素[12]。在植物中有兩類不同的耐鋁機制：從根尖排除鋁和在植物中積累鋁[13]。茶樹是鋁積累型植物，其體內(nèi)鋁含量是其他植物的幾十倍，特別是老葉中的鋁含量可高達30 mg·g-1。茶樹積累鋁卻并不表現(xiàn)出其根尖生長受抑制及根冠表皮脫落等典型鋁毒癥狀，而且適宜濃度的鋁還能促進茶樹的生長[14]。茶樹的耐鋁機制是否與其內(nèi)生菌及土壤中的耐鋁微生物有關，引起了研究者的廣泛關注。趙希俊等[15]從健康茶樹體內(nèi)分離出53株耐鋁內(nèi)生細菌，通過促生指標評測，篩選出一株具有顯著促生功能的內(nèi)生細菌G3。Zhang等[16]分離到一株耐鋁微紫青霉菌()F-13，該菌能在含100 mmol·L-1鋁離子的培養(yǎng)基中生長。本研究從茶樹品種‘舒茶早’中篩選出耐鋁性能較高的內(nèi)生菌株，并進行了系統(tǒng)研究，以期為提示茶樹喜鋁耐鋁機理奠定基礎，為茶樹的優(yōu)質(zhì)高效栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

春季從安徽農(nóng)業(yè)大學農(nóng)翠園的茶樹品種園中挑選生長旺盛、無病害的五年生‘舒茶早’茶樹，采集其主根、側根帶回實驗室。去除根系表面土壤，用自來水沖洗干凈，吸干表面水后備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的分離 （1）根系表面消毒。將清洗干凈的根系用75%乙醇處理1 min，然后用0.10%的升汞處理12 min，無菌水沖洗3 ～ 5次，無菌吸水紙吸干表面水分。

（2）茶樹耐鋁內(nèi)生菌的分離。將經(jīng)過表面消毒的根系剪成約2 cm長的圓柱體，接入PDA固體培養(yǎng)基，觀察2周無污染后，揭去表皮，再切成0.5 cm大小的片段，轉接至新的PDA固體培養(yǎng)基，觀察記錄，每個處理設置3個重復，每個重復接入3塊組織。待組織塊邊緣有菌絲生長，即可進行擇優(yōu)選取。將選取的菌落挑出接種至液體PDA培養(yǎng)基中28℃、180 r·min-1培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中逐漸提高鋁離子濃度至100 mmol·L-1。

1.2.2 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的純化及形態(tài)學觀察 將菌液接種于含100 mmol·L-1鋁離子的PDA固體培養(yǎng)基中，每個平板挑取2 ～ 4個單菌落（具體個數(shù)根據(jù)平板上長出的單菌落決定），重復4次四區(qū)劃線操作，最終得到純化的單菌落，然后再進行多次純化接種到斜面培養(yǎng)基上進行保存。觀察菌株菌落，并用光學顯微鏡分析菌落形態(tài)。

1.2.3 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的種屬鑒定及其系統(tǒng)進化樹構建 使用真菌基因組DNA快速抽提試劑盒，對分離得到的耐鋁性能優(yōu)良且生長速率快的菌株進行基因組DNA提取。使用真菌18S rDNA的通用引物NS1(5＇- GTAGTCATATGCTTGTCTC - 3＇)正向引物和NS8(5＇- TCCGCAGGTTCACCTACGGA - 3＇)反向引物，PCR擴增內(nèi)生菌的18S rDNA。PCR反應條件：94 ℃預變性5 min，循環(huán)條件為94 ℃ 30 s; 55 ℃ 30 s; 72 ℃ 60 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。對PCR擴增產(chǎn)物進行測序，測序結果經(jīng)過比對拼接后，在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索分析。選取相似菌種的18S rDNA序列并下載相關序列，使用MEGA5.1構建系統(tǒng)進化樹，分析內(nèi)生菌的親緣關系。

1.2.4 3種金屬離子MIC（ minimum inhibitory concentration）測定 用含Al3+、Mn2+、Cu2+等重金屬濃度分別為0 ～ 250 mmol·L-1的培養(yǎng)基在96孔板中對菌株進行MIC檢測，重復3次，于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d。

1.2.5 加鋁和不加鋁條件下內(nèi)生菌的生長曲線繪制

取鑒定過種屬的菌落，先液體培養(yǎng)至適宜濃度，分別接種于不含鋁離子和鋁離子濃度為150 mmol·L-1的PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)。每12 h分別取出3瓶培養(yǎng)液，以無菌PDA培養(yǎng)基作為對照，測定OD600的值。

1.2.6 鋁脅迫條件下內(nèi)生菌培養(yǎng)液pH變化 取鑒定過種屬的菌落，先液體培養(yǎng)至適宜濃度，分別接種于不含鋁鹽和鋁離子濃度為150 mmol·L-1的PDA液體培養(yǎng)基中，28℃、180 r·min-1培養(yǎng)。每12 h分別取出3瓶培養(yǎng)液，用pH計測定菌液的pH值。

1.2.7 耐鋁內(nèi)生菌水含量及鋁含量的測定 采用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）測定鋁含量。

取適量生長旺盛的耐鋁菌株分別接種于鋁含量為0、50、100、150和200 mmol·L-1的PDA固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d，取菌體，稱重。于105 ℃烘4 ～ 6 h，將溫度降低到70 ℃烘至恒重，常溫下干燥器中保存。

按公式（1）計算細胞含水量：

稱取0.25 g烘干后的菌體，加入10 mL體積比為9:1的高氯酸:硝酸混合液，于180 ℃電熱板上濃縮至體積小于0.5 mL后冷卻待用。將上述液體定容至25 mL，采用電感耦合等離子原子發(fā)射光譜法測定所得溶液的鋁含量，對結果進行相關分析。

按公式（2）計算細胞鋁含量：

細胞內(nèi)鋁含量/（mg·g-1）=實驗樣品鋁含量/（mg·g-1）× 50 （2）

2 結果與分析

2.1 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的分離結果

茶樹的根經(jīng)過分離純化得到的耐鋁菌落在PDA固體培養(yǎng)基上肉眼觀察為淺橙紅色的粘質(zhì)狀菌落，表面可由光滑到褶皺，有光澤，質(zhì)地粘稠有時發(fā)硬（圖1）。光學顯微鏡下觀察，該菌落為規(guī)則的圓球形，個體以單細胞狀態(tài)存在（圖2）。

2.2 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的種屬鑒定及其系統(tǒng)進化樹構建

對分離出的茶樹耐鋁內(nèi)生菌進行18S rDNA測序，分析結果顯示，菌株序列長度為1 736 bp，經(jīng)過NCBI中BLAST比對，該菌株與strain HK29-3的同源性100%，依據(jù)18S rDNA序列比對結果及同源性分析說明該菌株為酵母科、紅酵母屬、粘紅酵母種。茶樹耐鋁內(nèi)生菌系統(tǒng)進化樹見圖3。

圖 1 菌落形態(tài)

Figure 1 Colony

圖 2 光學顯微鏡下的菌體形態(tài)（×400）

Figure 2 Morphology of fungus under an optical microscope（×400）

2.3 3種重金屬離子MIC測定

多種重金屬MIC結果（圖4）顯示對鋁的耐受度較高，達到250 mmol·L-1，對Mn2+耐受達50 mmol·L-1，對 Cu2+耐受度較低。

圖3 茶樹耐鋁內(nèi)生菌的系統(tǒng)發(fā)育分析

Figure 3 Phylogenetic analysis of the aluminum-tolerant endophytic fungus

2.4 菌株A3的生長曲線

如圖5所示，菌株A3在PDA培養(yǎng)基中36 h達到一個峰值，隨后下降；而培養(yǎng)60 h時又達到一個高峰，結合圖6的pH值變化，顯示該菌落在一定范圍內(nèi)適合在較低pH值的培養(yǎng)基中生長。兩組實驗均設置了3個重復。

菌株A3在添加濃度為150 mmol·L-1的Al3+中與對照相比，其生長受到鋁離子的影響, 在12 h、48 h和120 h的培養(yǎng)時間里，可以觀察到這3個時間點其生長速度接近對照。說明鋁離子對粘紅酵母A3生長有一定的抑制作用，但其在150 mmol·L-1Al3+中仍能夠適應鋁離子脅迫。

圖4 耐鋁內(nèi)生菌對3種金屬的MIC

Figure 4 MIC of three metals of the isolated alumi num- tolerant endophytic fungus

圖5 Al3+對分離菌株生長的影響

Figure 5 Effect of Al3+on the growth of the isolated strain

圖6 Al3+對菌株pH值的影響

Figure 6 Effects of Al3+on the pH value of the strain

圖7 不同濃度Al3+對菌株細胞內(nèi)鋁離子含量的影響

Figure 7 Effects of different concentrations of Al3+in the me dium on Al3+content in the strain

2.5 茶樹耐鋁內(nèi)生菌鋁脅迫pH變化

將A3菌分別接種于不含鋁鹽和鋁離子濃度為150 mmol·L-1的PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r·min-1條件下進行培養(yǎng)。生長情況（圖6）顯示，隨著生長時間的增加，未加鋁鹽的培養(yǎng)基中菌體pH在培養(yǎng)12 h下降，說明此時菌體有酸性代謝物質(zhì)產(chǎn)生，隨后pH緩慢上升。與對照相比，添加了150 mmol·L-1的Al3+的培養(yǎng)基中的菌液pH基本維持下2左右不變，并且生長良好，說明該菌株耐酸性較強。pH值遠低于未加鋁鹽的，可能是因為鋁鹽呈現(xiàn)酸性。該菌株在120 h培養(yǎng)過程中基本維持pH值為2。

圖8 不同濃度Al3+對菌株細胞內(nèi)含水量的影響

Figure 8 Effects of different concentrations of Al3+in the medium on intracellular water content of the strain

2.6 茶樹耐鋁內(nèi)生菌鋁含量測定

如圖7所示，菌體內(nèi)鋁含量與培養(yǎng)基鋁離子含量呈正相關，說明菌體對鋁離子的吸附能力較強，鋁離子不容易被飽和，也反應出鋁離子的載體通道比較多。每種鋁含量設置3個重復，3次實驗數(shù)據(jù)方差較小，故不設置誤差線。

2.7 茶樹耐鋁內(nèi)生菌細胞含水量的測定

如圖8所示，培養(yǎng)基鋁離子含量在0～0.10 mol·L-1范圍內(nèi)，耐鋁菌株A3細胞含水量與培養(yǎng)基內(nèi)鋁離子濃度呈正向協(xié)同關系。菌株A3對鋁離子的適應可能與細胞過多攝入水有關。通過鋁離子通道進入A3細胞的鋁離子數(shù)量越多，胞內(nèi)鋁離子濃度越高，A3細胞即反射性地主動攝入更多的水，從而形成較大物理靜水壓，以對抗由于鋁離子濃度升高而產(chǎn)生的高化學滲透壓。受菌體細胞體積所限，細胞攝入水速度不斷下降，水攝入量不能與培養(yǎng)基內(nèi)在0.10～0.20 mol·L-1高鋁濃度下所進入細胞的鋁鹽含量成一階正比函數(shù)關系。

3 討論與結論

本研究從茶樹品種‘舒茶早’的根中分離、篩選得到了1株耐受鋁離子濃度為250 mmol·L-1、耐受錳離子濃度為50 mmol·L-1的菌株，經(jīng)鑒定為粘紅酵母。該菌株耐鋁水平較Wang等[17]從土壤中分離的紅酵母的耐鋁程度更高。

與對照相比，鋁離子在150 mmol·L-1濃度下對粘紅酵母A3生長具有一定的抑制作用。這與Wang等人發(fā)現(xiàn)的紅酵母RS1可在高達200 mmol·L-1的A13+中生長，但是50 mmol·L-1的A13+就對其產(chǎn)生了毒害作用相一致[17]。Thompson等[18]也發(fā)現(xiàn) Al 可以明顯地抑制真菌的生長，而葛德永[19]和趙麗偉[20]等研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的 A13+(10 mmol·L-1)可以促進耐鋁菌絲體和酵母細胞的生長。耐鋁霉菌的生長是對鋁表現(xiàn)出依賴性，在無鋁條件下，菌株不生長或生長不好。Wakao等[21]發(fā)現(xiàn)一些嗜酸菌也是依靠鋁的，高Al環(huán)境可以明顯促進其生長。這些差異可能是由菌體對pH和鋁敏感程度不同造成的。

本研究中分離到的耐鋁菌株A3在培養(yǎng)基不加鋁的條件下，培養(yǎng)基pH的變化由菌株細胞代謝引起，pH有一定的變化，表明該菌株生長旺盛，有較多的酸性及堿性代謝產(chǎn)物產(chǎn)生。但其在150 mmol·L-1鋁離子脅迫時，該菌株的pH卻基本無改變，說明其在鋁離子脅迫下不通過產(chǎn)生酸性或堿性物質(zhì)來轉變鋁離子形式，以應對鋁離子脅迫，而可能是通過在胞內(nèi)產(chǎn)生配合物以絡合鋁離子的方式來減輕毒害的，這與Wang等[17]的研究相同。低鋁時菌體活動對pH有明顯影響，高鋁時pH變化不明顯。小西茂毅等[22]發(fā)現(xiàn)多聚天冬氨酸和多聚谷氨酸可以減輕鋁引起的花粉管生長抑制作用。他們分離到耐鋁真菌培養(yǎng)后的介質(zhì)對鋁引起的花粉管生長抑制有減輕作用，將耐鋁細菌培養(yǎng)后的介質(zhì)加入可以逆轉鋁脅迫引起的花粉管生長抑制，表明分離到的耐酸鋁在其生長過程中，釋放出某些物質(zhì)，可能是蛋白質(zhì)和絡合劑，從而屏蔽了離子態(tài)鋁，提高了培養(yǎng)基的pH。

耐鋁菌株A3在250 mmol·L-1的鋁離子濃度范圍內(nèi)，其胞內(nèi)鋁離子含量占總鋁離子含量是定值，這說明這種選擇透過性不因鋁離子濃度升高而降低。研究還發(fā)現(xiàn)，耐鋁菌株A3伴隨著鋁離子脅迫程度的增加其吸水量相應增大，這與耐鋁菌通過吸收水含量調(diào)節(jié)細胞、維持細胞內(nèi)的平衡達到規(guī)避鋁脅迫的目的有關。相對于培養(yǎng)基中高濃度鋁，耐鋁微生物能保持細胞極低鋁濃度，說明高耐鋁微生物主要通過有效地將鋁屏蔽于細胞外達到解鋁毒目的[23-24]，但關于微生物屏蔽鋁的具體機制并不清楚。對于進入到細胞質(zhì)內(nèi)的鋁，微生物主要通過有機酸或其他螯合物質(zhì)與鋁螯合減輕細胞內(nèi)鋁毒害[25]。胡振民等[26]研究發(fā)現(xiàn)，紅酵母 RS細胞壁磷含量在 70 mmol·L-1鋁處理后顯著升高。關于耐鋁菌株A3的耐鋁機制仍需進一步對其進行研究，我們現(xiàn)在正在做這方面的工作。

耐鋁菌A3耐鋁、酸程度較高，可以應用于鋁、酸含量較高的污染土壤中，這些微生物可以通過減少土壤溶液中的鋁，在不影響土壤的微生物群落和動物種群的條件下[19]，對緩解植物的鋁脅迫有一定的應用前景。

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Screening and identification of aluminum-tolerant endophytic fungi in tea plant roots

ZHANG Shuncheng, WU Ping'an, LI Jing, DING Yue, WU Hao, GENG Yuanming, ZHANG Kuanchao, YU Mei

(School of Life Sciences, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

Tea plants are typical aluminum-tolerant plants, and their root microorganisms play important roles in the absorption and transformation of aluminum. In this study, an endophytic fungi with aluminum tolerance was isolated from the roots of tea plants. Microscopic morphological identification and 18S rDNA sequence analysis were carried out to analyze the tolerance degree of the strain to different heavy metals and to study the effect of aluminum on the growth of the strain. The tolerance ability of the strain to Al3+was analyzed by inductively coupled plasma atomic emission spectrometer (ICP-AES)，and the results showed that the fungus belonged to, numbered A3 by microscopic morphology observation and 18S rDNA sequence analysis. The tolerance of the strain to three heavy metals was: Al3+> Mn2+> Cu2+, and the strain could grow in the presence of Al3+up to 250 mmol·L-1. The pH value of the strain in the culture medium was 2.0 - 3.0 when 150 mmol·L-1Al3+was added to the medium. ICP-AES results showed that the aluminum ion content in the strain was positively correlated with the Al3+concentration in the medium, which indicated that the strain has adsorption ability on the Al3+in a certain range. Meanwhile, it was also determined that the water content of the strain increased with the increase of the aluminum content in the medium, which revealed that the avoidance of aluminum toxicity of the strain might be related to the equilibrium cell fluid through the increase of water content. The aluminum-tolerant fungus isolated in this study might provide new ideas for the aluminum-tolerant mechanism of tea plants, and provide microbial resources for their colonization in other crops to avoid aluminum stress, so as to improve plant resistance and increase yield.

tea plant; aluminum resistant; endophyte;

S571.1; X172

A

1672-352X (2021)05-0744-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211022.005

2021-10-25 15:57:11

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20211022.1530.010.html

2020-09-15

國家級大學生創(chuàng)新項目（dg194205）資助。

章順成，碩士研究生。E-mail：15156046608@163.com

通信作者:余 梅，博士，副教授。E-mail：yumei@ahau.edu.cn 張寬朝，高級實驗師。E-mail：zhangkch1980@126.com