PAX1 甲基化檢測對于非16/ 18 型高危型人乳頭瘤病毒感染人群的臨床研究

林珺，黃勉，金瓊，沈張，吳三山

福建醫(yī)科大學(xué)附屬福州市第一醫(yī)院婦科，福建福州 350009

現(xiàn)階段人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗正逐步在中國普及，且均覆蓋了HPV16/18 型，陰道鏡檢和宮頸活檢也可直接明確HPV16/18 型陽性診斷[1-3]。 但對于非16/18型高危人乳頭瘤病毒（HR-HPV）陽性人群，現(xiàn)有篩查策略存在一定程度的不統(tǒng)一性， 伴隨漏診風(fēng)險及門診量負(fù)擔(dān)重的問題[4-5]，同時長期隨訪已使患者產(chǎn)生過度擔(dān)憂罹患宮頸癌的心理[6-9]。 因此，優(yōu)化非16/18 型HRHPV 陽性人群篩查策略， 盡量減少目前篩查策略的弊端，十分必要。 近年來，宮頸癌的研究熱點逐漸包括了DNA 甲基化，且取得了很大進(jìn)展。PAX1 是PAX（paired box）配對盒基因家族之一，參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[8-10]，目前PAX1 基因甲基化在宮頸鱗狀細(xì)胞癌患者的改變已被多篇國際期刊驗證[10-11]。 該研究在福州市第一醫(yī)院2016 年6 月—2020 年6 月持續(xù)感染1 年以上的267 例非16/18 型HR-HPV 陽性人群進(jìn)行PAX1 甲基化基因檢測， 并同時進(jìn)行陰道鏡檢查與病理切片比對，截止到2020 年6 月，擬探討PAX1 甲基化基因檢測對于非16/18 型HR-HPV 陽性人群的診斷價值， 為宮頸癌篩查工作提供新思路， 以減輕福州市醫(yī)院門診量負(fù)擔(dān)。 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選取就診于該院婦產(chǎn)科267 例HR-HPV 檢測為非16/18 型 （即31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68 型）HR-HPV 陽性的女性患者，入組，按兩種策略進(jìn)行篩查，分別進(jìn)行PAX1 檢測、TCT 檢測。所有研究對象均進(jìn)行陰道鏡檢查及組織學(xué)切片。 以病理檢查結(jié)果為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。 所有女性進(jìn)行問卷調(diào)查、病情告知，并親屬知情同意書， 并通過倫理委員會審查。 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡＞21 歲的女性，有性生活史；②自愿加入該研究； ③按照標(biāo)準(zhǔn)操作取樣，HPV 檢測均為僅非16/18 型HR-HPV 陽性。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾因?qū)m頸癌及癌前病變或其他女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤而接受治療者； ②臨床標(biāo)本項目缺失者；③接種過宮頸疫苗者；④孕產(chǎn)婦及哺乳期婦女；⑤已行全子宮切除術(shù)者。

1.2 方法

PAX1 基因甲基化檢測：①根據(jù)湘雅檢驗所科學(xué)研究在啟動子近端存在數(shù)十個CpG 鄰近位點，建立PAX1引子對并完成相關(guān)測試與切片比對之最佳引子對作為此次試驗基石。 ②按照QIAamp DNA Mini Kit（250）試劑盒說明提取基因組DNA，并對基因組DNA（0.6～1 μg）進(jìn)行亞硫酸鹽修飾，中提及為20 μl，-20℃保存。③啟動子基因擴(kuò)增：PAX1 甲基化特異性的PCR （methylationspecific polymerase chain reaction，MS-PCR）取亞硫酸氫鹽修飾后DNA 1 μl 為范本， 以宮頸癌細(xì)胞株Shiha,HelaDNA 為陽性對照，水為陰性對照，PCR 反應(yīng)體系為25 μl，范本DNA 1 μl，上下游引物各1 μl，DMSO1.2μl，2×TaqPCR Master Mix 12.5 μl，最后加去離子水補齊至25 μl第一輪擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)：94℃3 min 后，94℃30 s，46～53℃50 s，72℃1 min，27 次循環(huán)，72℃延伸10 min。 第二輪擴(kuò)增參數(shù)：94℃3 min 后，94℃30 s，58～65℃50 s，72℃1 min，37 次循環(huán)，72℃延伸10 min。 檢測結(jié)果為陽性者轉(zhuǎn)診陰道鏡，陰性者隨訪。

TCT 細(xì)胞學(xué)檢測：①標(biāo)本采集：暴露宮頸，收集子宮頸上皮細(xì)胞樣本，置于裝有細(xì)胞保護(hù)液的新柏氏（Thin-Prep）細(xì)胞采集瓶中。 ②薄片制作：制片及檢測。 ③細(xì)胞學(xué)診斷： 采用2001 年國際癌癥協(xié)會 （NCI） 推薦程度TBS 分級系統(tǒng)：正常、慢性炎癥等簡易判斷為正常，病變組為無明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞的改變 （ASC-US）及以上病變，包括ASC-US、不典型腺細(xì)胞（AGC）、低度鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL）、高度鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL）、高度病變的不典型鱗狀細(xì)胞（ASC-H）。 檢測結(jié)果為陽性者轉(zhuǎn)診陰道鏡，陰性者隨訪。

陰道鏡病理學(xué)檢查：對3%醋酸和碘試驗不著色區(qū)域進(jìn)行多點活檢，并送病理檢查。 陽性結(jié)果分為宮頸上皮內(nèi)瘤樣變（CIN）及宮頸癌。

1.3 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，以病理切片當(dāng)成金標(biāo)準(zhǔn)以統(tǒng)計分析計算。 計數(shù)資料采用[n(%)]表示，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料分析

267 例非16/18 型HR-HPV 患者參與該研究，年齡20～75 歲，平均年齡（47.25±5.18）歲，267 例患者均進(jìn)行病理活檢，正?；蜓装Y結(jié)果為124 例（46.44%），CIN3 及以上53 例（19.85%），液基細(xì)胞學(xué)檢查（LBP）結(jié)果正常141 例（52.80%），ASC-US/AGC 96 例（35.96%），ASC-H為20 例（7.49%），LSIL 及以上10 例（3.75%），基本資料見表1。

表1 患者基本資料

2.2 檢測結(jié)果分析

2.2.1 兩種篩查方法的診斷效能分析以病理切片結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，CIN3 及以上病變?yōu)榉纸琰c，CIN3+為陽性，CIN3-為陰性，PAX1 檢測的靈敏度為92.50%， 特異度為43.90%， 陽性預(yù)測值為28.99%， 陰性預(yù)測值為95.92%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Kappa=0.200，P＜0.05）；TCT檢測的靈敏度為96.20%，特異度為14.00%，陽性預(yù)測值為21.70%，陰性預(yù)測值為93.75%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Kappa=0.045，P=0.040）。 兩種篩查方法比較TCT 的靈敏度高于PAX1 檢測 （96.20%＞92.50%），PAX1 檢測的特異度高于TCT 檢測（43.90%＞14.00%），PAX1 檢測與金標(biāo)準(zhǔn)的Kappa 值大于TCT 與金標(biāo)準(zhǔn)的Kappa 值，PAX1 檢測與金標(biāo)準(zhǔn)的一致性優(yōu)于TCT 與金標(biāo)準(zhǔn)，見表2。

表2 PAX1 檢測、TCT 檢測與病理檢查結(jié)果（n）

2.2.2 兩種篩查方法轉(zhuǎn)診陰道鏡檢率分析 267 例非16/18 型HR-HPV 患者以PAX1 檢測、TCT 檢測進(jìn)行分流時,TCT 檢測陽性轉(zhuǎn)診陰道鏡檢率為88.01%（235/267），PAX1 檢測陽性轉(zhuǎn)診陰道鏡檢率為63.30%（169/267），PAX1 檢測與TCT 檢測比較， 陰道鏡檢率減少24.72%。 見表3。

表3 PAX1 檢測、TCT 檢測在非16/18 型HR-HPV 人群中陽性率分布

3 討論

宮頸癌是女性常見惡性腫瘤之一， 目前國際上有多種宮頸癌篩查策略，單一篩查技術(shù)具有局限性，難免存在不足。 聯(lián)合篩查可以盡量彌補各自的優(yōu)缺點[12-14]，提高篩查的準(zhǔn)確性。 HPV 檢測及TCT 檢測是目前臨床上廣泛使用的篩查方法，HPV 陽性是宮頸癌發(fā)展的必然趨勢， 但大部分HPV 持續(xù)感染者最終并不會發(fā)展成宮頸癌，宮頸癌的發(fā)展是一個長期、復(fù)雜的過程，和基因及表觀遺傳均具有相關(guān)性[15-16]。 由于國內(nèi)女性對宮頸癌認(rèn)識不足，采用HPV 作為初篩手段后，陽性結(jié)果容易導(dǎo)致患者出現(xiàn)過度擔(dān)憂罹患宮頸癌， 而TCT 檢測由于病理醫(yī)師經(jīng)驗不同會出現(xiàn)誤差診斷。 甲基化作為表觀遺傳學(xué)方式的一種，研究顯示，腫瘤細(xì)胞存在大量異常的甲基化證據(jù)，這部分宮頸癌研究中也得到證實[17]，甲基化作用強(qiáng)大，是腫瘤研究的熱點。 基因甲基化檢測用于輔助常規(guī)方式篩查[18]，對于協(xié)助宮頸癌的診斷具有一定價值。 對于非16/18 型HR-HPV 患者的追蹤診斷是目前臨床面臨的相當(dāng)耗費時間和金錢的棘手問題，故該研究在對于高危型HPV 患者進(jìn)行分型初篩后， 利用PAX1 甲基化檢測，對其在宮頸癌篩查中的分流價值進(jìn)行分析， 可能可以對非16/18 型HR-HPV 陽性人群的追蹤診斷提供新的思路。

該研究結(jié)果顯示，PAX1 檢測的靈敏度為92.50%，特異度為43.90%，陽性預(yù)測值為28.99%，陰性預(yù)測值為95.92%，Kappa 值為0.200；TCT 檢測的靈敏度為96.20%，特異度為14.00%，陽性預(yù)測值為21.70%，陰性預(yù)測值為93.75%，Kappa 值為0.045。 兩種篩查方法比較TCT 的靈敏度稍高于PAX1 檢測，PAX1 檢測的特異度高于TCT 檢測， 且PAX1 檢測與病理檢查結(jié)果的一致性較TCT 檢測更靠近。湯福想等[19]265 例經(jīng)過宮頸癌篩查人群性PAX1 檢測，發(fā)現(xiàn)其為檢測CINII+最好的生物標(biāo)志物，PAX1 甲基化的敏感性為83.0%低于HPV 檢測的敏感性90.6%，但特異性87.3%較HPV 檢測64.7%高，兩者比較發(fā)現(xiàn)PAX1 甲基化可更準(zhǔn)確識別高級別病變；楊慧紅等[20]對比HPV 分型檢測與TCT 檢測的靈敏度分別為85.25%和76.96%，HPV 分型檢測較TCT 檢測有更好的靈敏度。 該研究結(jié)果顯示，PAX1 檢測用于非16/18 型HR-HPV 分流時，陰道鏡檢率降低。

綜上所述，PAX1 檢測可以降低非16/18 型HRHPV 患者陰道鏡檢率，避免過度醫(yī)療以減少患者的恐慌。