回流法與濕法超微粉碎法提取中藥延胡索的有效成分分析

蘇娟娟，尤文質(zhì)，白晨龍，邱恒宜，劉永寬

(廈門市中醫(yī)院，福建 廈門 361009)

延胡索為臨床常用的中藥材，其主要有效成分為延胡索乙素?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，延胡索乙素具有較好的鎮(zhèn)痛、催眠、鎮(zhèn)靜效果，治療效果已獲得臨床認(rèn)可[1]。延胡索乙素主要通過(guò)現(xiàn)代工藝提取制備，常用提取方法包括回流法與濕法超微粉碎法，回流法是用乙醇等易揮發(fā)的有機(jī)溶劑對(duì)藥材成分進(jìn)行提取[2]。濕法超微粉碎法則是將藥物與溶劑同時(shí)加入粉碎機(jī)，粉碎時(shí)溶劑可進(jìn)入藥物組織內(nèi)部，機(jī)械振動(dòng)研磨組織，使溶劑快速吸收有效成分，達(dá)到提取作用。兩種方法提取制備延胡索乙素時(shí)哪種方法提取效率更高仍存在較大爭(zhēng)議[3-4]。本次研究使用回流法與濕法超微粉碎法提取延胡索的有效成分，采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定兩種方法提取的有效成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中藥材延胡索自安徽亳州市中藥飲片廠購(gòu)入，經(jīng)鑒定符合2020版《中國(guó)藥典》[5]中關(guān)于延胡索的相關(guān)規(guī)定；使用美國(guó)安捷倫液相色譜儀(型號(hào)：An gilent1100)以及二極管陣列檢測(cè)器；奧豪斯儀器上海有限公司生產(chǎn)的精密電子天平(型號(hào)：AR124CN)；上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠電熱恒溫水浴鍋(型號(hào)：hh-6)；天津泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)的超微粉碎機(jī)(型號(hào)：FW135)；上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)的離心機(jī)(型號(hào)：Anke T gL-16C)；粒度分析儀(型號(hào)：MICRO RACS3500)；日本日立公司掃描電鏡(型號(hào)：hitac hi S-3000N)；延胡索乙素(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：150422)，水為超純水，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 提取方法 ①回流法：準(zhǔn)確稱取延胡索5 g，加入70%乙醇50 ml，進(jìn)行4 h回流提取，在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取適量藥液，進(jìn)行濾過(guò)備用。②濕法超微粉碎法：準(zhǔn)確稱取延胡索100 g，加入1 000 ml乙醇，乙醇濃度為70%，進(jìn)行超微粉碎。在30 s、1 min、2 min、3.5 min、5 min、10 min、15 min、20 min、30 min取適量藥液，離心后取上清液備用。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：Lic hrosp here C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，280 mm檢測(cè)波長(zhǎng)，以1.0 ml/min流速為宜，設(shè)置30 ℃柱溫，延胡索乙素計(jì)算理論塔板數(shù)>3 000。

1.2.3 粒度與電鏡 以對(duì)照組作為參考，用水將離心藥渣重新分散，對(duì)分散后的藥材粒徑分布進(jìn)行測(cè)定，可使用激光光散射法測(cè)定；藥渣干燥后，噴金鍍膜，之后使用電鏡掃描觀察。

2 結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜

兩種提取方法提取延胡索乙素時(shí)具有一致的出峰時(shí)間與峰形，提示所提取的物質(zhì)相同。見圖1。

圖1 回流法與濕法超微粉碎法HPLC指紋圖譜分析

2.2 延胡索提取率

延胡索乙素提取時(shí)，濕法超微粉碎法5 min的提取率與回流法1 h相當(dāng)，2 h提取率與4 h相當(dāng)。見圖2。

a：濕法超微粉碎法；b：回流法圖2 回流法與濕法超微粉碎法提取延胡索乙素的溶出量比較

2.3 濕法超微粉碎粒徑

由濕法超微粉碎法5～30 min的延胡索粒徑分布數(shù)據(jù)可知，隨著粉碎時(shí)間延長(zhǎng)，粒徑會(huì)不斷變小，但提取率不會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷增加，粒徑在粉碎20 min時(shí)延胡索乙素的提取率最高。見圖3。

圖3 粉碎時(shí)間與粒徑分布關(guān)系

2.4 電鏡分析

采用濕法超微粉碎法處理后，隨著粉碎時(shí)間延長(zhǎng)，延胡索細(xì)胞破碎越徹底，5 min時(shí)細(xì)胞處于較為完整狀態(tài)，10 min細(xì)胞不完全破壁，20 min細(xì)胞基本破壁，30 min細(xì)胞破碎徹底。見圖4。

3 討論

延胡索為臨床常用的中藥材，屬于方中君藥，主治經(jīng)閉通經(jīng)、胸脅、跌撲腫痛、產(chǎn)后淤阻等，具有理氣止痛、活血散淤之效，尤以止痛見長(zhǎng)[6]。延胡索通過(guò)現(xiàn)代工藝提取藥材中的有效成分為延胡索乙素，其效果確切，已被臨床廣泛應(yīng)用，關(guān)于延胡索乙素的提取方法也備受關(guān)注[7]。既往延胡索乙素多通過(guò)滲漉法進(jìn)行提取，提取率較高，不易產(chǎn)生雜質(zhì)，為常用的提取方法之一。但該方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，提取時(shí)間往往超過(guò)24 h，其操作繁瑣復(fù)雜，限制其推廣應(yīng)用，需要尋找更加便捷的提取方法[8]。

回流法是近些年常用的延胡索乙素提取方法，具有較高的提取率。但該方法屬于化學(xué)法，易產(chǎn)生新物質(zhì)，導(dǎo)致純度不足，且存在操作繁瑣，需要消耗較多能量。與滲漉法相比，回流法一定程度上縮短提取時(shí)間，但仍需4 h左右的回流提取，無(wú)法滿足當(dāng)今社會(huì)的快節(jié)奏要求，加之該方法回流使用的冷凝水，浪費(fèi)水資源[9]。濕法超微粉碎法利用超聲波空化、機(jī)械、熱學(xué)機(jī)制使溶劑分值的運(yùn)動(dòng)速度及穿透力增加，能夠高效提取延胡索中的有效成分，一般5 min左右即可完成提取，應(yīng)用優(yōu)勢(shì)突出。另外，濕法超微粉碎法提取過(guò)程中無(wú)須加熱，完全避光，尤其適用于熱敏性成分的提取，提取效率高，大大縮短提取時(shí)間，節(jié)能環(huán)保。本研究結(jié)果顯示，兩種提取方法提取延胡索乙素時(shí)具有一致的出峰時(shí)間與峰形，提示所提取的物質(zhì)相同。延胡索乙素提取時(shí)，濕法超微粉碎法5 min的提取率與回流法1 h相當(dāng)，2 h提取率與4 h相當(dāng)；隨著粉碎時(shí)間延長(zhǎng)，粒徑會(huì)不斷變小，但提取率不會(huì)隨著時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高，粒徑在粉碎20 min時(shí)提取率最高；隨著粉碎時(shí)間延長(zhǎng)，延胡索細(xì)胞破碎越徹底，5 min時(shí)細(xì)胞處于較為完整狀態(tài)，10 min細(xì)胞不完全破壁，20 min細(xì)胞基本破壁，30 min細(xì)胞破碎徹底。表明回流法、濕法超微粉碎法均能完成延胡索中延胡索乙素的提取，但后者能夠同步完成超微粉碎與提取，所需時(shí)間更短，提取效率更高。濕法超微粉碎法提取延胡索乙素呈現(xiàn)隨時(shí)間增加提取率快速升高至高峰后持平隨后稍有下降的趨勢(shì)，粉碎5 min內(nèi)提取率驟升，與溶劑開始吸附能力強(qiáng)、含量少有關(guān)，隨著吸附時(shí)間延長(zhǎng)，逐漸達(dá)到飽和，而5 min時(shí)有效成分基本溶出完全，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，提取率反而出現(xiàn)下降趨勢(shì)[10]。隨粉碎時(shí)間的延長(zhǎng)粒徑變小，電鏡圖顯示粉碎5 min，延胡索粒徑在150 μm左右，隨著粉碎時(shí)間延長(zhǎng)粒徑不斷變小細(xì)胞破碎也就越完全，30 min基本成細(xì)小碎片。粒徑太大會(huì)導(dǎo)致提取不完全，而太小則會(huì)降低提取率，故粉碎20 min時(shí)延胡索乙素溶出率最大，提取率最高，符合粒徑分布結(jié)構(gòu)特征。

綜上所述，回流法、濕法超微粉碎法均能完成延胡索中的有效成分延胡索乙素的提取，但濕法超微粉碎法能夠同步進(jìn)行超微粉碎與提取，可縮短提取時(shí)間，且提取效率更高，值得推廣。