RP-HPLC定量分析茶葉中幾種主要兒茶素類有效成分*

劉少靜，譚 雄，王曉茹，張德柱，秦 蓓,

（1.西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安710021；2.成都醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，四川 成都610500；3.陜西盤龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，陜西 西安710025；4.陜西功能食品工程中心有限公司，陜西 西安710065）

茶葉是傳統(tǒng)的藥食同源天然保健飲品，茶多酚是茶葉中酚類化合物及其衍生物總稱，包括兒茶素類、黃烷醇類、花青素類、黃酮類和酚酸類等[1,2]。茶多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌消炎、降血糖、降血脂、預(yù)防肝臟及冠狀動脈粥樣硬化等廣泛藥理作用。被廣泛應(yīng)用于食品、功能性飲料、保健品及化妝品中[3,4]。兒茶素類化合物是茶多酚類物質(zhì)的主要藥理活性成分，含量占比可達(dá)60%～80%。文獻(xiàn)調(diào)研表明，兒茶素可抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡；具有預(yù)防心腦血管疾病及保肝護(hù)肝、抗菌、抗病毒等藥理作用[5,6]。

其中，沒食子兒茶素（GC）、表沒食子兒茶素（EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）、表兒茶素（EC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）5種化合物是茶葉質(zhì)量控制的關(guān)鍵成分[7,8]，目前，較多文獻(xiàn)報道了紫外分光光度法及高效液相色譜法測定茶葉中茶多酚的含量[3,9]，但較少對茶多酚中各單體有效成分進(jìn)行分析比較，因此，本研究建立了RP-HPLC定量分析5個品種茶葉中5種兒茶素類成分，為茶葉的質(zhì)量控制提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與材料

Agilent1260高效液相色譜儀（美國Agilent科技有限公司）；FA1004B型電子天平（0.1mg，上海越平科技儀器有限公司）；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對照品GC、EGC、EGCG、EC、ECG（中國藥品生物制品檢定所提供，純度≥98%）；5種茶葉均購自西安輕工茶葉批發(fā)市場，由西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院秦蓓教授鑒定；甲醇（色譜純 美國fisher公司）；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent ZORBAX ODS C18（5μm×4.6mm×250mm）；檢測波長：280nm；柱溫：30℃；流速：0.8mL·min-1；進(jìn)樣量：5μL；流動相（甲醇∶2‰磷酸水溶液）：0～7min：28∶72，7～15min：20∶80，15～35min：28∶72。

1.2.2 溶液制備

（1）對照品溶液的制備 分別精密稱取GC（5mg）、EGC（5mg）、EGCG（2.6mg）、EC（2.9mg）、ECG（3.1mg）對照品適量，加流動相溶解并定容至容量瓶中，制得對照品母液。精密吸取一定量母液，采用流動相逐級稀釋配制成系列混合對照品溶液，其中GC、EGC濃度依次為：100、200、250、300、350、400μg·mL-1；EGCG濃度依次為：104、138.67、173.33、260、390、520μg·mL-1；EC濃度依次為：116、154.67、193.33、290、435、580μg·mL-1；ECG濃度依次為：124、165.33、206.67、310、465、620μg·mL-1。4℃冷藏備用。

（2）樣品溶液的制備 茶葉揉碎，稱取5個品種茶葉各約5.0g，置于錐形瓶中，分別按照1∶30的料液比加入60%乙醇水溶液，于80℃下超聲提取50min，抽濾，濾液定容至250mL容量瓶中，過0.22μm有機(jī)微孔濾膜后進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

由于兒茶素類化合物中酚羥基的存在，其具有一定酸性，為保證良好的色譜峰型及分離度，向流動相體系（甲醇-水）中加入H3PO4并進(jìn)行梯度洗脫，在該色譜條件下，5個主成分色譜峰均獲得良好分離度。圖1為色譜圖。

圖1 色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 線性關(guān)系

按照擬定色譜條件對系列混合對照品溶液進(jìn)行HPLC檢測，以樣品濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。5種兒茶素類化合物的保留時間、回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍見表1。

表1 5種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)與線性范圍Tab.1 Regression equation,correlation coefficient and linear range of five components

由表1可見，5種化合物在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗 將混合對照品溶液在擬定色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次（進(jìn)樣量：5μL），記錄色譜峰面積，計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積的RSD，分別為0.26%、0.21%、0.36%、0.22%和0.37%，表明精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗 稱取同一供試樣品（安吉白茶）5份，各約5.0g，按照“1.2.2”項下方法平行制備5份樣品溶液，于擬定色譜條件下進(jìn)樣（進(jìn)樣量：5μL），考察5個化合物峰面積變化，計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積RSD分別為2.43%、1.87%、3.78%、1.64%和3.47%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品（安吉白茶）溶液，在擬定色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24h進(jìn)樣檢測，記錄色譜峰面積。結(jié)果GC、EGC、EGCG、EC、ECG峰面積的RSD分別為1.26%、2.03%、3.58%、1.73%和3.63%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 加樣回收率試驗 精密稱取含量已知的同一批供試品（安吉白茶）粗粉5份，各約2.5g，置于錐形瓶中，分別加入5種兒茶素對照品適量，制備供試品溶液并進(jìn)樣分析。計算GC、EGC、EGCG、EC、ECG的平均回收率（n=5）分別為：98.83%（RSD=2.81%）、98.80%（RSD=2.46%）、97.83%（RSD=2.91%）、100.41%（RSD=1.64%）、99.38%（RSD=2.54%）。

2.4 樣品測定

在擬定色譜條件下，對5個供試品溶液進(jìn)行HPLC分析檢測，記錄5個兒茶素類化合物的峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算含量。結(jié)果見表2。

表2 5種綠茶中兒茶素類化合物含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Result of content determination of 5 samples（%,n=3）

將各個樣品的HPLC譜圖與5種對照品譜圖進(jìn)行對比分析，發(fā)現(xiàn)5個不同品種茶葉中均含有GC、EGC、EGCG、EC、ECG 5種化合物，由表2可見，不同品種茶葉中含量最高的均為EGCG、其次為EC、含量最低的為ECG。不同品種茶葉之間兒茶素類含量存在一定差異。

3 結(jié)論

兒茶素類化合物是茶葉中主要藥理活性成分，不同品種茶葉中兒茶素類成分含量存在差異。本文建立了高效液相色譜法測定5種茶葉樣品中5個兒茶素類化合物含量，該方法快速、準(zhǔn)確、分離度高。這種質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的建立為茶葉品質(zhì)的保證及茶多酚類產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供了依據(jù)。