NLRP3及其抑制藥物在腎缺血/再灌注損傷中的研究進(jìn)展

陳 濤，蔡 飛，江波濤

(1.湖北科技學(xué)院藥學(xué)院；2.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部;3.湖北科技學(xué)院糖尿病 心腦血管病變湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4.咸寧市中心醫(yī)院/湖北科技學(xué)院附屬第一醫(yī)院泌尿外科，湖北 咸寧 437100)

腎缺血/再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury，RIRI)易發(fā)生于機(jī)體休克、腎臟移植、心肺復(fù)蘇等疾病，以腎功能下降為主，輕者可引起急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，嚴(yán)重患者會(huì)進(jìn)展為急性腎衰竭，目前尚無(wú)有效的預(yù)防措施和治療策略。RIRI的發(fā)病機(jī)制有：腎素-血管緊張素系統(tǒng)的激活、細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載、細(xì)胞的凋亡與自噬、機(jī)體氧化應(yīng)激、微循環(huán)功能障礙和炎癥反應(yīng)等。其中，炎癥反應(yīng)是RIRI中研究較多的病理機(jī)制之一。

Nod樣受體蛋白3((Nod-1ike receptor protein 3，NLRP3)與多種腎臟性疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)，包括糖尿病腎病、晶體相關(guān)性腎病、慢性腎病、AKI等。研究顯示[1-3]，NLRP3炎癥小體在RIRI的疾病進(jìn)展中同樣扮演著重要角色。

1 NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)及活化

NLRP3(又稱NALP3、冷凍蛋白、CIAS1、PYPAF1和CLR11)位于染色體1q44上，屬于NLR蛋白家族中NLRP(nod-like receptor protein)亞家族成員之一，它是一種大分子蛋白復(fù)合體，其組成成分包括NLRP3、凋亡相關(guān)微粒蛋白(apoptosisassociated speck-like protein，ASC)和天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1，caspase-1)蛋白。當(dāng)NLRP3激活后，其N-末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域(Pyrin domain，PYD)識(shí)別并結(jié)合ASC的PYD，募集ASC和caspase-1的前體，從而形成NLRP3炎癥小體。

NLRP3炎癥小體的激活包括線粒體反應(yīng)性氧化物[4]、胞內(nèi)鉀離子外流[5]、自噬功能障礙[6]、溶酶體裂解[7]等。主要有兩種信號(hào)參與NLRP3炎癥小體的激活，一是NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)上調(diào)NLRP3炎癥小體形成基因的表達(dá)，并產(chǎn)生IL-18和IL-1β等前體[8]；二是通過(guò)NLRP3炎癥小體激活后，募集相應(yīng)的炎癥因子，生成活化的caspase-1，從而使IL-18、IL-1β等的前體剪切成熟[9-10]。最終NLRP3炎癥小體通過(guò)識(shí)別并結(jié)合內(nèi)源性(如尿酸鹽結(jié)晶、細(xì)胞外三磷酸腺苷、膽固醇晶體、脂肪酸等)或外源性(如生物納米材料、淀粉樣沉淀、石棉等)損傷相關(guān)分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)[11]而完成自身的組裝活化，介導(dǎo)無(wú)菌炎癥。

2 NLRP3與腎缺血/再灌注損傷(RIRI)

2.1 NLRP3參與RIRI的機(jī)制在腎缺血/再灌注(renal ischemic reperfusion，RIR)過(guò)程中，隨著腎小管上皮細(xì)胞的損傷和壞死，會(huì)產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性的DAMPs，如高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、ATP、線粒體活性氧(eROS)和熱休克蛋白等，從而激活NLRP3，導(dǎo)致腎小管壞死。

以往研究認(rèn)為,NLRP3主要由免疫細(xì)胞表達(dá)，但在RIRI中卻有兩種細(xì)胞參與NLRP3的表達(dá)，分別是免疫細(xì)胞和腎細(xì)胞。Bakker等[3]的研究顯示，免疫細(xì)胞表達(dá)的NLRP3可導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞凋亡、壞死，且腎小管上皮細(xì)胞的病變程度與免疫細(xì)胞表達(dá)的NLRP3數(shù)量正相關(guān)；而腎細(xì)胞表達(dá)的NLRP3則影響腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)，這種影響主要表現(xiàn)為阻礙腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)?？梢?jiàn)無(wú)論是在減少腎小管上皮細(xì)胞損傷還是促進(jìn)修復(fù)的過(guò)程中，NLRP3始終扮演著消極的角色。

盡管已經(jīng)明確參與RIRI疾病進(jìn)展的NLRP3有免疫細(xì)胞源性和腎細(xì)胞源性，但具體發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，目前認(rèn)為主要是通過(guò)炎癥小體依賴途徑和非炎癥小體依賴途徑進(jìn)行的。

Iyer等[1]通過(guò)研究野生型(WT)小鼠、NLRP3-/-小鼠和ASC-/-小鼠在發(fā)生RIRI后腎小管的壞死程度，發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯差異。存在顯著差異的是腎間質(zhì)中中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況和腎功能，其中腎間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)最明顯、腎損傷嚴(yán)重的是WT小鼠，而NLRP3-/-小鼠、ASC-/-小鼠相較WT小鼠均有所改善，但ASC-/-小鼠是在再灌注后的5 d觀察到改善，而NLRP3-/-小鼠在再灌注后的24h就觀察到這種差異。在致死性RIR后，NLRP3-/-小鼠與ASC-/-小鼠的存活率均有所提高，其中NLRP3-/-小鼠更明顯。這些差異顯示NLRP3在RIRI中很可能存在炎癥小體依賴和非炎癥小體依賴途徑。

隨后，Shigeoka等[2]也證實(shí)了NLRP3可以通過(guò)非炎癥小體依賴途徑發(fā)揮作用。通過(guò)比較WT小鼠和NLRP3-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)在RIRI后，WT小鼠的腎小管壞死程度更重、腎功能損傷更明顯；且在NLRP3-/-小鼠中，檢測(cè)到IL-1β和IL-18明顯偏低。隨后對(duì)IL-1β-/-小鼠、IL-18-/-小鼠、ASC-/-小鼠及caspase-1-/-小鼠RIRI后的腎功能情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)無(wú)明顯改善。IL-1β-/-小鼠和IL-18-/-小鼠的腎功能結(jié)果說(shuō)明，NLRP3缺陷相關(guān)的腎臟保護(hù)作用獨(dú)立于炎癥小體介導(dǎo)的IL-1β和IL-18的釋放。

2.2 NLRP3在RIRI中的激活途徑

2.2.1P2X4和P2X7誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活 Iyer等[1]發(fā)現(xiàn)RIRI后，隨著腎小管細(xì)胞壞死，線粒體釋放的ATP增多，大量的ATP可通過(guò)刺激P2X7受體來(lái)誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體激活。Qian等[12]通過(guò)與WT小鼠對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，P2X7R(-/-)小鼠在RIRI后腎功能得到改善，且炎癥因子產(chǎn)生減少，NLRP3被抑制；在缺氧/復(fù)氧(H/R)的誘導(dǎo)下，發(fā)現(xiàn)急性腎損傷患者的近端腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)的ATP釋放增多，而缺血所致的AKI，在消耗HK-2外ATP和使用P2X7受體拮抗劑后均可改善，且同時(shí)檢測(cè)到NLRP3炎癥小體被抑制。

有研究報(bào)道P2X4和P2X7[13]在氨基酸序列、生理學(xué)通道、染色體位置和組織分布等方面極其相似，存在異構(gòu)共表達(dá)，因此Han等[14]推測(cè)NLRP3炎癥小體也可被P2X4受體誘導(dǎo)激活。通過(guò)比較P2X4WT小鼠和P2X4KO小鼠，發(fā)現(xiàn)P2X4KO小鼠對(duì)RIRI所致的AKI保護(hù)作用明顯，可使腎小管壞死程度減輕，炎癥反應(yīng)和NLRP3炎癥小體信號(hào)顯著減弱；而在使用了P2X4激動(dòng)劑TPγS后，P2X4WT小鼠的近端腎小管細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的信號(hào)明顯增強(qiáng)。因此，NLRP3炎癥小體可被P2X4受體和P2X7受體誘導(dǎo)激活，但是否都通過(guò)ATP-P2X4/P2X7-NLRP3途徑，有待進(jìn)一步研究。

2.2.2通過(guò)ROS-TXNIP-NLRP3途徑激活NLRP3炎癥小體 Xiao等[15]發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠RIRI后NLRP3炎癥小體的激活是由硫氧還原蛋白-相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)介導(dǎo)并依賴于活性氧(ROS)。

Wen等[16]的研究驗(yàn)證了該結(jié)論，在缺血/再灌注損傷(SIRI)誘導(dǎo)的HK-2中，發(fā)現(xiàn)TXNIP的表達(dá)、TXNIP和線粒體的共定位均增強(qiáng)。而使用線粒體靶向抗氧化劑MitoTempo處理HK-2后，發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位(MMP)的下降，mROS的產(chǎn)生減少，與此同時(shí)NLRP3炎癥小體和TXNIP的激活和共定位均被抑制，而NLRP3炎癥小體在TXNIP siRNA轉(zhuǎn)染的HK-2中是明顯被抑制的。這些結(jié)果提示，ROS-TXNIP-NLRP3途徑可激活NLRP3炎癥小體。

2.2.3CTSB和CTSL可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活 Tang等[17]發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B(CTSB)和組織蛋白酶L(CTSL)可促進(jìn)體內(nèi)NLRP3炎癥小體的激活，從而加劇RIRI。研究發(fā)現(xiàn)在H/R誘導(dǎo)的HK-2的上清液中，CTSB和CTSL的缺失可使caspase-1和IL-1β的表達(dá)明顯抑制；將CTSB及CTSL siRNA在體外轉(zhuǎn)染入H/R誘導(dǎo)的HK-2中，發(fā)現(xiàn)由于siRNA轉(zhuǎn)染降低了mRNA水平和CTS的活性，IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1等蛋白的表達(dá)也相應(yīng)下調(diào)，因此推測(cè)CTSB和CTSL能夠誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的激活。在使用CTSB特異性抑制劑Ca074Me對(duì)小鼠進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)血清肌酐和腎臟組織病理學(xué)變化顯著減弱，證實(shí)了CTSB可有效減輕RIRI。由于Ca074Me對(duì)酶的抑制與劑量相關(guān)，在高劑量下可抑制多種組織蛋白酶[18-19]，因此實(shí)驗(yàn)還選用1 μmol·L-1Ca074Me(CTSB抑制劑)和15 μmol·L-1Ca074Me(CTSB與CTSL抑制劑)對(duì)H/R誘導(dǎo)的HK-2進(jìn)行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)CTSB和CTSL的活性顯著降低，腎臟NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的表達(dá)也減弱。該研究表明，CTSB和CTSL可促進(jìn)NLRP3炎癥小體的激活，阻斷CTSB和CTSL可減輕RIRI。

2.2.4通過(guò)激活Nrf2來(lái)抑制NLRP3炎癥小體的激活 Liu等[20]已證實(shí)，激活Nrf2可抑制TXNIP-TRX1復(fù)合物的解離，從而阻止TXNIP激活NLRP3蛋白。Pang等[21]研究也發(fā)現(xiàn),激活Nrf2/NLRP3信號(hào)通路可抑制caspase-1/焦亡相關(guān)蛋白gasdermin D(GSDMD)介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡，從而減輕RIRI。

2.3 RIRI中抑制NLRP3激活的藥物

2.3.1羥氯喹 Tang等[17]在RIR手術(shù)前1周，使用羥氯喹(10 mg·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃雄性小鼠，發(fā)現(xiàn)羥氯喹可通過(guò)下調(diào)RIR小鼠的NF-κB信號(hào)從而抑制NLRP3炎癥小體的激活。

2.3.2右美托咪定 Kim等[22]分別在腎缺血前1 h和再灌注后給予雄性糖尿病大鼠右美托咪定(10 μg·kg-1)，發(fā)現(xiàn)由RIRI所致的NLRP3、caspase-1、IL-1β、phospho-AKT和phospho-ERK等上調(diào)信號(hào)，均被減弱；但再灌注后使用右美托咪定在調(diào)節(jié)NLRP3、phospho-AKT和phospho-ERK等信號(hào)傳導(dǎo)以及氧化應(yīng)激方面明顯優(yōu)于缺血前給藥。

2.3.3多酚酸鹽B Pang等[21]在RIR手術(shù)前1周，分別給予雄性小鼠高(200 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和低(50 mg·kg-1·d-1)劑量的多酚酸鹽B，發(fā)現(xiàn)3組藥物均可減輕RIRI所致的AKI，其中高劑量組效果最顯著。機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)多酚酸鹽B可直接激活Nrf2的核表達(dá)，抑制RIR時(shí)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)、NLRP3炎癥小體的激活、促炎因子釋放以及細(xì)胞焦亡。

2.3.4促紅細(xì)胞生成素 Kwak等[23]在雄性小鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈閉塞前30 min和再灌注前5 min分別給予促紅細(xì)胞生成素(500 IU·kg-1)1次，發(fā)現(xiàn)給予促紅細(xì)胞生成素的RIR小鼠的細(xì)胞凋亡減少，氧化應(yīng)激反應(yīng)降低，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)減少，ICAM-1和MCP-1的表達(dá)被抑制。研究證實(shí)，促紅細(xì)胞生成素可通過(guò)激活COX-2和NF-κB信號(hào)通路來(lái)下調(diào)NLRP3、caspase-1和NLRP1等的表達(dá)。

2.3.5紫花前胡苷 Liao等[24]在RIR手術(shù)前用紫花前胡苷(20 mg·kg-1·d-1)連續(xù)灌胃雄性小鼠3 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)紫花前胡苷預(yù)處理組的肌酐和尿素氮較RIR組明顯下降，腎小管損傷程度顯著減輕。經(jīng)H/R誘導(dǎo)的HK-2在使用紫花前胡苷處理后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(dá)明顯抑制，并且紫花前胡苷還能抑制ROS及NLPR3炎癥小體的激活。

2.4 RIRI中抑制NLRP3激活的化合物

2.4.1白藜蘆醇 Xiao等[15]在給雄性糖尿病大鼠連續(xù)灌胃白藜蘆醇(10 mg·kg-1·d-1)7 d后行RIR手術(shù)，發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能抑制糖尿病大鼠RIRI后TXNIP與NLRP3的結(jié)合，以及caspase-1、IL-1和IL-18的表達(dá)。

2.4.2表氧化二十碳三烯酸 朱曄等[25]在RIR手術(shù)前1 h，分別給雄性小鼠注射表氧化二十碳三烯酸(2 mg·kg-1)、TLR4抑制劑TAK242(3 mg·kg-1)各1次，發(fā)現(xiàn)表氧化二十碳三烯酸能夠減輕小鼠RIR所致的腎功能損傷和炎癥反應(yīng)。該保護(hù)作用可能與抑制TLR4通路有關(guān)，該通路可抑制NLRP3活化并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡。

2.4.3A68930 Cao等[26]在RIR后，給雄性小鼠注射3次A68930(5 mg·kg-1)，發(fā)現(xiàn)A68930能激活D-1多巴胺受體，抑制NLRP3炎癥小體的激活，減輕腎臟和系統(tǒng)炎癥，改善RIR所致的腎功能異常。

2.4.4白頭翁皂苷B4 李俊等[27]使用低(1.25 mg·kg-1·d-1)、中(2.5 mg·kg-1·d-1)、高(5 mg·kg-1·d-1)劑量的白頭翁皂苷B4對(duì)RIR后的雄性大鼠，連續(xù)治療5 d，發(fā)現(xiàn)大鼠RIRI減輕，其中高劑量組最明顯。其研究表明，抑制炎癥是RIRI治療的關(guān)鍵，可通過(guò)抑制NLRP3信號(hào)通路及TLR4/NF-κB信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.4.5四甲基吡嗪 Sun等[28]于RIR后立即給雄性大鼠腹腔注射鹽酸四甲基吡嗪(40 mg·kg-1，間隔6 h)，發(fā)現(xiàn)與RIR組比，鹽酸四甲基吡嗪組血清肌酐、血尿素氮、TNF-α、IL-6等水平均較低，腎組織NLRP3表達(dá)下調(diào)。經(jīng)H/R誘導(dǎo)的HK-2在使用鹽酸四甲基吡嗪后，HIF-1α和NLRP3的表達(dá)均被下調(diào)。

2.4.6Mcc950 Zou等[29]在腎移植后使用MCC950(50 mg·kg-1，每周2次)對(duì)雄性大鼠進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)MCC950可通過(guò)NLRP3-IL-1β趨化因子軸對(duì)腎移植產(chǎn)生保護(hù)作用。武康[30]在腎缺血前15 min，通過(guò)鼠尾靜脈給雄性小鼠注射MCC950(3 mg·kg-1)，發(fā)現(xiàn)與RIR組相比，接受MCC950治療的小鼠，腎功能顯著改善，腎組織損傷程度減輕，NLRP3、IL-1β和caspase-1的表達(dá)被抑制。

3 NLRP3在RIRI研究中的總結(jié)與展望

綜上，NLRP3可作用于RIRI的多個(gè)環(huán)節(jié)，包括炎癥反應(yīng)、腎小管上皮細(xì)胞的凋亡和修復(fù)等。研究NLRP3參與RIRI的發(fā)病機(jī)制及激活途徑，有助于闡明RIRI的病理過(guò)程，并針對(duì)性的進(jìn)行干預(yù)，是RIRI預(yù)防和治療的關(guān)鍵。目前雖有部分研究，但以炎癥小體依賴途徑為主，非炎癥小體依賴途徑的研究甚少。而這兩種途徑又均可加劇RIRI ，因此后期需對(duì)非炎癥小體依賴途徑進(jìn)行更深入的研究。近些年RIRI的發(fā)病機(jī)制還聚焦于自噬、細(xì)胞凋亡和壞死等，這些也為RIRI的預(yù)防和治療提供了新思路。

多種藥物或化合物通過(guò)抑制NLRP3的激活來(lái)減輕RIRI方面，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道以動(dòng)物研究為主，尚無(wú)臨床使用研究。但動(dòng)物模型與人RIRI在發(fā)病機(jī)制、臨床表現(xiàn)等都相似，通過(guò)動(dòng)物模型可有助于篩選出較理想的藥物或化合物，對(duì)尋找安全有效的RIRI治療方案十分重要；且目前的動(dòng)物模型治療效果均較顯著，后期以進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)結(jié)果做支撐，NLRP3非常有望成為治療RIRI的新靶點(diǎn)。