研究在手足口病標(biāo)本檢測(cè)中不同分子生物學(xué)方法的應(yīng)用效果

王鯤

北大醫(yī)療魯中醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東淄博 255400

手足口病多發(fā)生在5 歲以下的兒童中， 導(dǎo)致患兒發(fā)生此病的主要因素為多種腸道病毒，患兒發(fā)病后，出現(xiàn)手、足、口腔等部位的皮疹問(wèn)題，同時(shí)伴隨發(fā)熱癥狀，嚴(yán)重時(shí)患兒會(huì)出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜腦炎， 肺水腫和心肌炎等問(wèn)題，對(duì)患兒的生命健康造成嚴(yán)重威脅。 在臨床發(fā)展中，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展推進(jìn)，其已經(jīng)明確導(dǎo)致患兒發(fā)病的主要病原體為柯薩奇病毒A16 型和腸道病毒71 型，在此基礎(chǔ)上，對(duì)患兒進(jìn)行診斷，將分子生物學(xué)檢測(cè)方法進(jìn)行應(yīng)用，可實(shí)現(xiàn)對(duì)手足口病標(biāo)本的有效檢測(cè)，保證對(duì)患兒病情進(jìn)行判斷，給予患兒及時(shí)治療，避免病情加重[1]。 但是不同分子生物學(xué)的檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的檢測(cè)結(jié)果不同， 該研究方便選取該院2019 年12 月—2020年12 月期間接受檢測(cè)的150 例患者進(jìn)行研究，將3 種檢測(cè)方法進(jìn)行應(yīng)用，探究其檢出結(jié)果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

為探究不同生物學(xué)標(biāo)本在手足口病患者中的應(yīng)用效果，該研究采用對(duì)照法，方便選取150 例手足口病患兒，根據(jù)患兒病情嚴(yán)重程度將其分為3 組，分別為重死患兒組、輕癥患兒組和住院患兒組，將其命名為甲組，乙組和丙組， 均為50 例。 甲組患兒中男24 例， 女26例；年齡1～5 歲，平均年齡為（2.56±1.03）歲。 乙組患兒中男23 例，女27 例；年齡1～6 歲，平均（2.74±1.22）歲。丙組患兒中男25 例，女25 例；年齡1～5 歲，平均（2.13±1.28）歲。 3 組患兒的一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 具有可比性。

納入標(biāo)準(zhǔn)：患兒均被確診為手足口病，與相關(guān)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn)相符合； 患兒存在不同程度的發(fā)熱和手足皮疹，口腔潰瘍等癥狀；患兒伴隨一定程度的中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；患兒家屬均知情并愿意參與研究；該研究均通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：患兒具有精神病史；患兒存在其他重大疾?。换純阂缽男暂^差。

1.2 方法

應(yīng)用無(wú)菌操作方法，采集手足口病患兒標(biāo)本，主要采集發(fā)病后3～7 d 內(nèi)的患兒標(biāo)本，以糞便為主，采集重量為1～2 g，將采集到的標(biāo)本放置在密封的大便盒中進(jìn)行保存。 同時(shí)應(yīng)用專用的棉簽，對(duì)患兒的咽兩側(cè)扁桃體部位和咽喉壁進(jìn)行擦拭，保證力度適中，注意避免與喉部造成接觸， 在完成擦拭后， 可將棉簽插入到采樣管中，其采樣管型號(hào)為Hank，為3 mL，隨后將試管進(jìn)行密封。 將該研究所采集的標(biāo)本放入到冰箱中， 溫度控制在-80℃，以便于有效檢測(cè)。隨后，應(yīng)用不同檢測(cè)方法，分別為實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法，一步法RT--PCRZ 和巢式PCR法，在檢測(cè)過(guò)程中，主要應(yīng)用Promega 公司的PCR 法擴(kuò)增儀和試劑盒，應(yīng)用相關(guān)軟件排列EV71 和CA16 引物序列， 并對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行有效選擇， 實(shí)現(xiàn)對(duì)標(biāo)本的檢測(cè)。 并對(duì)其反應(yīng)條件進(jìn)行有效控制，主要控制在45℃，對(duì)其進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，時(shí)間為45 min。 在溫度為94℃時(shí)，給予其退火干預(yù)，時(shí)間為25 s，在其71℃的環(huán)境中對(duì)其進(jìn)行延伸處理，時(shí)間控制在30 s，共進(jìn)行36 個(gè)循環(huán)。最后，應(yīng)用熒光PCR 儀，型號(hào)為ABI7500，對(duì)實(shí)時(shí)RT-PCRZ法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。 對(duì)一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)， 主要將濃度為1.5%的制糖凝膠電泳進(jìn)行應(yīng)用分析， 隨后對(duì)3 組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較。

1.3 觀察指標(biāo)

對(duì)3 組檢出標(biāo)本EV71 和CA16 病原陽(yáng)性率進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間差異比較以t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及百分比（%）表示，組間差異比較以χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

甲組患者中3 種檢測(cè)方法的EV71 檢出陽(yáng)性率分別為80.00%、22.00%和80.00%， 乙組患者的EV71 檢出陽(yáng)性率分別為46.00%、8.00%和16.00%，而丙組患者的EV71 陽(yáng)性檢出率則分別為86.00%、26.00%和86.00%， 一步法RT--PCRZ 的檢出陽(yáng)性率與實(shí)時(shí)RTPCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），無(wú)論是在重死患兒，輕癥患兒還是住院患兒中，一步法RT--PCRZ 的陽(yáng)性檢出率均相對(duì)較低，與其他兩種檢測(cè)方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3 種檢測(cè)方法在手足口病陰性檢測(cè)結(jié)果中的應(yīng)用[n(%)]

3 討論

就手足口病患者來(lái)說(shuō)，其表現(xiàn)為出疹性疾病，導(dǎo)致患兒發(fā)病的病原體大多為人腸道病毒屬， 微小核糖核酸病毒科，具有20 多種類型，其中最為常見(jiàn)的是EV71和CA16 病原體[2]。 手足口病多發(fā)生在5 歲以下的兒童中，患兒發(fā)病后，出現(xiàn)手、足、口腔等部位的皮疹問(wèn)題，同時(shí)伴隨發(fā)熱癥狀， 嚴(yán)重時(shí)患者會(huì)出現(xiàn)無(wú)菌性腦膜腦炎，肺水腫和心肌炎等問(wèn)題，對(duì)患兒的生命健康造成嚴(yán)重威脅。手足口病是一種全球性傳染病，1957 年開(kāi)始出現(xiàn)， 最早由Seddon 進(jìn)行描述， 在隨后的發(fā)展中，1958年，意大利Robinson 從HFMD 患者中將CAV16 分離出來(lái)，在隨后的報(bào)道中，幾乎所有結(jié)果均顯示手足口病與CA16 相關(guān)。 發(fā)展到1974 年，美國(guó)學(xué)者則在腦炎患者中分離出EV71 腸道病毒，從此手足口病的醫(yī)學(xué)研究中加強(qiáng)了對(duì)EV71 感染問(wèn)題的重視程度，此后，EV71 感染和CA16 感染交替發(fā)生，在手足口病患者中成為了主要病原體。 在近些年的發(fā)展中，我國(guó)手足口病的患兒發(fā)病率逐漸升高，臨床病死率增加，對(duì)患兒的生命健康造成了嚴(yán)重威脅。 患兒在患病后，會(huì)受到其年齡相對(duì)較少，自身發(fā)育不完全等因素的影響，導(dǎo)致其抵抗力相對(duì)低下，在一定的程度上增加了患兒的診斷和治療難度[3]。 因此，需要檢測(cè)手足口病標(biāo)本病原體，保證及時(shí)發(fā)現(xiàn)患兒病情，從而進(jìn)行針對(duì)性治療，減少患兒不良反應(yīng)發(fā)生率[4]。從臨床目前的發(fā)展情況來(lái)看，對(duì)患兒進(jìn)行診斷的分子生物學(xué)檢測(cè)方法較多，主要包括實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法、一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 在實(shí)際使用過(guò)程中，不同方法所對(duì)應(yīng)的檢測(cè)敏感性和特異性差異較大， 需要對(duì)其展開(kāi)進(jìn)一步分析，從而明確有效的診斷方法，提高臨床診斷準(zhǔn)確性[5]。

相關(guān)研究人員在工作開(kāi)展過(guò)程中， 主要將3 種診斷方法進(jìn)行應(yīng)用， 分別為實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法、 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法， 人員對(duì)200 例手足口病進(jìn)行了標(biāo)本檢測(cè)， 結(jié)果顯示3 種檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性率分別為160 例 （80.00%）、88 例 （44.00%） 和168 例（84.00%）， 表明實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的臨床檢測(cè)敏感性更高[6]。 實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法主要是指在一定的時(shí)間內(nèi)，通過(guò)對(duì)病原體DNA 的增幅，實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體陽(yáng)性的檢測(cè)， 而一步法RT--PCRZ 則是通過(guò)進(jìn)行DNA 鏈的逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)互補(bǔ)DNA 的生成，隨后將PCR進(jìn)行應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)對(duì)新的DNA 鏈的有效復(fù)制，從而使其DNA 鏈得以有效擴(kuò)增，并展開(kāi)進(jìn)一步的分析[7]。 而巢式PCR 法， 其在實(shí)際實(shí)施過(guò)程中， 主要是先與目標(biāo)DNA模板中藍(lán)色的第一對(duì)引物進(jìn)行結(jié)合， 從而保證將目的片段進(jìn)行獲取，在此基礎(chǔ)上，將2 套引物進(jìn)行擴(kuò)增，從而經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增，在將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析時(shí)，得出病原體數(shù)據(jù)[8]。

該研究工作在實(shí)際開(kāi)展過(guò)程中， 分別為實(shí)時(shí)RTPCRZ 法， 一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法進(jìn)行了應(yīng)用， 在150 例手足口病的標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果中， 分必有50例重死患兒，50 例輕癥患兒和50 例住院患兒， 對(duì)其進(jìn)行標(biāo)本檢測(cè)， 結(jié)果顯示： 甲組患者中3 種檢測(cè)方法的EV71 檢出陽(yáng)性率分別為80.00%、22.00%和80.00%，乙組患者的檢出陽(yáng)性率分別為46.00%、8.00%和16.00%，而丙組患者的EV71 陽(yáng)性檢出率則分別為86.00%、26.00%和86.00%，一步法RT--PCRZ 的檢出陽(yáng)性率與實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率存在顯著差異，無(wú)論是在重死患兒，輕癥患兒還是住院患兒中，一步法RT--PCRZ 的陽(yáng)性檢出率均相對(duì)較低， 與其他兩種檢測(cè)方法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），與其他研究成果相一致，表示實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法和巢式PCR 法的檢出率更高，臨床應(yīng)用意義更為顯著。 與此同時(shí)，在對(duì)不同檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析時(shí)， 還可以看出EV71 達(dá)到發(fā)生在重死患兒和住院患兒中， 而CA16 則在輕癥患兒中占有較大比例[9]。

一步法RT--PCRZ 主要是指將一條DNA 鏈進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，在此過(guò)程中，促進(jìn)互補(bǔ)DNA 的生成，隨后再以新形成的DNA 鏈通過(guò)PCR 進(jìn)行復(fù)制， 從而促進(jìn)有效擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)工作目的。 實(shí)時(shí)RT--PCRZ 則是促進(jìn)基因在一段時(shí)間內(nèi)通過(guò)DNA 進(jìn)行增幅，進(jìn)而展開(kāi)進(jìn)一步的定量分析[10-11]。

臨床發(fā)展現(xiàn)狀中，還有巢式PCR 法的應(yīng)用，此技術(shù)在近些年發(fā)展起來(lái)，并在臨床中得到了廣泛應(yīng)用。 此技術(shù)在實(shí)際使用過(guò)程中，主要分為兩步實(shí)施，第一步是促進(jìn)DNA 模板藍(lán)色的第一對(duì)引物相集合，同時(shí)獲得目的片段，第二步則是將第二套引物進(jìn)行應(yīng)用，將其第一步中經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行第二次擴(kuò)張， 在其技術(shù)的實(shí)際使用過(guò)程中， 受到其第一套引物在CPR 的內(nèi)部因素影響，這一段過(guò)程并非是目的片段，在一般情況下，不會(huì)同時(shí)包含兩套引物， 在進(jìn)行第二步擴(kuò)增工作的過(guò)程中，其并不存在非目的片段的擴(kuò)增情況[12-14]。 因此，在將這一技術(shù)方法進(jìn)行應(yīng)用的過(guò)程中， 非特異性擴(kuò)增問(wèn)題的發(fā)生頻率較低， 因此問(wèn)題而導(dǎo)致的感染問(wèn)題發(fā)生率也相對(duì)較低，在一定程度上增加了其應(yīng)用特異性，是目前發(fā)展過(guò)程中，促進(jìn)質(zhì)量增加的主要方法，而且其所對(duì)應(yīng)的監(jiān)測(cè)效果較好。 因此，臨床在針對(duì)手足口病患兒進(jìn)行標(biāo)本采集時(shí)，需要根據(jù)患兒的實(shí)際情況，選擇合適的方法，保證符合臨床發(fā)展需求，為手足口病患兒的診斷提供有效依據(jù)，保證診斷有效性，從而促進(jìn)臨床治療方法的實(shí)施，提高臨床治療有效率，其對(duì)提高患兒家屬滿意度，促進(jìn)醫(yī)院發(fā)展均具有重要的積極意義[15]。

此外，在將一步法RT--PCRZ 和巢式PCR 法進(jìn)行應(yīng)用時(shí)，還需要采用電泳輔助檢查，在其實(shí)際使用過(guò)程中，很容易導(dǎo)致標(biāo)本受到污染，在具體操作時(shí)，過(guò)程較為復(fù)雜，需要較長(zhǎng)的檢測(cè)時(shí)間，對(duì)檢測(cè)效果的影響較大，容易降低檢測(cè)準(zhǔn)確率[16]。而實(shí)時(shí)RT-PCRZ 法的應(yīng)用，不僅操作過(guò)程較為簡(jiǎn)便，易于上手，而且對(duì)于污染物的控制效果相對(duì)較好，可對(duì)結(jié)果進(jìn)行直觀分析，很少會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性問(wèn)題， 在一定程度上提高了相關(guān)檢測(cè)方法的診斷有效率，因此其在臨床中的應(yīng)用范圍更為廣泛[17-18]。

綜上所述，在對(duì)手足口病患兒的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，不同檢測(cè)方法對(duì)應(yīng)的檢測(cè)效果不同， 可將實(shí)時(shí)RTPCRZ 法和巢式PCR 法進(jìn)行應(yīng)用，其效果顯著，檢出率更高，可保證對(duì)患兒病情的有效診斷，保證早診斷、早治療，減少患兒不良反應(yīng)發(fā)生率，促進(jìn)患兒生命健康，可在臨床推廣使用。