化學發(fā)光免疫分析法的研究進展

張晨磊

天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院檢驗科 (天津 301800)

化學發(fā)光免疫分析法是一種結合化學發(fā)光和免疫分析的檢測方法，不僅操作簡單、檢測速度快，而且具備較高的檢測靈敏度與特異度。近年來，化學發(fā)光免疫分析法被廣泛應用于臨床疾病診斷、環(huán)境檢測與食品檢測等領域，均取得了較好的應用效果。1977年，化學發(fā)光免疫分析法被首次提出，至今已發(fā)展了40余年，檢測體系趨于成熟[1]。但在實際臨床應用過程中，檢測數(shù)量眾多、成分復雜或低豐度的樣品時，常規(guī)化學發(fā)光免疫分析法往往無法達到預期的效果，故需對化學發(fā)光免疫分析法進行優(yōu)化，以提升其檢測效果。本文旨在綜述新型化學發(fā)光免疫分析法及其與其他技術聯(lián)合應用的現(xiàn)狀，并展望化學發(fā)光免疫分析法的研究前景。

1 新型化學發(fā)光免疫分析法(納米粒子)

以往的常規(guī)化學發(fā)光免疫分析法雖可滿足一般檢測需求，但在實際應用過程中，仍有可能出現(xiàn)特異度不足以及信噪比不高等情況[2]。近年來，基于納米粒子發(fā)展而來的新型化學發(fā)光免疫分析法取得了較好的進展，使檢測效果得以有效提升，各類納米粒子的引入可縮短檢測時間、降低背景干擾值、提升檢測的靈敏度及特異度等，常用的納米粒子包括磁性納米粒子、金納米粒子等。

1.1 磁性納米粒子

磁性納米粒子是指可均勻分散于一定基液中的膠態(tài)復合材料，具有超順磁性、較高的比表面積、可修飾功能基團等特性。常用的磁性物質(zhì)有純鐵粉、羰基鐵、磁鐵礦、正鐵酸鹽等,其粒徑一般在10～100 nm。在開展免疫分析的過程中，分離抗原-抗體免疫復合物通常需耗費較長的時間，且操作步驟煩瑣。將磁性微粒引入化學發(fā)光免疫分析法中，使其成為免疫反應和分離的固相載體，是加速抗原-抗體免疫復合物分離的有效措施。磁性微粒與抗體相連后，通過免疫反應即可捕獲靶物質(zhì)，由此形成免疫復合物，受外加磁場作用后，免疫復合物便會發(fā)生滯留，進而達到分離的效果，同時，還可降低樣品中基質(zhì)對檢測產(chǎn)生的干擾。目前，基于磁性微粒的化學發(fā)光免疫分析法在癌胚抗原、甲胎蛋白、皮質(zhì)醇等物質(zhì)的檢測中已得到了廣泛的應用[3]。有研究報道，在對人血清前列腺特異抗原進行檢測時，相較于化學發(fā)光免疫分析法，應用基于磁性微粒的化學發(fā)光免疫分析法，不但能減少約50%的反應試劑用量，還可縮短反應時間，降低背景值，提高靈敏度[4]。

在基于磁性微粒的化學發(fā)光免疫分析法中，磁性微粒的表面修飾有利于提高檢測效率，其不僅可直接修飾抗體，還可應用于鏈霉親和素放大體系、異硫氰酸熒光素的異硫氰酸熒光素-抗異硫氰酸熒光素體系。有研究報道，在對磁性微粒進行修飾時，首先應用聚醚酰亞胺，其次應用戊二醛，將其與抗體進行連接，可加大磁性微粒和抗體間的距離，從而減少免疫反應時存在的空間位阻[5]。

1.2 金納米粒子

在實施化學發(fā)光免疫分析法檢測時，金納米粒子可對魯米諾發(fā)光體系內(nèi)自由基的產(chǎn)生與電子轉移起到催化作用，增強化學發(fā)光反應，進而提高檢測靈敏度。有學者分析了金納米粒子在化學發(fā)光反應中的作用，發(fā)現(xiàn)金納米粒子的引入可使魯米諾發(fā)光體系內(nèi)發(fā)光反應的信號強度提升4倍以上，表明金納米粒子可催化魯米諾發(fā)光反應[6]。有研究指出，應用酶標記抗體修飾金納米粒子后，將其用作反應抗體來檢測癌胚抗原，其靈敏度較常規(guī)化學發(fā)光免疫分析法提升了3個數(shù)量級[7]。由此可知，金納米粒子的應用不僅可促進自由基的產(chǎn)生及電子轉移，而且可作為信號放大載體，增強發(fā)光信號[8]。

2 與其他技術的聯(lián)合

除了納米粒子外，與其他技術的聯(lián)合也可提高化學發(fā)光分析法的檢測性能。

2.1 與化學發(fā)光共振能量轉移技術的聯(lián)合

化學發(fā)光共振能量轉移是指受到供體基團的激發(fā)作用后，將一對偶極子介導的能量由供體轉移至受體，轉移時無光子介入，不會出現(xiàn)輻射反應?；瘜W發(fā)光共振能量轉移的信號背景值明顯低于熒光共振能量轉移，可提高檢測的靈敏度，但能量轉移效率較低[9]。為解決這一問題，很多學者為選擇合適的能量受體開展了相關的研究。其中，以金納米粒子為首選，有學者在檢測甲胎蛋白時，將辣根過氧化酶催化的魯米諾發(fā)光體系作為能量供體，金納米粒子作為能量受體，甲胎蛋白不同的抗原表位的抗體分別與辣根過氧化酶及金納米粒子進行結合，開展雙抗夾心反應，通過結合2種抗原表位的抗體，達到共振能量轉移的目的，結果發(fā)現(xiàn)，化學發(fā)光共振能量轉移的效率與納米粒子的直徑密切相關，相較于直徑為20 nm的金納米粒子，直徑為40 nm的金納米粒子具備更高的轉移效率，考慮主要是由于后者具備更大的消光系數(shù)，且具有更大的表面積，可修飾更多的抗體[10]。為提高能量轉移效率，部分碳納米材料也被應用到化學發(fā)光共振能量轉移中，如石墨烯、氧化石墨烯等，同時被證實為化學發(fā)光的超級受體。

2.2 與微陣列芯片技術的聯(lián)合

化學發(fā)光免疫分析法是將具有高靈敏度的化學發(fā)光測定技術與高特異度的免疫反應相結合，用于各種抗原、半抗原、抗體、激素、酶、脂肪酸、維生素和藥物等的檢測分析技術。微陣列芯片是指采用光導原位合成或微量點樣等方法，將大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至組織切片、細胞等生物樣品有序地固化于支持物(如玻片、尼龍膜等載體)的表面，組成密集二維分子排列，然后與已標記的待測生物樣品中靶分子反應，通過特定的儀器，如激光共聚焦掃描儀或電荷偶聯(lián)攝影像機快速、并行、高效地檢測分析反應信號的強度，從而判斷樣品中靶分子的數(shù)量。有學者在硅烷化的玻璃微陣列芯片上實施化學發(fā)光免疫分析，各檢測孔內(nèi)放置待檢測物的對應抗體，并引入金納米粒子，達到催化的效果，用于同時檢測甲胎蛋白、癌胚抗原、糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)與糖類抗原153(Carbohydrate antigen 153，CA153)蛋白，結果顯示，在48 min內(nèi)，48個樣品檢測工作全部完成，同時金納米粒子的介入提升了信號強度，達到了高靈敏度及高通量檢測的目的[11]。也有研究者在硅烷化的玻璃芯片上應用化學發(fā)光免疫分析法檢測癌胚抗原及糖類抗原199(Carbohydrate antigen 199，CA199)蛋白，亦取得了不錯的效果[12]。由此可見，微陣列芯片技術是實現(xiàn)化學發(fā)光免疫分析高通量檢測的重要技術。

2.3 與免疫層析技術的聯(lián)合

免疫層析法的原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品(尿液或血清)后，基于毛細現(xiàn)象，樣品將沿著該膜向前移動，當移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應的抗原即與該抗體發(fā)生特異度結合，若用免疫膠體金或免疫酶染色可使該區(qū)域顯示一定的顏色，從而實現(xiàn)特異的免疫診斷。有學者聯(lián)合應用化學發(fā)光免疫分析法與免疫層析技術定量檢測沙丁胺醇與萊克多巴胺，首先，在層析膜的結合區(qū)固定酶標萊克多巴胺抗體與沙丁胺醇抗體，然后，在2個檢測區(qū)對沙丁胺醇-牛血清白蛋白與萊克多巴胺-牛血清白蛋白進行固定，再將樣品滴加至硝酸纖維素膜一端后，隨著樣品的流動進入到固定有抗體的結合區(qū)，使樣品內(nèi)存在的抗原與抗體結合，過量未發(fā)生結合的酶標抗體則會繼續(xù)流動，進入到檢測區(qū)位置，分別結合沙丁胺醇-牛血清白蛋白與萊克多巴胺-牛血清白蛋白，上述整個檢測過程不超過20 min，操作簡單，檢測速度相對較快[13]。

2.4 與流動注射技術的聯(lián)合

基于流動注射技術的化學發(fā)光免疫分析法已在臨床廣泛應用，多通道噴墨式微量給樣可提升聚二甲基硅氧烷聚合作用，在多孔玻璃上開微孔反應器，孔洞直徑為1.5 mm，來實施免疫反應與發(fā)光檢測，該技術不僅可減少樣品用量，而且具備極高的檢測靈敏度。以免疫球蛋白A作為檢測樣本時，其可取得0.1 ng/ml的檢測下限，明顯低于微孔板的0.86 ng/ml[14]。根據(jù)微孔反應器具備的微陣列模式，通過增加給樣通道可實現(xiàn)多組分的微量檢測。

3 結論與展望

隨著研究的不斷深入，各種新型化學發(fā)光免疫分析法以及化學發(fā)光免疫分析法與其他技術的聯(lián)合應用可有效提升化學發(fā)光免疫分析法的靈敏度及特異度，并實現(xiàn)多組分同時檢測。但在實際應用過程中，化學發(fā)光免疫分析法仍存在不足，如儀器體積較大，檢測結果可能受到樣品基質(zhì)的影響，檢測小分子的精密度受限等[15]。為進一步提高化學發(fā)光免疫分析法的檢測效果，臨床仍需開展更多的試驗研究，如降低化學發(fā)光免疫分析檢測儀器的成本，縮小儀器體積，使其更便于攜帶；強化處理檢測樣本基質(zhì)的能力，提高檢測穩(wěn)定性；進一步完善多通道以及多組分的化學發(fā)光免疫分析檢測技術，提升檢測效率；發(fā)展化學發(fā)光免疫分析法聯(lián)用技術，擴大其應用范圍。