超高效液相色譜?串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定大麻植物中8種大麻素

任雁明，解潤芳，王 蕊，熊積斌，趙臣飛，楊盛曄，楊永祎，李樹華，張瑞林

(昆明醫(yī)科大學(xué) 司法鑒定中心，法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500)

大麻（Cannabis sativaL.）是?？拼舐閷僦参铮瑸橐荒晟荼局参?，高1～3 m.根木質(zhì)，莖直立，具縱溝，灰綠色，密被短柔毛，皮層富含纖維.根據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院的研究，大麻植物含有400多種化學(xué)成分.目前從大麻植株中已分離出70多種大麻素類化合物，其主要活性成分有四氫大麻酚（tetrahydrocan nabinol，THC）、大麻二酚（cannabidiol，CBD）及其前體大麻二酚酸（cannabidiolic acid，CBDA）、次大麻二酚（cannabivarin，CBDV）、大麻酚（cannabidiol，CBN）、大麻萜酚（cannabigerol，CBG）和四氫大麻酚丙基同系物（THCV）等.THC可由其前體四氫大麻酚酸A（THCA-A）在熱及光照作用下發(fā)生脫羧反應(yīng)生成[1].THC是天然大麻中精神活性最強的成分，其含量的多少是衡量大麻植物及其制品優(yōu)劣的主要標(biāo)準[2].CBD為非成癮性成分，具有抗痙攣、抗焦慮、抗炎和抗氧化作用，為目前醫(yī)學(xué)領(lǐng)域開發(fā)應(yīng)用最多的一個大麻素活性成分.

截至2019年1月，共有41個國家宣布醫(yī)用大麻合法，超過50個國家宣布了CBD合法，大麻植物中提取的CBD及其衍生物被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、保健品和化妝品等領(lǐng)域.THC的含量是區(qū)分工業(yè)大麻與娛樂性大麻的關(guān)鍵，歐盟等多國法律規(guī)定THC質(zhì)量分數(shù)低于0.3%的稱之為工業(yè)大麻，高于1%的屬于娛樂性大麻/毒品，THC質(zhì)量分數(shù)在0.3%到1%之間的為中間型大麻.云南省于2009年頒布了《云南省工業(yè)大麻種植加工許可規(guī)定》，規(guī)定THC質(zhì)量分數(shù)低于0.3%（干物質(zhì)）的大麻屬原植物及其提取產(chǎn)品為工業(yè)大麻[3].從工業(yè)大麻花葉加工提取的THC質(zhì)量分數(shù)高于0.3%的產(chǎn)品，適用毒品管制規(guī)定.然而，目前對大麻植物、保健品和化妝品中THC、CBD等大麻素及其衍生物的快速定量還沒有建立技術(shù)標(biāo)準，因此，建立大麻植物中8種主要大麻素（分子結(jié)構(gòu)如圖1所示）的快速定量檢測方法具有非常重要的意義和社會應(yīng)用價值.

圖1 8種主要大麻素類化合物的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of eight major cannabinoids

目前對大麻素的檢測方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法[4-5]、高效液相色譜法[6-7]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10].由于大麻素類化合物的分子極性較大，氣相色譜-質(zhì)譜法在檢測大麻素時需要衍生化處理，同時對熱穩(wěn)定性差的大麻素分析存在局限性，操作繁瑣耗時[11].高效液相色譜法靈敏度低、受基質(zhì)干擾較大[12]，不能滿足痕量大麻素的檢測.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法分析范圍廣、選擇性好、靈敏度高、分析結(jié)果可靠[13]，是檢測大麻素類化合物的優(yōu)選方法.目前報道的大麻素類化合物的檢測主要集中于THC、CBD和CBN，鮮見同時檢測更多種大麻素的報道.因此本研究采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時對大麻植物中的8種主要大麻素進行定量分析，為建立大麻植物中多種大麻素檢測標(biāo)準和法醫(yī)學(xué)鑒定提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑島津高效液相色譜儀LC-20ADXR與三重四極桿LCMS-8040聯(lián)用系統(tǒng)，配有LC-20ADXR×2輸液泵，SIL-20AXR自動進樣器，CBM-20A系統(tǒng)控制器，CTO-20A 柱溫箱，F(xiàn)CV-20AH2高壓流路切換閥，LCMS-8040三重四極桿質(zhì)譜儀，LabSolutions Ver.5.91色譜工作站，CHIMADZU Shim-pack GIST-HP C18（φ2.1 mm×100 mm，3μm）和CHIMADZU Shim-pack Velox PFPP（φ2.1 mm×100 mm，2.7μm）色譜柱.

8種大麻素標(biāo)準品購自北京芬格爾安科技有限責(zé)任公司；乙腈（LC-MS級，德國Merck公司），Mili-Q超純水，乙酸銨（LC-MS級，美國Sigma公司），甲酸（LC-MS級，美國Sigma公司）.

大麻植物合法取自云南祿豐和瀘西某大麻種植基地.

1.2 分析條件液相條件：CHIMADZU Shim-pack Velox PFPP（φ2.1 mm×100 mm，2.7μm）色譜柱，柱溫40℃；流動相A為20 mmol/L乙酸銨和0.1%甲酸緩沖液（pH值約為4），流動相B為乙腈；洗脫程序：0～2 min，50%B；2～5 min，50%～95%B；5.01～8 min，50%B；流速為0.3 mL/min，進樣體積為2μL.

質(zhì)譜條件：電噴霧電離-正負離子模式（ESI±），檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），霧化氣流量：3 L/min，DL溫度：250℃，加熱塊溫度：400℃，干燥氣流量：15 L/min，轉(zhuǎn)換打拿極電壓：6.0 kV，CID氣：230 kPa，8種大麻素檢測的采集參數(shù)優(yōu)化結(jié)果見表1.

表1 檢測8種大麻素的MRM方法參數(shù)Tab.1 MRM method parameters of eight cannabinoids determination

1.3 樣品前處理分別將來自不同產(chǎn)地的大麻植物樣品的花和葉自然晾干后研磨成均勻細粉備用.準確稱取10 mg大麻植物粉末于20 mL離心管中，加入10 mL甲醇，超聲震蕩1 h，然后在4℃條件下以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，取適量上層清液稀釋，過0.22μm濾膜待測.

2 結(jié)果

2.1 LC-MS/MS檢測條件優(yōu)化為選擇合適的色譜柱，采用CHIMADZU Shim-pack GIST-HP C18（φ2.1 mm×100 mm，3μm）和CHIMADZU Shimpack Velox PFPP（φ2.1 mm×100 mm，2.7μm）2款色譜柱進行檢測，結(jié)果表明五氟苯基色譜柱的分離效果較好，能有效將8種大麻素分離.此外，還對流動相組成、流動相梯度等參數(shù)進行了優(yōu)化，獲得了本文分析8種大麻素的LC-MS/MS檢測條件（詳見1.2）.

在電噴霧電離-正負離子模式下，分別對8種大麻素100 ng/mL單標(biāo)溶液作一級質(zhì)譜母離子全掃描，CBDA和THCA-A在負離子模式下的質(zhì)譜響應(yīng)值要高于正離子模式，因此這兩種大麻素采用負離子模式進行檢測，其余6種大麻素采用正離子模式進行檢測.8種大麻素（混合標(biāo)準溶液）的MRM色譜圖見圖2.

圖2 8種大麻素標(biāo)準品的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖Fig.2 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatograms of eight standard cannabinoids

2.2 靈敏度和線性配制8種大麻素的系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準溶液（5、10、20、50、100、200、500 μg/L），在1.2分析檢測條件下測定，分別以8種大麻素的定量離子峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準曲線，結(jié)果見表2.由表2中的數(shù)據(jù)可以看出，8種大麻素的標(biāo)準曲線相關(guān)線性系數(shù)均大于0.99，表明8種目標(biāo)分析物在質(zhì)量濃度5～500μg/L內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，可滿足定量分析的要求.以線性最低點混合標(biāo)準溶液逐級稀釋后測定，以SNR（S/N）大于3作為檢測限的檢驗水準，以（S/N）大于10作為最低定量限的檢驗水準，測得8種大麻素的LOD范圍為0.13～1.26 μg/L，LOQ范圍為0.39～3.83μg/L（表2）.

表2 測定8種大麻素的線性參數(shù)、檢測限和定量限Tab.2 Linearity parameters，LODs and LOQs of determination methods of eight cannabinoids

2.3 精密度分別測定8種大麻素的系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準溶液（5、50、500μg/L）的日內(nèi)精密度（早上、中午和晚上）和日間精密度（連續(xù)3 d，中午），每個質(zhì)量濃度重復(fù)采集5次.由其保留時間（tR）和定量離子對峰面積（A）的相對標(biāo)準偏差（RSD）評估日內(nèi)精密度和日間精密度，結(jié)果表明保留時間的RSD值為0.10%～0.43%，定量離子峰面積的RSD值為3.46%～13.41%（表3），表明該方法的重現(xiàn)性好.

表3 測定8種大麻素的日內(nèi)精密度和日間精密度Tab.3 Intra-day and inter-day precision of determination of eight cannabinoids

2.4 穩(wěn)定性從-80℃取出8種大麻素儲備液，配制成系列質(zhì)量濃度混合標(biāo)準溶液（5、50、500μg/L）樣品，立即進樣測定，然后在室溫下放置24 h，再次進樣測定，根據(jù)標(biāo)準曲線計算質(zhì)量濃度，比較立即測定及室溫放置24 h后測定的各大麻素樣品質(zhì)量濃度，考察標(biāo)準溶液室溫放置24 h的穩(wěn)定性.

取新制備的同一大麻植物待測樣品3份，一份立即測定，另外兩份分別在室溫及自動進樣室放置24 h后測定，以新鮮配制的溶液標(biāo)準曲線計算質(zhì)量濃度，考察待測樣品在室溫及自動進樣室環(huán)境下放置24 h的穩(wěn)定性.

結(jié)果顯示,3組質(zhì)量濃度大麻素標(biāo)準溶液立即測定和室溫放置24 h后5次測定的質(zhì)量濃度比值均接近于1，表明8種大麻素標(biāo)準溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定.樣品在立即測定、室溫及自動進樣室放置24 h后測定得到的8種大麻素質(zhì)量濃度的RSD值在0.47%～1.85%之間，表明樣品在室溫及自動進樣室環(huán)境下至少能穩(wěn)定放置24 h.

2.5 耐受性取8種大麻素混合標(biāo)準溶液（500 ng/mL）樣品及大麻植物待測樣品，分別在柱溫±5℃、流速±0.6 mL/min、流動相pH值±0.2條件下進行試驗，各大麻素的拖尾因子（Tailing factor，TF）不超過2.0，各條件下標(biāo)準溶液樣品及待測樣品重復(fù)進樣6針，根據(jù)標(biāo)準曲線計算質(zhì)量濃度，8種大麻素質(zhì)量濃度（ρ）的相對標(biāo)準偏差不超過2.0%，以此考察本方法的耐受性.

結(jié)果表明（表4）在柱溫±5℃、流速±0.6 mL/min、流動相pH值±0.2條件下，標(biāo)準溶液樣品及待測樣品中8種大麻素的拖尾因子沒有明顯變化，標(biāo)準溶液樣品中各大麻素測定質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準偏差在0.21%～1.56%之間，待測樣品中各大麻素質(zhì)量濃度的相對標(biāo)準偏差為0.43%～1.87%，說明該方法的耐受性良好.

表4 不同色譜條件下標(biāo)準溶液樣品中各大麻素的拖尾因子及測定質(zhì)量濃度的RSD值Tab.4 The tailing factor of each cannabinoid in the standard solution sample and the RSD value of the concentration determination under different chromatographic conditions

2.6 大麻植物中8種大麻素的定量分析根據(jù)所建方法對云南祿豐、瀘西某大麻種植基地的大麻植物樣品進行檢測（圖3），由檢測結(jié)果（見表5）可知，大麻植物樣品中8種大麻素含量最高的為CBDA（3.99～11.06 mg/g），含量最低的為CBN（0.001～0.02 mg/g）.CBD的質(zhì)量分數(shù)在1.27～7.47 mg/g之間，THC的質(zhì)量分數(shù)在0.13～1.79 mg/g之間，THC干物質(zhì)質(zhì)量分數(shù)低于0.3%，符合《云南省工業(yè)大麻種植加工許可規(guī)定》的標(biāo)準.

表5 不同產(chǎn)地大麻植物樣品中8種大麻素的檢測結(jié)果Tab.5 Detection results of eight cannabinoids in cannabis plant samples from different place mg/g

3 討論

目前，國內(nèi)外基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對大麻素的檢測研究主要集中在大麻食品基質(zhì)[9-10,14-16]及人體毛發(fā)[8,17]，關(guān)于大麻植物中大麻素的檢測方法報道較少[18]，且國內(nèi)外對大麻素的檢測種類大多僅涉及THC、CBD、CBN.本研究建立了大麻植物中8種大麻素類化合物的快速檢測方法，擴充了大麻植物中大麻素的檢測種類.本研究采用溶劑直接提取法，用甲醇提取大麻植物中8種大麻素，每個樣品儀器分析僅需8 min（圖3），具有較高的分析效率，適用于大批量樣品的定量分析.

圖3 祿豐大麻樣品A的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖Fig.3 Multiple reaction monitoring（MRM）chromatogram of cannabis sample A from Lufeng

由于大麻素含有酚羥基或羧基，極性較大，普通的C18色譜柱很難對其保留.五氟苯基反向色譜柱（PFPP）以超純硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有五氟苯基，五氟苯基可產(chǎn)生較強的偶極誘導(dǎo)作用，對芳環(huán)、雜環(huán)化合物等易極化的物質(zhì)有較強的分離能力，PFPP柱特別適用于苯基化學(xué)結(jié)構(gòu)相似的大麻素類物質(zhì)的分離.

通過對方法的線性范圍、LOQ、LOD、精密度等關(guān)鍵參數(shù)的評估，表明8種大麻素的測定在質(zhì)量濃度5～500μg/L內(nèi)具有較好的線性關(guān)系，8種大麻素的LOD范圍為0.13～1.26μg/L，LOQ范圍為0.39～3.83μg/L，方法的靈敏度高，定量準確，可滿足痕量大麻素的定量分析要求.保留時間的RSD值為0.10%～0.43%，定量離子峰面積的RSD值為3.46%～13.41%，表明本方法的保留時間、定量離子峰面積的重現(xiàn)性好，同時該方法具有良好的穩(wěn)定性及耐受性. 將本方法應(yīng)用于大麻植物檢測，在6份大麻植物樣品中均檢測出8種大麻素，其中THC的質(zhì)量分數(shù)低于0.3%，表明種植大麻產(chǎn)品符合《云南省工業(yè)大麻種植加工許可規(guī)定》的標(biāo)準.

綜上所述，本研究建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法，能同時對大麻植物中8種大麻素進行準確定量，具有良好的靈敏度、精密度和較強的可行性及適用性，可為云南大麻植物檢測標(biāo)準建立和法醫(yī)學(xué)鑒定提供技術(shù)支持.