膀胱癌患者外周血CTC細(xì)胞中survivin的表達(dá)及意義

毛天賜，張偉，羅娟

1.空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院泌尿外科，陜西 西安 710038；2.西安市兒童醫(yī)院耳鼻喉科，陜西 西安 710038

膀胱癌主要是指發(fā)生在膀胱黏膜上的惡性腫瘤，在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中十分常見。此病的發(fā)生與患者吸煙、職業(yè)接觸等因素相關(guān)，臨床上患者多出現(xiàn)血尿、尿頻、尿急、尿流梗阻等癥狀，對(duì)其正常生活帶來極大困擾，癥狀嚴(yán)重者危及生命[1-3]。膀胱癌患者較多數(shù)以浸潤的方式生長，首次治療后，具有較高的復(fù)發(fā)率，且患者遠(yuǎn)期生存率較低，血行轉(zhuǎn)移主要以外周血中存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)為基礎(chǔ)，是膀胱癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑[4-5]。而生存蛋白(survivin)是一種凋亡抑制基因，與腫瘤的進(jìn)展、轉(zhuǎn)移之間具有一定相關(guān)性[6]。本研究對(duì)膀胱癌患者外周血CTC進(jìn)行檢測，觀察其survivin的表達(dá)情況，分析其與患者腫瘤直徑、腫瘤分期等的相關(guān)性，進(jìn)一步探究是否將其作為膀胱癌病情發(fā)展情況的監(jiān)測指標(biāo)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院于2019年1月至2020年11月期間收治的54膀胱癌患者為研究對(duì)象。其中男性40例，女性14例；年齡35～80歲，平均(57.50±3.22)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理證實(shí)，確診為膀胱癌；②未合并其他惡性腫瘤者；③同意納入本研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心腦血管疾病，肝腎功能不全者；②近期接受抗腫瘤治療者；③具有精神類障礙，無法進(jìn)行正常溝通交流者；④因其他原因中途放棄治療者；⑤臨床資料不全者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施。

1.2 觀察指標(biāo)與評(píng)價(jià)(檢測)方法 比較不同腫瘤直徑(<3 cm、≥3 cm)、病理分級(jí)(低級(jí)別、高級(jí)別)、腫瘤分期(T分期即

1.2.1 CTC檢測 首先應(yīng)用紅細(xì)胞裂解液對(duì)采集的外周血樣本進(jìn)行處理，去除紅細(xì)胞，之后以免疫磁珠分離法去除CD45+的白細(xì)胞。采取膜濾過法自白細(xì)胞中分離出CTC。最后，使用EDTA抗凝真空采血管再次采集膀胱癌患者10 mL的外周靜脈血，將最初收集的2 mL去除掉，以輕柔的力度將其進(jìn)行上下顛倒，使其處于混勻狀態(tài)。將新鮮的血樣樣本放置于溫度為0℃～4℃的環(huán)境中進(jìn)行保存，在運(yùn)輸過程中，注意避免造成震蕩、碰撞。將紅細(xì)胞裂解液加入血樣中，同樣以輕柔的力度將其進(jìn)行上下顛倒，使其處于混勻的狀態(tài)；將其放置于室溫環(huán)境中，持續(xù)5～8 min，至出現(xiàn)透明紅的情況。之后進(jìn)行4℃的離心，300×g，持續(xù)10 min，離心處理后，可見管底處有淡紅色的細(xì)胞，呈團(tuán)塊狀，將上清棄掉，之后加入4 mL的磷酸鹽緩沖液(PBS)，將細(xì)胞重懸，并保持輕柔的動(dòng)作，對(duì)其細(xì)胞團(tuán)塊進(jìn)行上下捶打，使其呈分散狀。重懸細(xì)胞后，將200μL抗CD45的免疫磁珠加入，并放置于溫度為2℃～8℃的環(huán)境中進(jìn)行孵化，持續(xù)30 min，在此期間，以輕柔的動(dòng)作將其傾斜、旋轉(zhuǎn)。選取上清液，使用PBS進(jìn)行重懸，將抗CD45、抗CK8、染核試劑依次加入，并將其混勻，放置于室溫內(nèi)，持續(xù)30 min的孵化，CK8+CD45-DAPI+細(xì)胞便可被定義為CTC，使用24孔的5μm濾膜進(jìn)行過濾，應(yīng)用顯微鏡對(duì)不同型別的CTC進(jìn)行觀察。

1.2.2 survivin蛋白表達(dá)檢測 于含有10%的胎牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基、溫度為37℃、5%CO2條件下，對(duì)CTC細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)之后，應(yīng)用丙酮進(jìn)行相應(yīng)固定，持續(xù)10 min，之后放置于溫度為37℃、0.75%H2O2-PBS的環(huán)境中，持續(xù)浸泡30 min，再應(yīng)用PBS進(jìn)行振洗，之后將封閉血清加入，37℃持續(xù)30 min，將血清棄之，將比例為1∶100的survivin一抗加入，37℃持續(xù)30～60 min，再次使用PBS振洗，之后加入二抗，37℃30 min，PBS進(jìn)行振洗，Tris-HCl緩沖液進(jìn)行振洗，將新鮮的底物溶液浸入，之后進(jìn)行水洗，將蘇木素染液浸入，再用水進(jìn)行清洗，快速過鹽酸酒精，隨后用水洗，再過氨水，之后水洗，脫水過二甲苯，進(jìn)行封片，使用顯微鏡進(jìn)行相應(yīng)觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CTC及survivin檢測結(jié)果 54例膀胱癌患者中25例檢出CTC，陽性率為46.30%(25/54)，主要包括13例上皮型CTC、7例間質(zhì)型CTC、5例為混合型。上皮型CTC中7例為survivin陽性表達(dá)、占比53.85%；間質(zhì)型CTC中均為survivin陽性表達(dá)、占比100.00%；混合型CTC中4例survivin陽性表達(dá)、占比80.00%。間質(zhì)型CTC中survivin陽性率明顯高于上皮型和混合型CTC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.765、4.605，P<0.05)。

2.2 膀胱癌病理特征與CTC陽性率的關(guān)系 腫瘤直徑<3 cm、T分期0.05)，見表1。

表1 膀胱癌病理特征與CTC陽性率的關(guān)系[例(%)]

2.3 膀胱癌病理特征與survivin陽性率的關(guān)系 腫瘤病理分級(jí)中的高級(jí)別、T分期≥T2的survivin檢測陽性率明顯高于低級(jí)別及T分期0.05)，見表2。

表2 膀胱癌病理特征與survivin陽性率的關(guān)系[例(%)]

3 討論

膀胱癌是臨床上常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，具有較高的復(fù)發(fā)率，而腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移與其預(yù)后之間具有密切的關(guān)系[7-9]。因此，及時(shí)對(duì)此病進(jìn)行正確診斷及治療具有重要的臨床意義。研究指出通過分析膀胱癌患者外周血CTC細(xì)胞中survivin的表達(dá)情況，有助于了解其表達(dá)陽性率與患者病理分級(jí)、分期、病灶大小之間的關(guān)系，從而判定患者病情發(fā)展情況[10-11]。另有研究顯示，大約有半數(shù)的肌層浸潤性膀胱癌患者在初期治療時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)微轉(zhuǎn)移的情況[12-13]。

CTC主要是由腫瘤原發(fā)灶腫瘤細(xì)胞脫落、診療操作時(shí)，釋放入血液，隨之會(huì)形成相應(yīng)的腫瘤微轉(zhuǎn)移灶，CTC主要是腫瘤發(fā)生相關(guān)血行轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)，在腫瘤轉(zhuǎn)移中，是其必需的前提之一[14]。對(duì)患者外周血進(jìn)行檢測，若發(fā)現(xiàn)CTC，則可能會(huì)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，預(yù)后情況不佳。CTC主要可分為上皮型CTC、間質(zhì)型CTC、混合型CTC，其中間質(zhì)型CTC遷移、傳播能力較強(qiáng)，具有更強(qiáng)的侵襲能力，通過觀察其數(shù)量、表型的轉(zhuǎn)變，可在一定程度上提示患者疾病進(jìn)展、治療的應(yīng)答情況[15]。survivin屬于一種細(xì)胞凋亡抑制蛋白，主要位于第17號(hào)的染色體長臂上，包括4個(gè)外顯子、3個(gè)內(nèi)含子，此物質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的凋亡具有一定抑制作用。survivin對(duì)細(xì)胞分裂具有調(diào)節(jié)作用，還可有效的參與至腫瘤血管生成過程，在膀胱癌組織中呈現(xiàn)為高表達(dá)[16]。有研究指出，若患者存在CTC，其數(shù)量越多則患者疾病的浸潤性會(huì)越強(qiáng)，復(fù)發(fā)時(shí)間也就相應(yīng)越短，從而會(huì)顯著提高轉(zhuǎn)移的概率，增加患者疾病風(fēng)險(xiǎn)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，54例膀胱癌患者中有25例檢出CTC，陽性率為46.30%(25/54)；腫瘤直徑<3 cm、T分期

本研究主要根據(jù)CanPatrol技術(shù)、免疫磁珠法、膜濾過法等技術(shù)對(duì)膀胱癌患者外周血中的CTC進(jìn)行檢測，與傳統(tǒng)檢測方法比較更加多樣化，且優(yōu)勢更加明顯，可以將白細(xì)胞進(jìn)行更有效的去除，且去除率較高；此外，本研究所應(yīng)用的檢測方法可以對(duì)各種表型的CTC進(jìn)行有效的收集，所收集的CTC細(xì)胞可在細(xì)胞培養(yǎng)、免疫熒光劑基因檢測等檢測中進(jìn)行良好的運(yùn)用，回收率更高[18]。54例膀胱癌患者檢測結(jié)果顯示，上皮型CTC中7例為陽性表達(dá)，占比53.85%；間質(zhì)型CTC中均為陽性表達(dá)，占比100.00%；混合型CTC中4例陽性表達(dá)，占比80.00%。間質(zhì)型陽性率顯著高于上皮型和混合型CTC。這可能是由于，間質(zhì)型CTC的侵襲性較高，可能與survivin的高表達(dá)具有相關(guān)性，survivin通過對(duì)細(xì)胞的凋亡進(jìn)行有效的抑制，對(duì)于細(xì)胞的分裂、腫瘤血管生成具有促進(jìn)作用，從而侵襲性顯著增強(qiáng)。

綜上所述，膀胱癌患者CTC細(xì)胞陽性率、CTC細(xì)胞中survivin陽性表達(dá)與其病理分級(jí)、分期、直徑等之間具有一定相關(guān)性，可作為臨床評(píng)估病情的有效依據(jù)。