云南省紅河州某縣生豬屠宰場(chǎng)沙門菌的分離鑒定分析

袁保明，翟新國(guó)，劉德強(qiáng)，李曉霄，金艷壽

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北邯鄲 056000；2.云南曲靖陸良縣板橋鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南曲靖 655602；3.易門縣六街辦事處農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南玉溪 651107）

沙門菌在嚴(yán)重危害著公共衛(wèi)生安全的同時(shí)， 也給畜牧業(yè)和肉制品加工業(yè)造成了極其嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。 據(jù)報(bào)道，被感染的豬是屠宰場(chǎng)和加工環(huán)節(jié)最主要的污染源[2]。 某縣生豬屠宰場(chǎng)的屠宰環(huán)節(jié)表面進(jìn)行樣品的采集， 按照GB4789，4-2010[3]中分離程序?qū)Σ杉瘶悠愤M(jìn)行沙門菌分離及耐藥性實(shí)驗(yàn)。 此次將重點(diǎn)探究沙門菌在屠宰場(chǎng)每個(gè)環(huán)節(jié)中沙門菌的分離， 通過污染現(xiàn)狀及耐藥性實(shí)驗(yàn)研究為防控措施提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

采樣時(shí)間自2019 年9 月至2021 年10 月，采集9 次樣品，采樣時(shí)間間隔約為1 月/次，樣品來源于云南省紅河州某縣生豬屠宰場(chǎng)進(jìn)行采集，此屠宰場(chǎng)每天屠宰數(shù)在100～200 頭，為某縣供應(yīng)80%以上豬肉食品。 采集樣品共計(jì)1530 份（見表1）。 實(shí)驗(yàn)器具都經(jīng)過滅菌或消毒，采取無菌操作，采樣過程中為防止被污染，每次采樣結(jié)束后盡快將樣品送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。

表1 某縣生豬屠宰場(chǎng)采樣數(shù)量 （單位：份）

1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑及材料

麥康凱瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂，均購(gòu)于北京某技術(shù)有限責(zé)任公司。 緩沖蛋白胨水（BPW）、亞硒酸鹽胱氨酸（SC）增菌液、亞硫酸鉍（BS）瓊脂、SS 瓊脂均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司， 沙門菌顯色培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

按照中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.4-2010 進(jìn)行分離鑒定[4]，具體操作如下：

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)中， 樣品使用生理鹽水，按0.0001、0.001、0.01、0.1 和1 五個(gè)等比例梯度進(jìn)行稀釋。 將稀釋的樣品，均勻涂布在BS、SS 瓊脂培養(yǎng)基上，在37℃孵化箱內(nèi)培養(yǎng)24 小時(shí)，得到單個(gè)細(xì)菌菌落。 37℃培養(yǎng)24 小時(shí)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)。

1.5 沙門菌分離結(jié)果

從1530 份屠宰場(chǎng)樣品中分離出沙門菌共計(jì)272 株，總分離率為17.8%。 每次樣品中沙門菌的分離率都維持在比較穩(wěn)定水平； 不同批次不同屠宰場(chǎng)樣品中沙門菌分離率略有波動(dòng)。 4、5、6 樣 品 沙門菌污染率相比高，不同的屠宰場(chǎng)分離數(shù)量（見表2）。

表2 某縣生豬屠宰場(chǎng)分離數(shù)量

1.6 沙門氏菌革蘭氏染色篩選

菌落經(jīng)過分離純化后，挑選形態(tài)典型的單個(gè)菌落，根據(jù)革蘭氏染色后的單個(gè)細(xì)菌菌體的形態(tài)，來篩選沙門氏菌。油鏡下觀察，革蘭氏陽性菌呈現(xiàn)紫色，革蘭氏陰性菌呈現(xiàn)紅色，這樣篩選出陰性菌，大致作出篩選。

1.7 生理生化鑒定

將分離得到的272 株疑似菌株的革蘭氏染色陰性細(xì)菌進(jìn)行生化鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中有272株細(xì)菌的生化鑒定結(jié)果符合沙門菌生化鑒定標(biāo)準(zhǔn)，均能分解葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸；根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》來確定所屬的種。

1.8 沙門菌的PCR 鑒定

利用PCR 方法對(duì)沙門菌種屬特異性基因invA 進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)系引物（見表3）。

表3 測(cè)系引物

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 分鐘；94℃變性1分鐘；55℃退火1 分鐘；72℃延伸1 分鐘； 共25個(gè)循環(huán)，最后72℃再延伸10 分鐘；4℃保存。 經(jīng)PCR 擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

利用PCR 檢測(cè)疑似菌株攜帶invA 的情況，均能檢出invA 基因，通過PCR 擴(kuò)增沙門氏菌特異性基因invA，得到特異性片段，與預(yù)期結(jié)果相符。

2 沙門菌分離鑒定結(jié)果分析

云南省紅河州某縣生豬屠宰場(chǎng)， 在各個(gè)屠宰環(huán)節(jié)中嚴(yán)格按照屠宰程序， 某縣生豬屠宰場(chǎng)的衛(wèi)生條件較好。9 次屠宰場(chǎng)樣品中的沙門菌分離率無較大的波動(dòng)， 但是沙門菌的分離率在屠宰場(chǎng)環(huán)節(jié)中波動(dòng)較大， 其中設(shè)施設(shè)備及其屠宰刀具是屠宰場(chǎng)中重要的工具， 是容易引起細(xì)菌交叉污染， 調(diào)查結(jié)果顯示屠宰刀具環(huán)節(jié)中存在交叉污染， 以此建議屠宰場(chǎng)應(yīng)該給屠宰環(huán)節(jié)配備2～3 套屠宰工具， 交替使用時(shí)對(duì)屠宰刀具進(jìn)行徹底浸泡消毒， 防止屠宰場(chǎng)由于屠宰刀具帶來的交叉污染情況的發(fā)生。

另外， 沙門菌可以通過被污染的屠宰人員的手或其手套進(jìn)行傳播。 屠宰流程中，胴體上的沙門菌的檢出率降低， 這是由于屠宰操作的清洗環(huán)節(jié)可以降低胴體污染。

3 討論

生豬屠宰場(chǎng)的采樣分離研究發(fā)現(xiàn)， 云南省紅河州某縣生豬在待宰圈等待屠宰期間也會(huì)造成交叉污染，待宰圈的清洗時(shí)清洗水的流動(dòng)也會(huì)造成沙門菌的交叉污染。 其中屠宰時(shí)流水線上的污染主要來自于屠宰環(huán)節(jié)放血環(huán)節(jié)、燙毛環(huán)節(jié)、脫毛環(huán)節(jié)、劈半環(huán)節(jié)、 拋光環(huán)節(jié)等機(jī)械設(shè)施及其人工屠宰活動(dòng)區(qū)域的污染， 其原因是屠宰操作時(shí)的不規(guī)范也會(huì)造成沙門菌的交叉污染， 有可能操作工人也會(huì)攜帶沙門菌進(jìn)入屠宰場(chǎng)， 徹底消毒是解決的核心。

許多研究表明， 在放血環(huán)節(jié)豬體表面會(huì)受到高水平的污染， 當(dāng)攜帶沙門菌的豬胴體經(jīng)過各個(gè)屠宰環(huán)節(jié)時(shí)會(huì)通過屠宰人員的手或刀具將沙門菌傳遞到其他胴體產(chǎn)生交叉污染[4]。 綜上可見在屠宰流水線上最重要的是對(duì)屠宰操作的嚴(yán)格執(zhí)行及其日常屠宰場(chǎng)的衛(wèi)生消毒管理， 及其標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)是實(shí)現(xiàn)控制沙門菌污染的有力保障措施。