室性心律失常的基因治療進展

劉俊鵬 施海峰

室性心律失常(ventricular arrhythmia,VA)的治療一直以來都是心律失常研究領域的難點與熱點，目前主要的治療手段包括抗心律失常藥物、植入型心律轉(zhuǎn)復除顫器和導管消融等[1-2]。然而，這些治療方法均存在一定的局限性，如療效欠佳、存在相關不良反應及風險仍較高等。近年來，隨著以基因治療為代表的生物治療在單基因疾病領域取得成功，以及對VA致病基因及分子機制的認識不斷深入，對于難治性的遺傳性和獲得性VA，基因治療將可能成為一種具有廣闊應用前景的治療選擇。本文就該領域的研究進展進行概述。

1 基因治療概述

基因治療是通過對靶細胞內(nèi)某個基因的修復和(或)替換來增強、補充、校正或抑制該基因的異常表達，使其表達產(chǎn)物，即相應蛋白質(zhì)的數(shù)量增加或減少，蛋白質(zhì)功能增強或減低，從而影響疾病進程，最終達到治療目的[3]。這項全新的概念于1972年由Freedmann和Roblin首次提出。不同于傳統(tǒng)的小分子藥物和抗體藥物在蛋白質(zhì)水平進行調(diào)控，基因治療可在基因水平，即DNA或mRNA的水平發(fā)揮作用，因此對于致病基因明確而傳統(tǒng)藥物在蛋白水平難以發(fā)揮作用的靶點具有獨特優(yōu)勢。由此可見，基因治療的設計是基于一個假設，即在充分表征的生物途徑中改變特定蛋白質(zhì)，從而可能達到治療效果。因此，深入了解疾病的病理生理機制對確定基因治療策略(過度表達基因還是抑制基因表達)至關重要。

另外，為實現(xiàn)基因治療，還需要載體和構(gòu)建體兩個關鍵部分。載體即基因遞送系統(tǒng)，包括病毒載體和非病毒載體。隨著不斷開發(fā)和優(yōu)化，載體系統(tǒng)已獲得了重大突破，以腺相關病毒載體為代表的病毒載體成為主流。構(gòu)建體是治療成分，由啟動子和核酸組成，其中，核酸包括cDNA、siRNA、miRNA或shRNA。近年來，在免疫缺陷、血友病和骨骼肌疾病的單基因疾病的研究中，基因治療取得了重大突破；心臟及腫瘤領域的基因治療已成為新的熱點[3-4]。

2 基因治療應用于遺傳性室性心律失常

遺傳性VA是由基因突變所致，這些基因突變增加了心律失常和心臟性猝死的風險?；蛲蛔兛蓪е码x子通道疾病，如長QT綜合征、兒茶酚胺敏感性多形性室速(catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia,CPVT)、Brugada綜合征，也可導致心臟結(jié)構(gòu)異常，如肥厚型心肌病、擴張型心肌病，或兩種形式共同存在。常規(guī)的治療方案不能從根本上減少心律失常的發(fā)作，但如果從基因水平進行干預，則有望使心律失常得到根治。

CPVT是以高猝死風險為特點的單基因遺傳疾病，已知多種基因突變通過影響肌漿網(wǎng)鈣通道蛋白RyR2的功能，破壞細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)，從而觸發(fā)VA。近些年，基于CPVT的遺傳學機制開展了不少基因治療研究。Denegri等[5-6]率先將CPVT致病基因——心臟鈣螯合蛋白基因(CASQ2)作為治療靶點，開展基因治療研究。他們將野生型CASQ2基因作為構(gòu)建體、腺相關血清型9病毒(adeno-associated virus 9,AAV9)作為載體，注射到成年CASQ2基因敲除小鼠模型體內(nèi)；20周后觀察到鈣螯合蛋白等表達水平正?；?，CASQ2導致的電生理和超微結(jié)構(gòu)異常得以改善，相關心律失常消失，首次證實了基因治療的有效性[5]。隨后，Denegri等[6]又針對成年CASQ2突變小鼠模型進行研究，同樣發(fā)現(xiàn)小鼠的CPVT表型得到減輕。Bongianino等[7]針對RyR2突變基因開展基因治療研究，他們采用RNA干擾技術抑制RyR2突變基因的表達，從而增強了野生型等位基因的表達。從研究結(jié)果看，野生型RyR2 mRNA的比例較突變型增加了1倍；蛋白定量顯示，治療后小鼠心臟中總RyR2水平降低了15%，心肌細胞電學活動及超微結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定[7]。針對RyR2突變基因，還可以實施基因編輯技術。Pan等[8]通過AAV9在RyR2雜合突變小鼠中導入CRISPR/Case9和基因組RNA以糾正RyR2突變；結(jié)果顯示，該治療方法可有效抑制體內(nèi)心肌細胞中引起疾病的等位基因的表達，心律失常的發(fā)生顯著減少。鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一種促腎上腺皮質(zhì)激素激活的激酶，有致心律失常作用，是CPVT的潛在治療靶點。Bezzerides等[9]基于CaMKⅡ抑制肽技術開展了基因治療研究，以AAV9為載體，將CaMKⅡ抑制肽導入RyR2雜合突變小鼠中，發(fā)現(xiàn)心肌細胞心律失常表型受到抑制，心律失常發(fā)生率明顯下降。

3 基因治療應用于瘢痕性室性心律失常

缺血性心肌病或心肌梗死導致的瘢痕性VA，是最常見的惡性心律失常類型。它的發(fā)生機制是局部折返的形成，因此，改善瘢痕邊界區(qū)域心肌的不應期及傳導是此類心律失常治療的關鍵。無論是抗心律失常藥物還是導管消融，均是基于此機制發(fā)揮治療效應的，然而這兩種治療方法均不能從根本上實現(xiàn)精準及持久的治療?；蛑委煆幕蛩竭M行干預，理論上能從根本上改變心肌細胞的致心律失常機制，具有潛在的治療價值。

早期的基因治療專注于改善離子通路。Sasano等[10]在心肌梗死后室速的豬模型中，以腺病毒為載體，將編碼KANH2鉀通道的基因?qū)胄募」Ｋ礼：蹍^(qū)域，發(fā)現(xiàn)動作電位時程、有效不應期均明顯延長，并且VA的發(fā)生率顯著下降。近年來，通過改善細胞偶聯(lián)、細胞興奮性來恢復心臟傳導逐漸成為新的研究熱點。在心肌梗死后室速的豬模型中，Greener等[11]將縫隙連接蛋白43(Cx43)基因通過腺病毒導入心肌梗死的瘢痕邊界區(qū)域，發(fā)現(xiàn)隨著連接蛋白表達的增多，心臟傳導得到恢復，與此同時VA的發(fā)生減少。同樣，在小鼠模型中，使用慢病毒介導的Cx43基因治療方法，也獲得了相似的結(jié)果[12]。另外，采用骨骼肌鈉通道伴或不伴縫隙連接蛋白32(Cx32)表達的基因治療方法，其療效也被一些研究所證實[13-16]。

綜上，以基因治療為代表的生物治療近年來取得了重大突破，但在VA治療領域，該療法仍處在探索階段。新型病毒載體的運用極大地促進了基因治療在心律失常領域的應用。難治性的遺傳性和獲得性VA是基因治療的合適靶點，然而，目前相關研究尚處在臨床前階段，動物模型多限于小鼠，缺乏心臟解剖，或是電生理更接近人類心臟的大型動物或靈長類動物的研究，使得基因治療的有效性及安全性缺乏研究數(shù)據(jù)支持，尤其是難以評估致心律失常風險等?？傊镏委熢诓痪玫膶碛型饾u成為VA治療的可選項，擁有十分廣闊的應用前景。