回流法與濕法超微粉碎法提取中藥延胡索的有效成分分析

蘇娟娟，尤文質(zhì)，白晨龍，邱恒宜，劉永寬

(廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361009)

延胡索為臨床常用的中藥材，其主要有效成分為延胡索乙素?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，延胡索乙素具有較好的鎮(zhèn)痛、催眠、鎮(zhèn)靜效果，治療效果已獲得臨床認可[1]。延胡索乙素主要通過現(xiàn)代工藝提取制備，常用提取方法包括回流法與濕法超微粉碎法，回流法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑對藥材成分進行提取[2]。濕法超微粉碎法則是將藥物與溶劑同時加入粉碎機，粉碎時溶劑可進入藥物組織內(nèi)部，機械振動研磨組織，使溶劑快速吸收有效成分，達到提取作用。兩種方法提取制備延胡索乙素時哪種方法提取效率更高仍存在較大爭議[3-4]。本次研究使用回流法與濕法超微粉碎法提取延胡索的有效成分，采用高效液相色譜法(HPLC)測定兩種方法提取的有效成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥材延胡索自安徽亳州市中藥飲片廠購入，經(jīng)鑒定符合2020版《中國藥典》[5]中關(guān)于延胡索的相關(guān)規(guī)定；使用美國安捷倫液相色譜儀(型號：An gilent1100)以及二極管陣列檢測器；奧豪斯儀器上海有限公司生產(chǎn)的精密電子天平(型號：AR124CN)；上海躍進醫(yī)療器械廠電熱恒溫水浴鍋(型號：hh-6)；天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的超微粉碎機(型號：FW135)；上海安亭科學儀器廠生產(chǎn)的離心機(型號：Anke T gL-16C)；粒度分析儀(型號：MICRO RACS3500)；日本日立公司掃描電鏡(型號：hitac hi S-3000N)；延胡索乙素(中國藥品生物制品檢定所，批號：150422)，水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 ①回流法：準確稱取延胡索5 g，加入70%乙醇50 ml，進行4 h回流提取，在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取適量藥液，進行濾過備用。②濕法超微粉碎法：準確稱取延胡索100 g，加入1 000 ml乙醇，乙醇濃度為70%，進行超微粉碎。在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取適量藥液，離心后取上清液備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Lic hrosp here C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，280 mm檢測波長，以1.0 ml/min流速為宜，設(shè)置30 ℃柱溫，延胡索乙素計算理論塔板數(shù)>3 000。

1.2.3 粒度與電鏡 以對照組作為參考，用水將離心藥渣重新分散，對分散后的藥材粒徑分布進行測定，可使用激光光散射法測定；藥渣干燥后，噴金鍍膜，之后使用電鏡掃描觀察。

2 結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜

兩種提取方法提取延胡索乙素時具有一致的出峰時間與峰形，提示所提取的物質(zhì)相同。見圖1。

圖1 回流法與濕法超微粉碎法HPLC指紋圖譜分析

2.2 延胡索提取率

延胡索乙素提取時，濕法超微粉碎法5 min的提取率與回流法1 h相當，2 h提取率與4 h相當。見圖2。

a：濕法超微粉碎法；b：回流法圖2 回流法與濕法超微粉碎法提取延胡索乙素的溶出量比較

2.3 濕法超微粉碎粒徑

由濕法超微粉碎法5～30 min的延胡索粒徑分布數(shù)據(jù)可知，隨著粉碎時間延長，粒徑會不斷變小，但提取率不會隨著時間延長而不斷增加，粒徑在粉碎20 min時延胡索乙素的提取率最高。見圖3。

圖3 粉碎時間與粒徑分布關(guān)系

2.4 電鏡分析

采用濕法超微粉碎法處理后，隨著粉碎時間延長，延胡索細胞破碎越徹底，5 min時細胞處于較為完整狀態(tài)，10 min細胞不完全破壁，20 min細胞基本破壁，30 min細胞破碎徹底。見圖4。

3 討論

延胡索為臨床常用的中藥材，屬于方中君藥，主治經(jīng)閉通經(jīng)、胸脅、跌撲腫痛、產(chǎn)后淤阻等，具有理氣止痛、活血散淤之效，尤以止痛見長[6]。延胡索通過現(xiàn)代工藝提取藥材中的有效成分為延胡索乙素，其效果確切，已被臨床廣泛應用，關(guān)于延胡索乙素的提取方法也備受關(guān)注[7]。既往延胡索乙素多通過滲漉法進行提取，提取率較高，不易產(chǎn)生雜質(zhì)，為常用的提取方法之一。但該方法所需時間較長，提取時間往往超過24 h，其操作繁瑣復雜，限制其推廣應用，需要尋找更加便捷的提取方法[8]。

回流法是近些年常用的延胡索乙素提取方法，具有較高的提取率。但該方法屬于化學法，易產(chǎn)生新物質(zhì)，導致純度不足，且存在操作繁瑣，需要消耗較多能量。與滲漉法相比，回流法一定程度上縮短提取時間，但仍需4 h左右的回流提取，無法滿足當今社會的快節(jié)奏要求，加之該方法回流使用的冷凝水，浪費水資源[9]。濕法超微粉碎法利用超聲波空化、機械、熱學機制使溶劑分值的運動速度及穿透力增加，能夠高效提取延胡索中的有效成分，一般5 min左右即可完成提取，應用優(yōu)勢突出。另外，濕法超微粉碎法提取過程中無須加熱，完全避光，尤其適用于熱敏性成分的提取，提取效率高，大大縮短提取時間，節(jié)能環(huán)保。本研究結(jié)果顯示，兩種提取方法提取延胡索乙素時具有一致的出峰時間與峰形，提示所提取的物質(zhì)相同。延胡索乙素提取時，濕法超微粉碎法5 min的提取率與回流法1 h相當，2 h提取率與4 h相當；隨著粉碎時間延長，粒徑會不斷變小，但提取率不會隨著時間延長而不斷升高，粒徑在粉碎20 min時提取率最高；隨著粉碎時間延長，延胡索細胞破碎越徹底，5 min時細胞處于較為完整狀態(tài)，10 min細胞不完全破壁，20 min細胞基本破壁，30 min細胞破碎徹底。表明回流法、濕法超微粉碎法均能完成延胡索中延胡索乙素的提取，但后者能夠同步完成超微粉碎與提取，所需時間更短，提取效率更高。濕法超微粉碎法提取延胡索乙素呈現(xiàn)隨時間增加提取率快速升高至高峰后持平隨后稍有下降的趨勢，粉碎5 min內(nèi)提取率驟升，與溶劑開始吸附能力強、含量少有關(guān)，隨著吸附時間延長，逐漸達到飽和，而5 min時有效成分基本溶出完全，隨著時間延長，提取率反而出現(xiàn)下降趨勢[10]。隨粉碎時間的延長粒徑變小，電鏡圖顯示粉碎5 min，延胡索粒徑在150 μm左右，隨著粉碎時間延長粒徑不斷變小細胞破碎也就越完全，30 min基本成細小碎片。粒徑太大會導致提取不完全，而太小則會降低提取率，故粉碎20 min時延胡索乙素溶出率最大，提取率最高，符合粒徑分布結(jié)構(gòu)特征。

綜上所述，回流法、濕法超微粉碎法均能完成延胡索中的有效成分延胡索乙素的提取，但濕法超微粉碎法能夠同步進行超微粉碎與提取，可縮短提取時間，且提取效率更高，值得推廣。