類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動(dòng)物模型研究進(jìn)展

張新偉，阿熱艾·阿達(dá)力，豆江移，楊可人，周曉濤，周文濤

(1. 新疆醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；3. 新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830011；4. 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011；5. 新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊 830011)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種常見(jiàn)自身自身免疫性疾病，病理特征是滑膜炎、軟骨破壞，晚期導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形，目前仍無(wú)根治方法。RA的病因尚未完全闡明，但有相關(guān)文獻(xiàn)表明，RA的發(fā)病與溫度、濕度、空間、遺傳、環(huán)境、腸道等因素密切相關(guān)[1-2]。RA相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臉?gòu)建多為實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)情況下的發(fā)病，所以越來(lái)越多的學(xué)者嘗試從病證結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)行制備，尤其中醫(yī)的證型上，盡量使科研與臨床現(xiàn)實(shí)情況更接近?，F(xiàn)將當(dāng)前病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究進(jìn)展情況綜述如下。

1 RA病證結(jié)合模型目前的動(dòng)物選擇

RA病證結(jié)合動(dòng)物模型建立在RA模型的基礎(chǔ)上。RA模型目前公認(rèn)最佳的為膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)模型，由Trentham等[3]于1977年提出，該模型在許多方面與人類RA高度相似。佐劑型關(guān)節(jié)炎(AA)模型應(yīng)用也較廣泛，其起病急，有自愈性，可以模擬RA急性發(fā)病與緩解的病程特點(diǎn)[4]。卵清蛋白(OVA)誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎較多應(yīng)用在兔、羊等動(dòng)物，其他RA模型如油誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、鏈球菌誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎、蛋白多糖誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等，局限性較大或應(yīng)用報(bào)道較少[5]。在這些基礎(chǔ)上，學(xué)者嘗試了多種動(dòng)物來(lái)構(gòu)建RA病證結(jié)合動(dòng)物模型。

1.1兔子 在RA動(dòng)物模型構(gòu)建中，兔子因其性格溫順，體格較大，造模后關(guān)節(jié)癥狀更加容易觀察，測(cè)量方便等優(yōu)勢(shì)，是關(guān)節(jié)類疾病造模常選用的動(dòng)物品種。在RA病證結(jié)合模型中，李征等[6]將環(huán)瓜氨酸多肽(CCP)與完全弗氏佐劑(CFA)混合注入家兔后肢，建造RA血瘀痹阻模型。馮振宇等[7]在CIA模型基礎(chǔ)上給予風(fēng)寒濕刺激和葡萄球菌腸毒素B(staphylococcal enterotoxin B，SEB)外涂制備RA風(fēng)寒濕痹動(dòng)物模型。袁博等[8]采用卵蛋白聯(lián)合冰凍低溫建立寒證RA家兔模型。

1.2大鼠 鼠類也是目前動(dòng)物造模中應(yīng)用較多的動(dòng)物品種。其中大鼠的選擇類型多集中在SD大鼠、Wistar大鼠、Lewis大鼠。在CIA造模中，雌性Wistar大鼠的CIA造模成功率高于雄性；Lewis大鼠造模成功率高于Wistar大鼠；Wistar大鼠造模起病急，恢復(fù)快；Lewis大鼠造模起病慢，恢復(fù)慢[9-10]。金祝秋等[11]在病證結(jié)合動(dòng)物模型的造模中選用雌性SD大鼠，將大鼠置于5～7℃的冷水中，持續(xù)20 min，伴風(fēng)力刺激，每天1次，持續(xù)14 d，在造模第1天注射CFA 0.1mL于小鼠右后肢，造模成功率較高。

1.3小鼠 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，小鼠品種可以選擇的有DBA/1小鼠、C57BL/6小鼠、balb/c小鼠等，目前RA病證結(jié)合模型多以大鼠為主，小鼠較少。小鼠在CIA模型、AA模型等選用較多,其中較為經(jīng)典的是DBA/1小鼠CIA模型，造模成功率為90%～100%[12]。C57BL/6小鼠CIA造模成功率在50%左右，且差異較大，如四肢腫脹不一[13]。如要以小鼠建造RA病證結(jié)合模型，可以根據(jù)CIA、AA等模型的不同特點(diǎn)來(lái)選擇造模，并施加外因。

2 RA濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動(dòng)物模型研究進(jìn)展

RA在中醫(yī)屬于“痹病”范疇，中醫(yī)治療思想以整體觀念、辨證論治為主，辨證和辨病相輔相成。RA的模型如CIA模型、AA模型嚴(yán)格來(lái)說(shuō)并不完全代表中醫(yī)痹證的辨證分型，尤其是模型并不是人類疾病的完全復(fù)制。因此很多學(xué)者在RA動(dòng)物造模階段，通過(guò)給予各種外因刺激，模擬混雜因素建造RA病證結(jié)合模型，使模型同時(shí)具有疾病的特點(diǎn)和中醫(yī)學(xué)的證型特點(diǎn)[15]。目前中醫(yī)證型分型仍未完全統(tǒng)一，其中較為認(rèn)可的是風(fēng)寒濕痹型、風(fēng)濕熱痹型、虛證型、痰瘀痹阻型、血瘀痹阻型等。

2.1風(fēng)寒濕痹病證結(jié)合動(dòng)物模型 呂愛(ài)平等[15]將Wistar大鼠置于15 ℃冷水中游泳7 min，1次/d，持續(xù)7 d，然后取1.5 mg/mL的Ⅱ型膠原0.125 mL于小鼠尾部、踝部注射。結(jié)果顯示前期滑膜充血水腫，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；后期出現(xiàn)軟骨損傷。該實(shí)驗(yàn)未設(shè)立單純CIA大鼠組，未說(shuō)明寒濕刺激單獨(dú)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果為膠原誘導(dǎo)和寒濕刺激的綜合結(jié)果。肖長(zhǎng)虹等[16]改進(jìn)了造模方法，自制風(fēng)寒濕造模箱。實(shí)驗(yàn)設(shè)置單純CIA組、風(fēng)寒濕CIA組、CIA+SEB組、風(fēng)寒濕CIA+SEB組。造模方法為每只Wistar大鼠注射Ⅱ型膠原500 μg，7 d后加強(qiáng)注射200 μg，造模組風(fēng)速18 m/s，相對(duì)濕度100%，溫度7～10 ℃，1次/h，共刺激9 d。該實(shí)驗(yàn)補(bǔ)充了呂愛(ài)平等[5]的實(shí)驗(yàn)不足，建立了單純對(duì)照組。結(jié)果顯示單純風(fēng)寒濕刺激降低了關(guān)節(jié)炎癥程度，如附加SEB則能提高炎癥程度和炎癥因子水平。但陳歡等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相反，結(jié)果顯示寒濕刺激使炎細(xì)胞浸潤(rùn)增多，病理?yè)p傷加重，大鼠的足踝腫脹更嚴(yán)重。蘇杉等[18]實(shí)驗(yàn)也說(shuō)明風(fēng)寒濕加重了炎癥反應(yīng)，同時(shí)大鼠血清類風(fēng)濕因子(RF)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3)水平及MMP-3 mRNA表達(dá)量均更高。袁博等[8]采取冰袋給兔關(guān)節(jié)降溫至-20～-25 ℃模擬寒刺激，1.5 h后在45 ℃溫水中復(fù)溫5 min，并給予卵蛋白免疫，結(jié)果家兔出現(xiàn)萎靡不振，膝關(guān)節(jié)腫脹，局部青紫，皮溫低，成功建成寒證模型。這種寒刺激只需給予1次。目前低溫冰凍法應(yīng)用的較少，可以聯(lián)合風(fēng)和濕的刺激來(lái)進(jìn)行更多嘗試。

2.2風(fēng)濕熱痹病證結(jié)合動(dòng)物模型 申洪波[19]選SD大鼠，使用人工合成CCP多肽抗原與CFA混合注射大鼠足底，濕熱刺激為濕度95%～100%，溫度30～33 ℃，1次/d，共1 h，持續(xù)9 d。結(jié)果顯示濕熱CIA組RF、CCP抗體水平均顯著上升，抗核周圍因子(APF)、抗角蛋白抗體(AKA)陽(yáng)性程度最高。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明環(huán)境因素能使病情進(jìn)展更嚴(yán)重。鎮(zhèn)蘭芳[20]選雌性Wistar大鼠，造模刺激為濕度(90±4)%，溫度(33±2)℃，風(fēng)力3級(jí)，4 h/d，持續(xù)30 d。結(jié)果顯示造模組血沉(ESR)、白細(xì)胞介素(IL-17)、CD44、Fas、FasL、芳香烴受體(AHR)表達(dá)均增強(qiáng)，風(fēng)寒濕對(duì)這些指標(biāo)表達(dá)的影響比風(fēng)濕熱更嚴(yán)重。王蓉等[21-22]用SD大鼠造模，造模刺激為風(fēng)速5 m/s，濕度≥95%，37 ℃蒸汽熏蒸，1次/d，共30 min，持續(xù)11 d，第12天進(jìn)行Ⅱ型膠原免疫刺激。結(jié)果顯示風(fēng)濕熱組MMP-1蛋白、MMP-1 mRNA、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)量較單純CIA組更高；基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP-1)、TIMP-1 mRNA表達(dá)量較單純CIA組更低。

2.3脾虛痹病證結(jié)合動(dòng)物模型 徐世杰等[23]選DBA小鼠，脾虛CIA組造模方法為大黃煎液每天25 mL/kg灌胃，第2周給予饑飽失常的刺激+Ⅱ型膠原。結(jié)果脾虛CIA組血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、IL-6水平上升明顯，與單純CIA組差別明顯；干擾素-γ(IFN-γ)也上升，與單純CIA組差別不大；IL-10下降，較單純CIA組下降更明顯。杜中平等[24]用利血平的不良反應(yīng)來(lái)模擬脾虛，脾虛CIA組造模方法為大鼠腹腔注射利血平0.5 mL/(kg·d)，14 d后給予牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA。結(jié)果脾虛CIA組大鼠精神萎靡，毛色無(wú)光，懶動(dòng)，關(guān)節(jié)腫脹和病理?yè)p傷較單純CIA組重；血清TNF-α、INF-γ、IL-10水平顯著上升，IL-10水平較單純CIA組更高，其余因子比較無(wú)明顯差異。該實(shí)驗(yàn)IL-10水平升高和徐世杰等[23]實(shí)驗(yàn)結(jié)果不符。目前脾虛痹病證結(jié)合動(dòng)物模型研究較少，方法有大量苦寒藥物建立氣虛模型[25]，利用利血平的不良反應(yīng)導(dǎo)致胃腸功能紊亂，膽堿能神經(jīng)興奮模擬脾虛[26]。從膽堿能神經(jīng)、副交感神經(jīng)興奮這個(gè)角度可以使用更多藥物來(lái)進(jìn)行嘗試。

2.4腎虛痹病證結(jié)合動(dòng)物模型 艾景錄等[27]選DBA小鼠，造模方法：雌性小鼠行卵巢切除術(shù)+Ⅱ型膠原注射，給雄性小鼠乙烯雌酚灌胃+Ⅱ型膠原注射。病理顯示卵巢切除組關(guān)節(jié)破壞更嚴(yán)重，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)更多，去卵巢加重了CIA動(dòng)物模型的病情；給予雌激素的雄鼠病情減輕。王燕等[28]用羥基脲375 mg/(kg·d)給SD大鼠灌胃，17 d后Ⅱ型膠原誘導(dǎo)，羥基脲CIA組關(guān)節(jié)損傷、腫脹較去卵巢CIA組更重。壽旗楊等[29]切除雄性Wistar大鼠腎上腺模擬腎陽(yáng)虛，輔以佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎，結(jié)果提示腎陽(yáng)虛促進(jìn)RA的發(fā)展。陶黎等[30]采用切除SD雌鼠卵巢+Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA炎，結(jié)果顯示去勢(shì)增加RA中炎癥因子表達(dá)，使關(guān)節(jié)破骨細(xì)胞數(shù)增多。

2.5痰瘀痹阻病證結(jié)合動(dòng)物模型 許多RA患者存在血脂代謝紊亂，有研究表明在RA發(fā)病許多年前,總膽固醇、三酰甘油就有升高[31]。唐先平[32]用高脂飼料喂養(yǎng)Wistar大鼠，豬油灌胃。高脂飼料組AA大鼠出現(xiàn)食欲下降、大便稀、活動(dòng)減少等癥狀，同時(shí)有RA的特點(diǎn)，如足踝腫脹、TNF-α等因子水平升高，即造模成功。陳哲等[33]選Wistar雌性大鼠，給予牛Ⅱ型膠原誘導(dǎo)炎癥，飼養(yǎng)期間給予高脂飼料。結(jié)果顯示高脂飼料組CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹程度及血清TNF-α、IL-1β、IL-17、TC、LDL-C水平明顯上升，HDL-C水平明顯下降，提示高血脂癥，但與高脂飼料對(duì)比組差別不大。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明高血脂癥可加重RA的病情。

2.6血瘀痹阻病證結(jié)合動(dòng)物模型 李征等[6]將CCP抗原和佐劑混合，注射于兔子雙側(cè)腘窩淋巴結(jié)內(nèi)，2周后加強(qiáng)免疫。結(jié)果顯示CCP佐劑組自身抗體水平更高，與佐劑組差異明顯；凝血時(shí)間縮短，纖維蛋白肽A(FPA)和D-二聚體水平升高，與CCP組差異明顯，提示體內(nèi)可能存在高凝狀態(tài)。CPP多肽和佐劑分別都能引起類似RA的反應(yīng)，合用可能會(huì)加重病情。章平衡等[34]研究表明RA患者體內(nèi)高凝狀態(tài)與炎癥因子、活動(dòng)性指標(biāo)密切相關(guān)，該結(jié)論與李征等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符合。李茜等[35]選SD大鼠，用Ⅱ型膠原誘導(dǎo)RA，誘導(dǎo)血瘀證的刺激為注射鹽酸腎上腺素+冷水游泳。結(jié)果顯示血瘀證CIA大鼠RF、血栓素A2(TXA2)、超敏C-反應(yīng)蛋白(hs-CRP)及血液黏度增高，提示炎癥發(fā)生和體內(nèi)可能存在高凝狀態(tài)。該實(shí)驗(yàn)未說(shuō)明腎上腺素刺激和冷水刺激對(duì)單純CIA大鼠的影響。

3 不足和展望

目前病證結(jié)合動(dòng)物模型廣泛在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用，模型為中醫(yī)藥及其他藥物的應(yīng)用提供了許多思路，但仍有較大不足，主要有以下幾方面。

3.1不能很好地模擬臨床疾病的發(fā)病狀態(tài) 目前公認(rèn)的CIA模型雖然有許多與RA類似的因子和病理變化，但和臨床RA疾病過(guò)程不完全相同，加上目前病證結(jié)合動(dòng)物模型造模思路較為單一，僅僅將現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的“病”和中醫(yī)的“證”進(jìn)行“1+1”，即在RA模型基礎(chǔ)上施加外因。某種角度上說(shuō)，在中醫(yī)里如風(fēng)寒濕等因素為RA的病因，但是在病證結(jié)合動(dòng)物模型中RA的發(fā)病基本是由各種膠原和抗原來(lái)誘導(dǎo)，單獨(dú)給予風(fēng)寒濕等因素并不能導(dǎo)致RA發(fā)病，所以目前病證結(jié)合動(dòng)物模型不能很好地模擬臨床發(fā)病。

3.2造模標(biāo)準(zhǔn)和模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一 目前可用于實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物模型較多，有不同品種小鼠、大鼠、兔子，刺激因素溫度、風(fēng)速、濕度不統(tǒng)一，測(cè)定的血清因子也不統(tǒng)一。如在不同的實(shí)驗(yàn)中選取了同一因子，但溫度等條件不統(tǒng)一，不能很好地進(jìn)行比較。同時(shí)各個(gè)實(shí)驗(yàn)選取測(cè)定的因子較少，很難發(fā)現(xiàn)不同類型病證結(jié)合動(dòng)物模型的因子變化。當(dāng)多種因素同時(shí)施加時(shí)，難以發(fā)現(xiàn)其中單個(gè)因素對(duì)RA模型造成的影響，如申洪波[19]采取刺激條件為濕熱，鎮(zhèn)蘭芳[20]則為風(fēng)濕熱，結(jié)果提示兩種刺激都加重了大鼠的病情。

綜上，病證結(jié)合動(dòng)物模型目前取得一定進(jìn)展，但仍有較大發(fā)展空間，如血清測(cè)定細(xì)胞因子較少，難以進(jìn)行比較時(shí)，使用基因芯片、蛋白質(zhì)芯片技術(shù)[36]可以測(cè)定多種因子，在不同證型中進(jìn)行比較。同時(shí)運(yùn)用Meta分析可以一定程度解決造模條件不一致導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)難以相互比較的問(wèn)題。有Meta分析指出，在RA冷熱證型中，人體內(nèi)的細(xì)胞因子表達(dá)不同，信號(hào)傳導(dǎo)通路可能不同[37]，這提示對(duì)不同類型的RA患者的特定靶點(diǎn)使用藥物，可能會(huì)有更好的效果。從這個(gè)角度，研究者可以去尋找更多病證結(jié)合動(dòng)物模型中不同的靶點(diǎn)。因此，病證結(jié)合動(dòng)物模型需要進(jìn)一步嘗試和探索，爭(zhēng)取能更貼近臨床，服務(wù)于臨床。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。