輻射花粉技術(shù)在西瓜單倍體培養(yǎng)中的應(yīng)用

田花麗，黃冉濤，劉瑞，曹雙，周青輝，張秋月，郭雙雙，范長(zhǎng)有

（南陽(yáng)市科學(xué)院，河南南陽(yáng)473000）

西瓜果肉多汁，果皮可炒食，清涼爽口，具有一定藥用價(jià)值[13]。利用單倍體育種技術(shù)和分子標(biāo)記育種技術(shù)相結(jié)合的方法，可以減少不利影響因子的存在，大大減少培育自交系所需的時(shí)間和成本。采用輻射花粉技術(shù)培育單倍體植株可以克服離體雌、雄核誘導(dǎo)的弊端，在操作上省時(shí)省力。因此，利用輻射花粉培養(yǎng)單倍體以培育西瓜新品種，可助力西瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，具有重要的理論和實(shí)踐意義。

1 單倍體及產(chǎn)生途徑

單倍體（Haploid）是指體細(xì)胞中僅有配子染色體數(shù)目的細(xì)胞或個(gè)體，具有完整的遺傳物質(zhì)。將單倍體加倍后得到純合雙單倍體（DH），雜交后代顯隱性突變都可表達(dá)，且性狀可以穩(wěn)定遺傳，是獲取突變體的最佳途徑，也是研究基因功能的基礎(chǔ)[1]。單倍體植株的基因來(lái)源相同，易建立進(jìn)化樹(shù)，可探索其親本進(jìn)化淵源關(guān)系，是分子標(biāo)記技術(shù)的最佳材料。由于很多植物存在自交不親和現(xiàn)象，很難從傳統(tǒng)育種方式獲得純合體，單倍體的產(chǎn)生解決了這一問(wèn)題。利用單倍體技術(shù)育種已經(jīng)在辣椒、甜瓜、甘藍(lán)、南瓜、黃瓜、西葫蘆、玉米等作物上得到了驗(yàn)證[2-8]，該方法可以解決育種時(shí)間長(zhǎng)、后代性狀不穩(wěn)定及任務(wù)量大等問(wèn)題。因此，培育出單倍體后再進(jìn)行雜交育種已經(jīng)成為當(dāng)今育種領(lǐng)域的首選。自然界中可以自發(fā)形成單倍體的概率極為低下，目前可獲取單倍體途徑主要有自發(fā)形成，如假受精、孤雌繁育、孤雄繁育等；離體培養(yǎng)獲得，如離體小孢子培育、離體大孢子培育、輻射花粉或高頻誘導(dǎo)花（原位誘導(dǎo)）。目前應(yīng)用最多且最成熟的一種方法是離體雄核培育即小孢子培養(yǎng)技術(shù)，但有的作物不適用該方法[9]。通過(guò)花粉粒離體培養(yǎng)成功獲得單倍體的先例出現(xiàn)在19世紀(jì)60年代[10]，葫蘆科作物離體雌核誘導(dǎo)首次獲得西葫蘆單倍體植株是19世紀(jì)80年代[11-12]。輻射花粉或高頻照射花需要人為采用某種射線干擾其正常的發(fā)育途徑，損害正常的雌雄結(jié)合，使其形成單倍體。

2 單倍體培養(yǎng)技術(shù)在西瓜中的應(yīng)用

目前，輻射花粉技術(shù)結(jié)合離體胚狀體再生在黃瓜、甜瓜上取得了成功，該方法涉及到輻射源及輻射量、胚再生體系優(yōu)化等技術(shù)，在西瓜單倍體誘導(dǎo)上值得效仿[13-15]。離體誘導(dǎo)外植體再生獲得單倍體的體系尚不成熟，試驗(yàn)過(guò)程中涉及到供試材料的品種差異、發(fā)育狀況、培養(yǎng)基類型及狀態(tài)、外源激素的種類及濃度配比、培養(yǎng)條件等因素的影響，不可控因素多，難度較大。近年來(lái)，原位雌核輻射或高頻誘導(dǎo)技術(shù)培育單倍體技術(shù)在國(guó)內(nèi)外應(yīng)用較多，此方法無(wú)需離體挑取胚，不傷害胚珠細(xì)胞發(fā)育，且污染率容易控制，但該技術(shù)體系還不成熟、穩(wěn)定[19]。

3 影響輻射花粉誘導(dǎo)的因素

3.1 基因型

基因型是誘導(dǎo)單倍體是否成功的關(guān)鍵因素之一，這不單單存在于物種之間，在物種內(nèi)部也較為明顯。品系與花藥、子房、胚珠等理化性質(zhì)及抗逆性存在著相互關(guān)聯(lián)，品系間存在差異[16]。劉曉輝[15]采用紫外照射西瓜花粉時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同品系耐輻射情況不同，小瓜品系優(yōu)于大瓜品系。因此，在獲取單倍體植株過(guò)程中，方式各異，但基因型作為根本影響因子，嚴(yán)重影響著其誘導(dǎo)分化及成苗情況。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析確定特異基因并探索其作用機(jī)理，在未來(lái)研究工作中值得探究。

3.2 授粉季節(jié)的影響

環(huán)境適宜可以使西瓜的生長(zhǎng)達(dá)到最佳狀態(tài)，雄核、雌核等的發(fā)育狀態(tài)也最好[17]。龔思[18]在西瓜未受粉子房誘導(dǎo)時(shí)發(fā)現(xiàn)在秋季種植，日均溫度在21℃~32℃之間時(shí)胚狀體誘導(dǎo)率最高。楊紅[19]采用γ射線輻射花粉，發(fā)現(xiàn)授粉11~12 d的果實(shí)發(fā)育最好。由此可知，高溫時(shí)期選取開(kāi)花前或開(kāi)花初期的材料為外植體，可以提高誘導(dǎo)率。但高溫高濕是瓜類各種病害如枯萎病、炭疽病等高發(fā)季節(jié)，應(yīng)選擇高抗的品種作為研究親本。

3.3 輻射源及輻射量情況

輻射源有紫外照射、γ射線等，輻射量的選擇因材料而異，在試驗(yàn)中起著至關(guān)重要的作用。輻射劑量高容易導(dǎo)致花粉粒死亡，輻射劑量低則達(dá)不到誘導(dǎo)單倍體的目的。因此，適宜的輻射量是試驗(yàn)成功與否的重點(diǎn)。劉曉輝[15]采用紫外輻射西瓜花粉得出45 min紫外輻射時(shí)花粉僅能存活下來(lái)50%，紫外90 min是最佳的輻射劑量。用γ射線輻射花粉粒可成功獲得單倍體植株，裴曉利[22]采用γ射線輻照黃瓜花粉，輻射劑量為150 Gy，這與蘇敏在西葫蘆上的研究結(jié)果不一致[23]。楊紅[19]采用γ射線輻射西瓜花粉發(fā)現(xiàn)輻射后11 d左右胚挽救成功率高。眾多研究者發(fā)現(xiàn)輻射量在半致死量之上為宜，具體輻射劑量應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)情況來(lái)確定。

4 再生植株的倍性鑒定

任何途徑獲取的單倍體植株，其染色體倍性都不明確，需要選擇合適的方法鑒別其倍性情況。精準(zhǔn)的倍性鑒別是后期工作開(kāi)展的前提。常用的植株倍性鑒定的方法有：①直接鑒別法，包括計(jì)量染色體數(shù)目法；②間接鑒別法，包括外觀形態(tài)學(xué)觀察法、葉片細(xì)胞鑒定法、流式細(xì)胞儀鑒別法。

單倍體植株整個(gè)生長(zhǎng)周期長(zhǎng)勢(shì)均低于正常植株，可看到明顯差異。所以在植株生長(zhǎng)早期可通過(guò)觀察法初步選出單倍體的植株。外觀形態(tài)學(xué)觀察法比較直接，主觀性強(qiáng)，耗時(shí)。計(jì)量染色體數(shù)目法具有可靠、精確的特點(diǎn)[23]。流式細(xì)胞儀鑒定法是提取完整DNA，用特異的熒光染料對(duì)其進(jìn)行染色，根據(jù)DNA含量來(lái)合理推測(cè)植株的倍性，簡(jiǎn)便、快捷、精確，但是費(fèi)用高；葉片細(xì)胞鑒定法是根據(jù)葉片中氣孔的形態(tài)、葉綠體數(shù)量等情況來(lái)鑒定植株的倍性。劉曉輝[15]采取根尖通過(guò)顯微鏡觀察染色體數(shù)鑒定了再生植株的倍性；李玲[20]也采用計(jì)量染色體數(shù)目法鑒定出了再生苗的倍性；管葦[21]在黃瓜倍性鑒定中發(fā)現(xiàn)外觀形態(tài)學(xué)觀察法和葉片細(xì)胞鑒定法可作為黃瓜倍性鑒定的方法，且結(jié)果一致。

5 問(wèn)題及展望

目前西瓜生產(chǎn)中多以高產(chǎn)、高抗品種為主，優(yōu)質(zhì)、特色、優(yōu)良品種欠缺。利用輻射花粉誘導(dǎo)單倍體技術(shù)仍不成熟，體系不穩(wěn)定，因此，應(yīng)篩選優(yōu)質(zhì)基因型，確定適宜的輻射源和劑量，改進(jìn)再生胚挽救體系，探索出成熟的輻射花粉誘導(dǎo)技術(shù)。采用原位輻射花粉誘導(dǎo)雌核，配合離體胚再生恢復(fù)技術(shù)，將是未來(lái)獲得西瓜單倍體的一種可行性技術(shù)，可提供更多優(yōu)質(zhì)西瓜品種，從而加快西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展。