慢性乙型肝炎病毒感染和原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌

張 珊 紀(jì) 冬 陳國(guó)鳳

中國(guó)現(xiàn)年齡標(biāo)準(zhǔn)化肝癌發(fā)生率為18.3/10萬(wàn)，病死率為17.1/10萬(wàn)，其中男性發(fā)生率為27.6/10萬(wàn)，病死率為25.6/10萬(wàn)，女性發(fā)生率為9.0/10萬(wàn)，病死率為8.6/10萬(wàn)[1]。原發(fā)性肝癌發(fā)生率與病死率均高，其中肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)占比超過(guò)80%，是原發(fā)性肝癌中最常見的類型。HCC發(fā)生相關(guān)的危險(xiǎn)因素很多，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)相關(guān)的肝硬化是其主要誘因。HBV慢性感染與HCC的發(fā)生有著非常密切的聯(lián)系。

一、乙型肝炎病毒

慢性HBV感染一直是我國(guó)高發(fā)生率的傳染病之一，最新數(shù)據(jù)表明，現(xiàn)在我國(guó)一般人群乙型肝炎表面抗原(hepatitis B surface antigen，HBsAg)流行率為5%～6%，慢性HBV感染患者約7000萬(wàn)[2]。即使HBV疫苗已被廣泛應(yīng)用于臨床，其發(fā)生率也一直居高不下。HBV侵襲人體的過(guò)程與病毒的多方面特性有關(guān)。

首先在肝細(xì)胞內(nèi)，HBV中存在的共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalently closed circular DNA，cccDNA)是HBV持續(xù)感染無(wú)法徹底消除的根本原因，只有消滅所有受感染肝細(xì)胞的cccDNA，使HBV無(wú)法繼續(xù)復(fù)制，才能獲得疾病完全治愈[3]。cccDNA雖然無(wú)法自行復(fù)制，但它依靠自身穩(wěn)定性以及體內(nèi)多種途徑對(duì)cccDNA庫(kù)的補(bǔ)充始終維持體內(nèi)含量的相對(duì)平衡，即使接受長(zhǎng)期抗病毒治療，也只能使cccDNA含量降低，而不能完全清除[3,4]。作為反映體內(nèi)病毒情況的重要指標(biāo)，對(duì)cccDNA含量的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)很有必要，但cccDNA的檢測(cè)方法尚有多方面不足，技術(shù)仍需改進(jìn)。在治療方面，臨床上也逐漸開始應(yīng)用通過(guò)多途徑的以cccDNA為靶點(diǎn)的新型療法，如病毒蛋白負(fù)性調(diào)控cccDNA、表觀遺傳學(xué)修飾、在分子層面上進(jìn)行基因組編輯等。乙型肝炎的完全治愈未來(lái)可期[3,5]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎核心相關(guān)抗原(hepatitis B core related antigen，HBcrAg)與cccDNA密切相關(guān)，或許可作為替代cccDNA的指標(biāo)反映體內(nèi)病毒情況。在體內(nèi)多個(gè)生物指標(biāo)如HBV DNA及HBsAg等檢測(cè)不到或無(wú)法檢測(cè)時(shí)，HBcrAg仍處于較為穩(wěn)定且可被監(jiān)測(cè)的水平，因此對(duì)疾病監(jiān)測(cè)、治療效果評(píng)估等起到了良好的作用[6]。另外HBcrAg也被證明是肝癌的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，HBcrAg>10kU/ml的中等HBV DNA載量(2000～19999IU/ml)患者與高HBV DNA載量患者的肝癌危險(xiǎn)比比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[7]。

HBV目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的基因型共10種(A～J)，陸續(xù)還有超過(guò)30余種基因亞型正在不斷被發(fā)現(xiàn)。不同的基因型在地理上和突變體頻率上都存在著差異，跟疾病的發(fā)生、治療和預(yù)后等關(guān)系密切。我國(guó)B型與C型病毒是慢性肝炎、肝硬化及肝癌的主要誘導(dǎo)因素[8]。

HBV與宿主基因組的整合是HBV致癌的主要原因之一。從肝炎到肝癌，HBV整合數(shù)量呈增加態(tài)勢(shì)且與病毒載量呈正相關(guān)，HBV整合靶向基因在許多癌癥相關(guān)通路中數(shù)量龐大[9]。HBV DNA與宿主細(xì)胞DNA的整合往往發(fā)生在腫瘤克隆擴(kuò)增早期，通過(guò)引起肝細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)的改變，降低染色體的穩(wěn)定性，從而引發(fā)一系列細(xì)胞信號(hào)通路及基因組表達(dá)轉(zhuǎn)錄的異常反應(yīng)，增加癌癥的發(fā)生率[9,10]。通過(guò)高通量HBV整合檢測(cè)及RNA測(cè)序，基因組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)4225個(gè)整合位點(diǎn)，多為脆弱的基因組位點(diǎn)以及功能性區(qū)域，如端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因(TERT)、KMT2B和CCNE1等，這些位點(diǎn)均被證明在癌癥發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11]。

除此之外，乙肝病毒X蛋白(hepatitis B virus X protein，HBx)在肝癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移等多個(gè)環(huán)節(jié)中均起重要作用。首先HBx蛋白可調(diào)節(jié)cccDNA的轉(zhuǎn)錄。HBV感染后，染色體結(jié)構(gòu)維持(structural maintenance of chromosomes，Smc)復(fù)合物Smc 5/6與cccDNA結(jié)合并靶向其降解，但是由于HBx對(duì)Smc 5/6復(fù)合物的抑制作用，cccDNA的穩(wěn)定性得以維持[12]。HBx還可通過(guò)激活叉頭框A1(forkhead box A1，F(xiàn)oxA1)因子信號(hào)上調(diào)雄性特異性致死因子2(male-specific lethal 2，MSL2)，上調(diào)的MSL2在肝細(xì)胞中泛素化降解載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(apolioprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide，APOBEC)家族成員APOBEC3B，由此達(dá)到增加cccDNA穩(wěn)定性的目的，促使肝癌發(fā)生[13]。其次HBV DNA與宿主基因組的整合也對(duì)病毒癌蛋白HBx的表達(dá)有著重要影響?；蚪M的整合調(diào)節(jié)癌蛋白HBx的持續(xù)表達(dá)后不僅使細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和增殖控制失調(diào)，還增加肝細(xì)胞對(duì)致癌因子的敏感度[14]。另外還有許多研究發(fā)現(xiàn)，多條HBx影響肝癌發(fā)生的調(diào)節(jié)通路，如HBx激活去乙?；?(sirtuin 2，SIRT2)啟動(dòng)子上調(diào)SIRT2，從而增加HBV復(fù)制及HBV介導(dǎo)的HCC轉(zhuǎn)化[15]。HBx通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB(nuclear transcription factor-κB)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等，髓樣特異性蛋白S100A9在其中起到了關(guān)鍵性作用[16,17]。

二、宿主因素

慢性HBV患者的感染有多種影響因素，如年齡、性別、肝纖維化及肝硬化程度、糖尿病等。糖尿病最近被證明是肝癌發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，糖尿病的存在或較高的血糖水平與罹患肝癌和重大慢性肝病的風(fēng)險(xiǎn)較高有關(guān)[18]。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、白介素21(interleukin-21，IL-21)單核苷酸多態(tài)性等均為影響HBV感染患者肝癌發(fā)生率的重要因素。

蛋白質(zhì)編碼RNA在分子生物學(xué)中一直占據(jù)十分重要的地位，然而近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，除編碼RNA外，非編碼RNA在癌癥發(fā)展過(guò)程中的作用不容忽視[19]。非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)可由長(zhǎng)度分為200～100000nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA以及多種<200nt的短鏈非編碼RNA(small non-coding RNA，sncRNA)。

miRNA是sncRNA中非常重要的一類，miRNA作用的機(jī)制是結(jié)合在翻譯模板mRNA的3′末端使mRNA沉默，無(wú)法參與蛋白質(zhì)翻譯。對(duì)HBV陽(yáng)性和陰性肝癌患者分別進(jìn)行miRNA表達(dá)譜的測(cè)定，共篩選出8個(gè)miRNA參與了與HBV無(wú)關(guān)的HCC，5個(gè)miRNA參與了HBV感染，還有7個(gè)miRNA在HBV相關(guān)HCC中發(fā)生了特異性改變。經(jīng)預(yù)測(cè)，這些與HBV相關(guān)的HCC miRNA可能參與了轉(zhuǎn)錄，RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子，MAPK信號(hào)通路的蛋白質(zhì)磷酸化，黏著斑和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等方面的調(diào)節(jié)并作用于AGO2、TP53、CCND1和其他11個(gè)對(duì)HCC發(fā)生和HBV感染有重大影響的基因[20]。

lncRNA在肝癌發(fā)生過(guò)程中的作用也不容小覷。1例高通量測(cè)序研究分析了20例HCC患者的腫瘤血栓和鄰近的正常肝組織中的lncRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)了107個(gè)與轉(zhuǎn)移相關(guān)的lncRNA失調(diào)[21]。另外在一項(xiàng)肝癌干細(xì)胞(liver cancer stem cells，LCSC)相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用轉(zhuǎn)錄組微陣列比較CD13+CD133+HCC細(xì)胞(定義為L(zhǎng)CSC群體)和CD13-CD133-HCC細(xì)胞中的lncRNA表達(dá)，共鑒定出286個(gè)差異表達(dá)的lncRNA。除此之外還發(fā)現(xiàn)，lncTCF7、lncBRM41和lnc-β-catm42在維持LCSC自我更新中起到了非常重要的作用[22]。lncRNA中的HOTTIP是典型的癌癥相關(guān)lncRNA，通過(guò)深度測(cè)序獲得了HBV-HCC lncRNA圖譜，發(fā)現(xiàn)HOTTIP被顯著上調(diào)，HOTTIP可顯著抑制HBsAg、乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)和HBV復(fù)制的產(chǎn)生[23]。

IL-21單核苷酸多態(tài)性與HBV感染及肝細(xì)胞肝癌密切相關(guān)。利用PCR-LDR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，IL-21基因的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)的不一致性影響著HBV感染及HBV相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌的發(fā)生。分別對(duì)慢性HBV感染患者、肝細(xì)胞肝癌患者及健康對(duì)照組進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)編號(hào)為rs2221903的IL-21基因多態(tài)序列中，AG基因型相比AA與GG基因型，在慢性HBV感染患者中比例較高，AG基因型是患慢性HBV感染的風(fēng)險(xiǎn)因素。與此相反，rs12508721中TT基因型與CT和CC基因型比較，在慢性HBV感染患者和HBV相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌患者中比例較低，TT基因型是患慢性HBV感染及HBV相關(guān)的肝細(xì)胞肝癌的保護(hù)因素[24]。

由于遺傳多樣性，HBV感染宿主方面的影響因素還有很多值得繼續(xù)發(fā)掘。

三、抗病毒治療

現(xiàn)有的有效肝癌治療方法包括根治療法(手術(shù)切除、消融治療、肝移植)、肝動(dòng)脈栓塞+化療(TACE)、放射治療、靶向治療及生物治療等，無(wú)論采用何種方案，抗病毒都是治療乙肝相關(guān)肝癌患者的基礎(chǔ)?？共《局委煵粌H可以降低HCC發(fā)生率，還可以減少肝癌復(fù)發(fā)率。現(xiàn)有的抗病毒療法均以抑制病毒復(fù)制為基本原理，缺少?gòu)氐浊宄齝ccDNA的根治性療法，大多數(shù)HBV感染患者需要終身進(jìn)行抗病毒治療。

替諾福韋與恩替卡韋作為國(guó)際公認(rèn)的抗病毒治療一線藥物在臨床上的應(yīng)用相當(dāng)廣泛，已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明，兩種藥物在HBV治療上具有顯著療效，但其在肝癌發(fā)生率方面是否存在差異目前仍未完全明確。韓國(guó)一項(xiàng)全國(guó)性歷史隊(duì)列研究對(duì)此進(jìn)行了探索，隊(duì)列一的研究對(duì)象為2012年1月1日～2014年12月31日開始使用恩替卡韋(n=11464)或富馬酸替諾福韋二吡呋酯片(n=12692)的慢性乙型肝炎初治患者，數(shù)據(jù)來(lái)自韓國(guó)國(guó)民健康保險(xiǎn)服務(wù)數(shù)據(jù)庫(kù)。隊(duì)列二作為驗(yàn)證，納入了2010年1月1日～2016年12月31日接受恩替卡韋(n=1560)或替諾福韋(n=1141)治療的CHB患者的醫(yī)院隊(duì)列。結(jié)果顯示，在人群隊(duì)列中，替諾福韋組的HCC年發(fā)生率(0.64/100人年)顯著低于恩替卡韋組(1.06/100人年)。通過(guò)多變量校正，結(jié)果顯示，與恩替卡韋組比較，替諾福韋組的HCC風(fēng)險(xiǎn)和全因病死率或移植率未顯著下降。而對(duì)人群和醫(yī)院隊(duì)列分別進(jìn)行傾向性匹配后，替諾福韋組顯示出顯著降低的HCC風(fēng)險(xiǎn)。這表明與恩替卡韋治療比較，替諾福韋治療使HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)在以人群為基礎(chǔ)的成人慢性乙型肝炎患者中顯著降低，該發(fā)現(xiàn)在醫(yī)院隊(duì)列中也得到了驗(yàn)證。鑒于HCC患者的預(yù)后較差，這些發(fā)現(xiàn)可能在預(yù)防CHB感染患者癌癥發(fā)生方面具有重要的臨床意義[25]。這兩種藥物之間的具體差別及臨床應(yīng)用方法目前仍在討論中，還需要有更多的證據(jù)來(lái)證明。

抗病毒治療對(duì)預(yù)防肝癌發(fā)生方面的作用毋庸置疑，但HBV感染患者經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的抗病毒治療后即便符合臨床治愈標(biāo)準(zhǔn)，也并非意味著病毒在體內(nèi)完全清除。與未感染HBV者比較，低水平病毒血癥(low-level viremia，LLV)患者在肝癌發(fā)生方面的風(fēng)險(xiǎn)仍有升高。一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究納入了875例初治HBV單感染患者，給予恩替卡韋單藥治療，患者出現(xiàn)兩類結(jié)局，分別是持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(sustained virological response，SVR)與LLV。該項(xiàng)研究對(duì)患者的HCC發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，無(wú)論患者是否患有肝硬化，LLV均與較高的HCC風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[26]。

有研究對(duì)當(dāng)HBV DNA水平處于不同基線或腫瘤處在不同階段時(shí)，抗病毒治療對(duì)早期切除術(shù)后的HBV相關(guān)肝癌患者的無(wú)病生存期(disease-free survival，DFS)和總體生存期(overall survival，OS)的影響進(jìn)行了討論。結(jié)果顯示，高基線HBV DNA水平是所有患者短DFS和OS相關(guān)的危險(xiǎn)因素。HBVDNA≥2000IU/ml的患者中，抗病毒治療與延長(zhǎng)的DFS和OS顯著相關(guān)。對(duì)于HBV DNA<2000IU/ml或無(wú)法檢測(cè)的患者，抗病毒治療在延長(zhǎng)DFS和OS方面并未顯示出明顯的益處，LLV患者與抗病毒治療之間的關(guān)系并未明確[27]。而2020年一項(xiàng)回顧性隊(duì)列研究對(duì)此做出了回答，研究表明，抗病毒治療可顯著改善LLV患者的OS，但對(duì)患者的DFS并無(wú)明顯影響[28]。兩項(xiàng)研究的結(jié)論說(shuō)明，高水平HBV DNA與早期肝癌患者預(yù)后較差有關(guān)?？共《局委煂?duì)所有患者預(yù)后均有良好影響，應(yīng)作為HBV相關(guān)HCC患者的常規(guī)術(shù)后治療。除此之外，另一項(xiàng)大規(guī)模隊(duì)列研究結(jié)果顯示，無(wú)論基線病毒水平或腫瘤分期，預(yù)防性抗病毒治療均可以顯著改善行介入治療的HBV相關(guān)HCC患者的長(zhǎng)期生存，其療效與介入治療類型無(wú)關(guān)[29]。

雖然肝癌的發(fā)生與預(yù)后與多方面條件都有著不可或缺的關(guān)系，但最重要的因素仍是抗病毒治療的進(jìn)行與否。所以對(duì)HBV患者來(lái)說(shuō)，對(duì)肝癌的早發(fā)現(xiàn)、早診斷以及早治療是獲得良好預(yù)后的最為重要的條件。

四、展 望

慢性HBV感染與肝細(xì)胞肝癌的高患病率與發(fā)生率始終威脅著人們的生命健康。本文從乙肝病毒、宿主以及抗病毒治療3個(gè)方向闡述了相關(guān)因素對(duì)這兩種疾病的影響。乙肝病毒因素方面，cccDNA是乙肝病毒無(wú)法徹底消滅的根本原因，因此研究者正以此為靶點(diǎn)研究有效的抗病毒治療方案，以求徹底消滅HBV。除cccDNA外，影響乙肝病毒的因素還包括核心抗原的存在、癌蛋白的表達(dá)、HBV基因型以及HBV DNA與宿主基因組的整合等。宿主方面microRNA、lncRNA、IL-21單核苷酸多態(tài)性等在近年來(lái)一直備受關(guān)注。抗病毒治療方面，一方面以cccDNA為靶點(diǎn)的研究正在進(jìn)行，另一方面市場(chǎng)上現(xiàn)有的藥物的具體有效性與安全性還未徹底明晰。本文僅對(duì)這3個(gè)方面影響因素做了分析闡述，未來(lái)研究的最新進(jìn)展應(yīng)該持續(xù)關(guān)注。