變應(yīng)原體外檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

周小倩，井剛，王睿怡，張文遠(yuǎn)，王文靜，唐小牛，孫恩濤

1．皖南醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002； 2．皖南醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)寄生蟲學(xué)教研室

變應(yīng)原是指能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IgE(specific IgE,sIgE)抗體進(jìn)而引起過敏反應(yīng)的抗原性物質(zhì)[1]。變應(yīng)原引起的過敏性疾病是目前全球公認(rèn)的健康問題，近年來，過敏性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)[2]。過敏性疾病廣泛影響人們的生活，嚴(yán)重時(shí)可危及生命[3]。根據(jù)變應(yīng)原引起機(jī)體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的途徑不同，可以分為食入性變應(yīng)原和吸入性變應(yīng)原等[4-6]。因此，明確變應(yīng)原對(duì)于過敏性疾病的預(yù)防和診療具有重要意義。由于變應(yīng)原體內(nèi)檢測(cè)存在安全風(fēng)險(xiǎn)等問題，變應(yīng)原的體外檢測(cè)逐漸成為近年來的研究熱點(diǎn)。本文主要對(duì)變應(yīng)原的體外檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 血清sIgE檢測(cè)

目前，血清sIgE的檢測(cè)已經(jīng)被認(rèn)為是最有效的體外變應(yīng)原檢測(cè)方法[7]。該檢測(cè)方法能夠避免體內(nèi)試驗(yàn)可能出現(xiàn)的嚴(yán)重過敏反應(yīng)，對(duì)患者絕對(duì)安全。檢測(cè)方法主要包括放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、熒光酶免疫分析、納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法、免疫印跡法、液相芯片法等。

1．1放射變應(yīng)原吸附試驗(yàn)(radioallergosorbent test，RAST) 1967年Wide等[8]首次建立了RAST，用于檢測(cè)血清中sIgE。RAST基本原理是血清中sIgE抗體可以與固相載體上包被的變應(yīng)原發(fā)生特異性結(jié)合，sIgE與放射性核素標(biāo)記的抗IgE抗體反應(yīng)，sIgE的含量與放射強(qiáng)度成正比關(guān)系，根據(jù)放射強(qiáng)度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出sIgE抗體含量。該檢測(cè)方法具有較高的靈敏度與特異度[9]，但由于核素具有放射性，容易造成環(huán)境污染，且檢測(cè)成本高、周期長(zhǎng)，同時(shí)還不適用于藥物、細(xì)菌、真菌等變應(yīng)原的檢測(cè)，因此，相比于其他的體外檢測(cè)方法，該方法的使用逐漸減少。

1．2酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 自從Engvall和Perlman在20世紀(jì)70年代首次報(bào)道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)以來，由于ELISA具有快速、敏感、簡(jiǎn)便、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用，并且隨著方法的不斷改進(jìn)、材料的不斷更新，尤其是基因工程技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)的推動(dòng)，使得制備包被抗原，針對(duì)某一抗原表位的單克隆抗體進(jìn)行阻斷等過程的特異性都大大提高。使用間接ELISA法檢測(cè)血清sIgE[10]，其原理是將變應(yīng)原包被在固相載體上，血清中的sIgE抗體可與相應(yīng)的變應(yīng)原發(fā)生特異性結(jié)合，sIgE再與酶標(biāo)記的抗IgE抗體反應(yīng)，最后加入酶的顯色底物就可使反應(yīng)體系顯色，而顏色的深淺與sIgE的含量成正比，依據(jù)反應(yīng)體系吸光度的變化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)sIgE的含量。與RAST相比，ELISA對(duì)環(huán)境無污染，在一定的條件下，酶的活性較穩(wěn)定，價(jià)格更便宜，結(jié)果重復(fù)性高[11]，具有較高的靈敏度[12]，檢測(cè)范圍廣[13]。但是，完成一種變應(yīng)原sIgE的檢測(cè)需要50 μL血清[14]，因血清用量大，嬰幼兒患者不太適用。

1．3熒光酶免疫分析(fluoro enzyme immunoassay，F(xiàn)EIA) 基于FEIA建立的檢測(cè)系統(tǒng)以UniCAP為代表。UniCAP檢測(cè)系統(tǒng)將變應(yīng)原包被在一種與變應(yīng)原有著較強(qiáng)結(jié)合能力的新型固相載體纖維素衍生物ImmunoCAP上。變應(yīng)原捕獲樣本中的sIgE，再用β-半乳糖苷酶的多克隆和單克隆抗IgE抗體與sIgE結(jié)合，最后直接檢測(cè)熒光，熒光強(qiáng)度與sIgE的含量成正相關(guān)。Angelo[15]使用該方法對(duì)韓國(guó)首爾中重度變應(yīng)性鼻炎患者進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示該方法對(duì)中重度變應(yīng)性鼻炎患者sIgE的檢測(cè)水平最低為0．53 kU/L，而且檢測(cè)過程主要由UniCAP100全自動(dòng)檢測(cè)儀完成。該儀器可檢測(cè)500多種變應(yīng)原，檢測(cè)時(shí)間短，能夠避免人為的操作誤差，對(duì)技術(shù)人員的操作水平要求較低。該方法也是目前公認(rèn)的檢測(cè)sIgE的“金標(biāo)準(zhǔn)”[16]，對(duì)不同年齡段患者均適用，但儀器試劑昂貴，且每次試驗(yàn)只能檢測(cè)一種變應(yīng)原，檢測(cè)成本高，不易在臨床廣泛開展。

1．4納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法(magnetic nanoparticle chemiluminescence immunoassay，NM-CLIA) 化學(xué)發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)興起于20世紀(jì)70年代中期，發(fā)展至今已經(jīng)成為一種成熟先進(jìn)的超微量活性物質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，NM-CLIA是將納米磁微粒技術(shù)與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合建立起來的一種新型的檢測(cè)血清sIgE的方法。該方法的基本原理是借助生物素-鏈霉親和素生物放大系統(tǒng)，將變應(yīng)原包被在徑粒直徑為100 nm的磁微粒上，用以捕獲血清中sIgE，而sIgE會(huì)與辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP)的鼠抗人IgE抗體結(jié)合，最后HRP催化發(fā)光底物魯米諾和過氧化氫脲，光信號(hào)的強(qiáng)度可被檢測(cè)系統(tǒng)捕捉，進(jìn)而計(jì)算出sIgE的含量。王瓊等[17]用該方法檢測(cè)腐食酪螨sIgE抗體，顯示靈敏度達(dá)80．95%，特異度為100%。該方法最低檢測(cè)限達(dá)pg級(jí)，還具有檢測(cè)范圍廣、檢測(cè)時(shí)間短、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。此外，該方法使用中國(guó)的變應(yīng)原原料，檢測(cè)成本低[18]，對(duì)不同的過敏性疾病人群均適用。

1．5免疫印跡法(immunoblotting test，IBT) 免疫印跡法是20世紀(jì)70年代末80年代初發(fā)展起來的蛋白質(zhì)測(cè)定技術(shù)，其發(fā)明者為美國(guó)斯坦福大學(xué)的喬治·斯塔克[19]。該方法是將抗原抗體的反應(yīng)固定在固相膜載體上，通過酶催化底物反應(yīng)，使得固相膜上發(fā)生顏色的變化，進(jìn)而對(duì)血清sIgE進(jìn)行定量。基于該方法建立的檢測(cè)系統(tǒng)以Mediwiss敏篩定量檢測(cè)系統(tǒng)為代表。該系統(tǒng)使用了生物素親和素放大技術(shù)，檢測(cè)靈敏度較高，只需250 μL血清即可檢測(cè)20多種變應(yīng)原sIgE[20]。并且，Mediwiss敏篩檢測(cè)系統(tǒng)與UniCAP檢測(cè)系統(tǒng)均有很好的一致性[21]。此外，Mediwiss敏篩檢測(cè)系統(tǒng)在過敏性疾病的變應(yīng)原初篩、小兒食入性與吸入性過敏原sIgE檢測(cè)方面有著廣泛應(yīng)用[22-23]，為小兒變應(yīng)原初篩提供了新選擇。

1．6液相芯片法(liquid phase chip method) 液相芯片技術(shù)是美國(guó)Luminex公司開發(fā)的一種多重多功能檢測(cè)平臺(tái)，液相芯片法將液相芯片技術(shù)與博敏達(dá)液相芯片反應(yīng)動(dòng)力學(xué)專利結(jié)合，利用這個(gè)系統(tǒng)可以對(duì)一個(gè)樣品中的多種不同分子同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。這種檢測(cè)技術(shù)是1997年被開發(fā)出來的[24-25]，其基本原理是將不同的變應(yīng)原偶聯(lián)在熒光物質(zhì)編碼的聚苯乙烯微球上，從而捕獲血清中sIgE，生物素標(biāo)記的抗IgE抗體可與sIgE結(jié)合，最后加入鏈霉親和素標(biāo)記的藻紅蛋白。使用兩種不同波長(zhǎng)的激光照射經(jīng)過檢測(cè)儀通道的反應(yīng)終產(chǎn)物，當(dāng)微球和藻紅蛋白都能檢測(cè)到熒光信號(hào)才視為有效，分別測(cè)得各自的熒光值，根據(jù)熒光值可對(duì)sIgE進(jìn)行定量檢測(cè)[26]。液相芯片法只需50 μL血清即可檢測(cè)常見的60多種變應(yīng)原，靈敏度較高，最低檢測(cè)限達(dá)3 pg/mL[27]，檢測(cè)時(shí)間短，且對(duì)各年齡段患者均適用。

2 變應(yīng)原直接檢測(cè)的生物共振法

根據(jù)物質(zhì)波理論，任何物質(zhì)都伴隨著波而存在[28]。生物共振技術(shù)的治療基石是法國(guó)科學(xué)家德布羅意提出的量子物質(zhì)波理論，該理論于1929年獲諾貝爾獎(jiǎng)[29]。該理論認(rèn)為組成人體的各個(gè)器官也具有本身特有的物質(zhì)波，如腦電[30]、心電[31]。在過敏性疾病發(fā)生時(shí)，不同變應(yīng)原會(huì)引起不同波信號(hào)的改變，運(yùn)用BICOM2000生物共振檢測(cè)儀能夠檢測(cè)這些特異性的波信號(hào)，從而達(dá)到檢測(cè)變應(yīng)原的目的。BICOM2000不僅能夠檢測(cè)塵螨、花粉、化學(xué)物質(zhì)、食物等490多種變應(yīng)原，還能對(duì)藥品進(jìn)行快速檢測(cè)[32]，適用于皮膚科、耳鼻喉科、小兒科、呼吸科、消化科等科室的臨床診療工作[33]。該設(shè)備檢測(cè)效率高，僅需20 min就能確定變應(yīng)原，安全無創(chuàng)，簡(jiǎn)單快捷，患者易接受[34]。樓潔[35]用BICOM生物共振檢測(cè)儀和UniCAP100全自動(dòng)體外變應(yīng)原檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)包括吸入性(塵螨)、食物性(花生、魚類、桃)、真菌等7類變應(yīng)原進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)兩者的檢測(cè)結(jié)果相符合，且該方法對(duì)老年人或幼齡兒童的變應(yīng)原初篩尤為適用。但由于該類檢測(cè)應(yīng)用了物質(zhì)波理論，檢測(cè)過程容易受到外界環(huán)境、操作人員、受檢測(cè)人員自身干擾波影響，誤差難以避免，且本儀器為手動(dòng)操作，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差，較依賴操作人員的經(jīng)驗(yàn)。目前，對(duì)于該方法使用存在較大爭(zhēng)議，還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

3 結(jié) 語(yǔ)

本文對(duì)基于血清sIgE檢測(cè)與基于變應(yīng)原直接檢測(cè)的生物共振法進(jìn)行了綜述。基于血清sIgE的幾種檢測(cè)方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。在檢測(cè)費(fèi)用方面，ELISA與RAST的檢測(cè)靈敏度與特異度相當(dāng)，但ELISA更無污染且價(jià)格合理；而UniCAP檢測(cè)系統(tǒng)雖然是目前公認(rèn)的血清sIgE檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是儀器較為昂貴，僅部分大型醫(yī)療機(jī)構(gòu)有條件引進(jìn)該檢測(cè)系統(tǒng)，而且由于檢測(cè)費(fèi)用較高，主要適用于經(jīng)濟(jì)條件較好的患者。在檢測(cè)速度方面，納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測(cè)時(shí)間短，結(jié)果可靠，重復(fù)性好，靈敏度達(dá)pg級(jí)；Mediwiss敏篩也只需250 μL血清即可檢測(cè)20多種變應(yīng)原sIgE，在小兒變應(yīng)原初篩方面應(yīng)用較多。其余檢測(cè)方法，如液相芯片法雖具有高通量、檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)操作技能要求高；而生物共振檢測(cè)法可以直接體外檢測(cè)確定變應(yīng)原種類，無任何痛苦，但檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定，容易受到外界條件的干擾。因此，基于上述不同檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)，在臨床診療中，醫(yī)務(wù)人員可以為不同人群選擇合適的變應(yīng)原體外檢測(cè)方法。綜上，過敏性疾病對(duì)人類生命健康的影響越來越廣泛，隨著體外檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，預(yù)防和診治過敏性疾病將更加方便快捷。