乙型腦炎病毒微滴式數(shù)字PCR 檢測方法的建立

薛曉寧 徐翮飛 張 娟 侯 偉 張 瑾（通信作者）

青島國際旅行衛(wèi)生保健中心（山東，青島，266071）

乙型腦炎病毒屬于黃病毒屬黃病毒科，病毒主要在蚊與蚊中傳播， 還可在豬和水鳥等動物中傳播，經(jīng)感染的蚊蟲叮咬可傳播到人［1］。大部分感染者沒有癥狀或者出現(xiàn)輕微癥狀，少數(shù)感染者發(fā)展為腦炎，出現(xiàn)包括突發(fā)頭疼、高熱、定向障礙、昏迷等癥狀。四分之一的重癥患者死亡，30%存活的重癥患者存在永久性中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷［2］。

因?yàn)楦腥菊哐褐羞_(dá)不到足夠高的病毒，通過PCR 方法檢測血液中病毒核酸相對困難。 目前主要是通過檢測血漿或者腦脊液中的特異性抗體對乙型腦炎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷［3］。 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（digital polymerase chain reaction，dPCR） 是第三代PCR 技術(shù)，是一種核酸分子絕對定量技術(shù)。 其中應(yīng)用最廣泛的是微滴式數(shù)字PCR（ddPCR），把核酸分子稀釋到一定濃度，生成一定數(shù)目的微滴，然后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，讀取陽性微滴數(shù)目，計(jì)算出樣品的原始濃度［4］，在低濃度的核酸含量下也可靈敏和準(zhǔn)確地進(jìn)行絕對定量。

本研究建立了乙型腦炎病毒核酸ddPCR 檢測方法，并與實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）相比較，初步判斷ddPCR 在檢測乙型腦炎病毒中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

乙型腦炎病毒核酸來自乙型腦炎病毒滅活疫苗。 用于特異性檢測的常見蟲媒病毒核酸（登革病毒，寨卡病毒，基孔肯亞病毒，黃熱病毒）均為本實(shí)驗(yàn)室保存。 所有樣本均通過商品化試劑盒檢測。

1.2 儀器和試劑

bio-rad T100 普通RCR；QX200TM Droplet DigitalTM PCR 系統(tǒng)包括微滴生成儀和微滴讀取儀（Biorad 公司）；Quantistudio 5 熒光定量PCR（ABI公司）。 One-Step RT-ddPCR Advanced Kit for Probes （1864021，Biorad 公司）；One Step Prime-ScriptTMRT-PCR Kit（Perfect Real Time）（Takara）；乙型腦炎病毒核酸檢測試劑盒購自上海之江生物有限公司。委托上海生工生物有限公司以pUC57 為克隆載體合成包括擴(kuò)增片段在內(nèi)500 bp 長度的基因序列，最終獲得pUC57- JEV 作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。

1.3 引物和探針設(shè)計(jì)及優(yōu)化

從NCBI 網(wǎng)站獲得乙型腦炎病毒NS3 基因，用Primer Express 3.0 設(shè)計(jì)特異擴(kuò)增乙型腦炎病毒的引物和探針。 序列如下： JEV-F 5’AGAGCACCAAGGGAATGAAATAGT3’，JEV-R 5’AATAGGTTGTAGTTGGGCACTCTG3’，Probe-JEV 5’-FAM-CCACGCCA-CTCGACCCATAGACTG-TAMRA-3’。 引物和探針均由Invitrogen 生物有限公司合成。 采用設(shè)計(jì)好的引物和探針建立qPCR 和ddRT-PCR 方法， 包括擴(kuò)增循環(huán)條件的優(yōu)化及引物、探針濃度的優(yōu)化。

1.4 qPCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)條件

反應(yīng)體系為20 μL，其中包括One Step RT-PCR Buffer III 10 μL， 引物和探針 （各10umol） 0.4 μL，TaKaRa Ex Taq HS 0.4 μL，PrimeScript RT enzyme Mix Ⅱ0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.4 μL，RNA 2 μL，RNase Free dH2O 5.6 μL。反應(yīng)條件：42 ℃5 min， 95 ℃10 s，95 ℃5 s，60 ℃34 s （收集熒光信號）共40 個(gè)循環(huán)。

1.5 ddPCR 反應(yīng)體系和條件

根據(jù)優(yōu)化結(jié)果， 確定ddPCR 反應(yīng)體系為：Supermix 5 μL，Reverse transcriptase 2 μL，300 mmol/L DTT 1 μL，10 μMol/L 引物1.4 μL（終濃度700 nmol/L），10 μMol/L 探針0.5 μL（終濃度250 nmol/L），RNA模板1 μL， RNase-free Water 7.7 μL，共20 μL。 將配制好的20 μL PCR 反應(yīng)液， 轉(zhuǎn)移至微滴發(fā)生卡樣本孔中，再加入70 μL 微滴發(fā)生油至油孔中，利用微滴生成器制備反應(yīng)微滴。 將每個(gè)樣品的微滴分別轉(zhuǎn)移至96 孔PCR 反應(yīng)板中對應(yīng)的反應(yīng)孔中，在普通PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。 反應(yīng)條件設(shè)置為：42 ℃60 min；95 ℃10 min；95 ℃30 s，56.9 ℃1 min，共40 個(gè)循環(huán)；98 ℃10 min；4 ℃∞。ddPCR 反應(yīng)結(jié)束后用微滴分析儀對微滴進(jìn)行分析，Quantasoft 1.7.4 軟件完成對數(shù)據(jù)的自動處理。

1.6 特異性驗(yàn)證

用該方法對實(shí)驗(yàn)室乙型腦炎病毒進(jìn)行ddPCR特異性檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)室保存的多種蟲媒病毒核酸，包括：登革病毒（DFV），寨卡病毒（ZIKV），基孔肯亞病毒（CHIKV），乙型腦炎病毒（JEV），黃熱病毒（YFV），按照上述優(yōu)化條件進(jìn)行檢測，驗(yàn)證ddPCR 反應(yīng)的特異性，同時(shí)設(shè)陰性對照（NTC）和陽性對照（陽性質(zhì)粒）。

2 結(jié)果

2.1 ddPCR 反應(yīng)條件的確定

ddPCR 方法的準(zhǔn)確性與PCR 擴(kuò)增體系中的引物、 探針濃度和反應(yīng)溫度密切相關(guān)。 為獲得最佳ddPCR 效果，對引物、探針濃度和反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化。以pUC57- JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，200～900 nmol/L 設(shè)置引物濃度，50～300 nmol/L 設(shè)置探針濃度，選擇55～65 ℃設(shè)置梯度溫度，分別進(jìn)行ddPCR。 根據(jù)陽性熒光擴(kuò)增值與本底間差異，以及陽性液滴產(chǎn)生的數(shù)量進(jìn)行選擇，最佳引物濃度為700 nmol/L，最佳探針濃度為250 nmol/L 。 最佳退火溫度為56.9 ℃時(shí)，陽性微滴與陰性微滴區(qū)分得最開，且之間空白處微滴數(shù)目最少（圖1）。

圖1 不同退火溫度ddPCR 擴(kuò)增乙型腦炎病毒核酸一維散點(diǎn)圖（A）和不同引物濃度ddPCR 擴(kuò)增乙型腦炎病毒核酸一維散點(diǎn)圖（B）

2.2 靈敏度分析

紫外分光光度法測定pUC57- JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，稀釋，終濃度為1×106，然后進(jìn)行10 倍梯度稀釋，qPCR 檢測到1×102的pUC57-JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，ddPCR 檢測到1×101的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒， 檢出限為16.1 copies/μL（圖2）。

圖2 梯度稀釋擴(kuò)增pUC57-JEV 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 A. qPCR； B. ddPCR

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按已優(yōu)化的ddPCR 檢測條件進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，以pUC57-JEV 為模板，使用新建立的體系進(jìn)行3 個(gè)濃度3 次重復(fù)測定。 結(jié)果顯示，相同濃度模板的反應(yīng)之間陽性微滴數(shù)接近， 變異系數(shù)分別為3.45%、3.65%、4.17%（表1）， 說明建立的ddPCR 檢測體系重復(fù)性好。

表1 不同濃度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒重復(fù)性檢測結(jié)果

2.4 特異性實(shí)驗(yàn)

將JEV、YFV、DFV、CHIKV、ZIKV 的RNA 進(jìn)行ddPCR 方法特異性檢測， 結(jié)果表明： 除了pUC57-JEV 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和JEV RNA 有特異性擴(kuò)增外，其他4 種病毒和陰性對照擴(kuò)增結(jié)果均為陰性 （圖3），表明建立的ddPCR 擴(kuò)增體系特異性高。

圖3 ddPCR 檢測乙型腦炎核酸特異性驗(yàn)證

3 討論

乙型腦炎又叫日本腦炎，是一種嚴(yán)重的蚊媒傳播的人獸共患病，可引起豬流產(chǎn)或早產(chǎn)，感染人群可導(dǎo)致嚴(yán)重的腦炎，致死性高，可造成巨大經(jīng)濟(jì)損失和公共衛(wèi)生負(fù)擔(dān)。青島是山東省東部沿海城市，乙腦發(fā)病率一直低于全國同期發(fā)病水平，2007-2012年曾連續(xù)6 年無報(bào)告病例［5］。 但2013 年出現(xiàn)乙腦疫情暴發(fā)，2013-2018 年間青島乙腦報(bào)告病例44 例，年平均發(fā)病率為0.08/10 萬。 病例多為45 歲以上人群，病死率高達(dá)13.64%，后遺癥發(fā)生率為38. 64%［6］。乙腦目前沒有特效的治療藥物，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療是改善預(yù)后的關(guān)鍵因素。

臨床目前主要是通過檢測血漿或者腦脊液中的特異性抗體對乙型腦炎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷。 但因?yàn)辄S病毒屬病毒間存在較強(qiáng)的交叉免疫， 抗體檢測敏感性和特異性存在局限性［7］。目前基于病原體核酸擴(kuò)增的巢氏PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、LAMP 等技術(shù)已經(jīng)用于乙型腦炎病毒的檢測，但乙型腦炎病毒感染后患者血液中病毒載量通常比較低，病毒血癥持續(xù)時(shí)間也很短，這些方法檢測血液中病毒核酸相對困難［8］。ddPCR 是繼普通PCR 和qPCR 之后的第三代PCR技術(shù)，在反應(yīng)過程中，反應(yīng)混合液被分割成10 000～20 000 個(gè)油滴， 目標(biāo)核酸被隨機(jī)分配到獨(dú)立微滴種，每個(gè)油滴對應(yīng)1 個(gè)反應(yīng)單元，可以檢測樣本中極低含量核酸分子，研究表明ddPCR 的靈敏度可以達(dá)到1 copy/μL。 本研究針對乙型腦炎病毒NS3 基因序列設(shè)計(jì)特異引物和Taqman 探針， 建立了乙型腦炎病毒核酸qPCR 和ddPCR 檢測方法，并對這兩種方法的檢測靈敏度進(jìn)行了比較和分析。 ddPCR 檢測方法的敏感度能夠達(dá)到16.1 copies/μL，檢測靈敏度明顯優(yōu)于熒光PCR（100 copies/μL），在機(jī)體低病毒含量的情況下用于病原體檢測具有明顯優(yōu)勢。 該方法與其它主要蚊媒傳播病原體， 如黃熱病毒、寨卡病毒、登革病毒以及基孔肯亞病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)，能有效應(yīng)用于臨床樣本中乙型腦炎病毒的檢測。

本研究建立的乙型腦炎病毒ddPCR 為臨床診斷乙型腦炎提供了有力的技術(shù)儲備，同時(shí)也為病毒定量檢測提供了一種新方法。