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    高脂飲食對(duì)生長(zhǎng)期大鼠體質(zhì)量和骨質(zhì)量影響的研究*

    2021-12-04 02:45:22閻國(guó)強(qiáng)劉莉莉趙丹慧
    關(guān)鍵詞:骨量雌性雄性

    閻國(guó)強(qiáng) 劉莉莉 梁 震 任 娟 舒 雄 趙丹慧

    (1.北京積水潭醫(yī)院/北京市創(chuàng)傷骨科研究所,北京 100035)(2.北京積水潭醫(yī)院針灸科,北京 100035)(3.中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心,北京 100088)

    兒童肥胖已經(jīng)成為日益嚴(yán)峻的健康問(wèn)題[1],不僅是影響體質(zhì)量,還影響到包括骨骼在內(nèi)的多個(gè)器官和系統(tǒng)[2-4]。然而,肥胖對(duì)不同性別兒童骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)和骨質(zhì)量的影響還沒(méi)有深入的研究。由于人類肥胖的原因大多是由能量攝入過(guò)多導(dǎo)致脂肪堆積,所以高脂飼料飼喂是最常用的建模方式。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)生長(zhǎng)期SD大鼠的方法建立兒童肥胖模型,并探討高脂飲食對(duì)雌、雄生長(zhǎng)期大鼠體質(zhì)量和骨質(zhì)量的影響,并對(duì)差異性進(jìn)行分析。

    1 材料和方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

    24只SPF級(jí)21日齡 SD大鼠,雌雄各半,體質(zhì)量50~60 g,購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(京)2019-0010,飼養(yǎng)于北京積水潭醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室SPF屏障設(shè)施內(nèi)的IVC籠盒內(nèi),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào):SYXK(京)2017-0035。室溫:23~27 ℃,相對(duì)濕度:(55±5)%,24 h恒溫恒濕。12 h/12 h晝夜循環(huán),自由進(jìn)食飲水,3只/籠盒。本實(shí)驗(yàn)遵循科技部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》,按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷,并經(jīng)北京積水潭醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn),積倫動(dòng)審字第201909-01。

    1.2 飼料配方

    1.2.1SPF級(jí)繁殖鼠料(g):豬油(2.00)、酪蛋白(20.00)、玉米淀粉(26.00)、麥芽糊精(3.50)、蔗糖(35.00)、纖維素(5.00)、豆油(2.50)、檸檬酸鉀(1.65)、磷酸鈣(1.68)、碳酸鈣(0.71)、無(wú)機(jī)鹽(1.00)、維生素(1.00)以及胱氨酸(0.30)。其中鈣含量(%):1.10;磷含量(%):0.60。

    1.2.2SPF級(jí)60%脂供能高脂飼料(g):豬油(31.66)、酪蛋白(25.84)、麥芽糊精(17.15)、蔗糖(8.85)、纖維素(6.46)、豆油(3.23)、檸檬酸鉀(1.20)、磷酸鈣(1.68)、碳酸鈣(0.71)、無(wú)機(jī)鹽(1.29)、維生素(1.29)以及胱氨酸(0.38)。其中鈣含量(%):1.10和磷含量(%):0.60。

    1.3 主要試劑與儀器

    戊巴比妥鈉(上海通善生物科技有限公司);多聚甲醛(廣州賽國(guó)生物科技有限公司);Micro-CT(型號(hào):Skyscan 1172,Brucker MicroCT),電子天平(型號(hào)YHC-11001 A,瑞安市英衡電器有限公司)。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1動(dòng)物分組:24只大鼠隨機(jī)分為普食組和高脂組,n=12,各組雌雄各半。實(shí)驗(yàn)大鼠分別給予SPF繁殖飼料和60%脂供能高脂飼料喂養(yǎng)6周后,使用過(guò)量的3%戊巴比妥鈉6 mL/kg腹腔注射安樂(lè)死取材。

    1.4.2體質(zhì)量檢測(cè):使用電子秤測(cè)量大鼠的體質(zhì)量,每只大鼠測(cè)量?jī)纱?,結(jié)果取兩次測(cè)量數(shù)值的平均值。

    1.4.3骨質(zhì)量檢測(cè):微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro Computed Tomography,Micro-CT),是一種非破壞性的三維成像技術(shù),可以在不破壞樣本的情況下,清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)[5]。使用Micro-CT對(duì)大鼠右側(cè)股骨進(jìn)行掃描,掃描范圍是股骨遠(yuǎn)端1/3部分,掃描參數(shù)為:電壓45 kv;電流165 μA;曝光時(shí)間500 ms;旋轉(zhuǎn)角度180°;旋轉(zhuǎn)步長(zhǎng)是0.4°;過(guò)濾器采用0.5 mm AL;掃描分辨率是8 μm。掃描完畢后使用系統(tǒng)自帶軟件(CTan,V1.14.4)對(duì)掃描圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和三維重建。掃描區(qū)域?yàn)楣晒沁h(yuǎn)端生長(zhǎng)板上方100~400層,厚度為2.4 mm的松質(zhì)骨。檢測(cè)指標(biāo)包括骨密度(BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨表面積骨體積比(BS/TV)、骨小梁間隙(Tb.Sp)、骨表面積體積比(BS/BV)和骨小梁厚度(Tb.Th)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 高脂飲食對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

    21日齡大鼠,兩組比較,在雌性和雄性體質(zhì)量均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。6周后大鼠的體質(zhì)量均明顯增加,與普食組比較,高脂組大鼠體質(zhì)量明顯增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),且雄性大鼠體質(zhì)量的增長(zhǎng)速度更快,見(jiàn)表1。

    表1 實(shí)驗(yàn)前后大鼠體質(zhì)量的比較(g)

    2.2 高脂飲食對(duì)大鼠BMD的影響

    飼養(yǎng)6周后,與普食組相比,高脂組大鼠BMD均明顯降低,但僅雌性大鼠BMD下降,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)表2。

    表2 高脂飲食對(duì)大鼠BMD的影響(g/cm)

    2.3 高脂飲食對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

    飼養(yǎng)6周后,與普食組相比,高脂組大鼠BV/TV,BS/TV和Tb.Sp出現(xiàn)明顯降低(P<0.05),而B(niǎo)S/BV和Tb.Th變化不明顯(P>0.05),見(jiàn)表3和圖1。

    表3 高脂飲食對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響

    圖1 大鼠股骨遠(yuǎn)端骨小梁三維重建圖

    3 討論

    人類肥胖的主要原因與能量攝入過(guò)多導(dǎo)致脂肪堆積有關(guān),所以實(shí)驗(yàn)常采用高脂飼料誘導(dǎo)的營(yíng)養(yǎng)性肥胖大鼠來(lái)研究肥胖的機(jī)制及肥胖引起的相關(guān)疾病[6-7]。大鼠在不同的生長(zhǎng)階段體質(zhì)量增加的內(nèi)容不同,幼年期主要以肌肉和骨骼為主,成年期主要以脂肪增加為主。目前,對(duì)于肥胖動(dòng)物模型的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚不完全統(tǒng)一,如徐云鵬等[8]報(bào)道,根據(jù)大鼠體質(zhì)量和 Lee’s 指數(shù)評(píng)估大鼠肥胖程度,篩選高脂組大鼠,將體質(zhì)量和 Lee’s指數(shù)高于正常對(duì)照組并有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異者認(rèn)定為肥胖模型。除此之外,也有實(shí)驗(yàn)超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量10%~15%作為建模成功標(biāo)準(zhǔn),更加嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)造模是Yang等[9]超過(guò)對(duì)照組平均體質(zhì)量20%視為建模成功。本研究采用21日齡 SD大鼠高脂飲食誘導(dǎo)6周,高脂組大鼠體質(zhì)量均超過(guò)普食組大鼠平均體質(zhì)量10%,其中雌鼠和雄鼠的增長(zhǎng)分別是11%和18.9%,證明肥胖大鼠模型建立基本成功,但未能達(dá)到理想值20%,原因可能是造模過(guò)程中存在肥胖抵抗的個(gè)體所致。SD大鼠的肥胖呈中心性肥胖,造模符合飲食誘導(dǎo)的腹心性肥胖[10],適合研究長(zhǎng)期高脂飲食造成的肥胖對(duì)骨代謝的影響。

    根據(jù)Liab等[11]報(bào)道,在骨量指標(biāo)中, BMD是最能代表骨含量的參數(shù)。實(shí)驗(yàn)飼喂6周后,雌性大鼠出現(xiàn)骨質(zhì)疏松,而雄性大鼠的BMD雖降低,但尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此說(shuō)明幼年雌性大鼠在高脂飼料誘導(dǎo)下更容易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松,這與Zhao等[12]臨床研究發(fā)現(xiàn)的肥胖女童BMD和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)之間存在關(guān)聯(lián)的結(jié)果具有一致性,主要原因可能與雌性大鼠BMD開(kāi)始上升及達(dá)到峰值的時(shí)間較早于雄性大鼠有關(guān)。

    BV/TV為松質(zhì)骨骨量評(píng)價(jià)常用指標(biāo),對(duì)于髓腔內(nèi)松質(zhì)骨而言,該比值能夠反應(yīng)不同樣本骨小梁骨量的多少。BS/TV可以間接反映骨量多少。在骨微結(jié)構(gòu)中,Tb.Sp為骨小梁之間的髓腔寬度,其增加提示骨吸收增加,可能發(fā)生骨質(zhì)疏松[13]。造模后,與普食組相比,高脂組BV/TV、BS/TV及 Tb.Sp均顯著降低,說(shuō)明雌性和雄性大鼠的骨量都明顯丟失。

    BS/BV能夠間接反應(yīng)骨代謝狀況,該值升高說(shuō)明骨合成代謝大于分解代謝,骨量增加,反之亦然。造模后,與普食組相比,高脂組BS/TV和Tb.Th無(wú)顯著性差異,可能是由于未成年大鼠的骨活性或成骨能力未發(fā)生明顯變化,只是出現(xiàn)了骨量的整體性缺失。高脂飲食對(duì)骨骼系統(tǒng)的影響并不是單一方向的,而是存在正向和負(fù)向的雙重作用。一方面, 隨體質(zhì)量上升的脂肪和肌肉的質(zhì)量對(duì)骨骼施加的機(jī)械負(fù)荷增加, 進(jìn)而刺激骨轉(zhuǎn)換, 促進(jìn)骨量的積累; 另一方面, 脂肪過(guò)度積累帶來(lái)能量代謝異常, 將改變體內(nèi)激素水平及增加促炎性因子, 可引起骨代謝紊亂和骨量丟失[14-15]。

    綜上所述,經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)的生長(zhǎng)期SD大鼠可造成部分大鼠肥胖,其中雄性大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)速度更快,更適合做肥胖模型動(dòng)物。高脂飲食能夠誘導(dǎo)生長(zhǎng)期大鼠出現(xiàn)成骨能力未降低的骨質(zhì)疏松,形成骨量整體性缺失,且雌性比雄性更為顯著。根據(jù)結(jié)果進(jìn)一步推論,生長(zhǎng)期的高脂飲食可能與骨質(zhì)疏松具有一定的相關(guān)性,但本研究?jī)H從骨的微結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行了研究,今后將在更多層面就其機(jī)制的相關(guān)性進(jìn)行深入實(shí)驗(yàn)探索。

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