髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學(xué)特性的影響①

伍耀宏，王長根

(1.贛州市人民醫(yī)院，江西 贛州 341000；2.尋烏縣人民醫(yī)院，江西 尋烏 342200)

隨著經(jīng)濟發(fā)展的狀況和人口老齡化現(xiàn)象的發(fā)生，腰腿痛的人群越來越多[1]，給患者的生活帶來了諸多不便。目前，臨床上認(rèn)為椎間盤退變是引起腰腿痛的主要原因，椎間盤退變引起腰腿痛是一個復(fù)雜的病理生理過程，是由多種致病因素(年齡、遺傳、職業(yè)、創(chuàng)傷、吸煙等)綜合作用引起椎間盤細胞數(shù)量減少和功能異常，但其發(fā)病機制尚不明確[2-3]。椎間盤是由髓核、纖維環(huán)和軟骨終板組成的，有研究表明能從這3種組織中分離出相應(yīng)的干細胞[4-5]。鑒于此，本研究旨在探討髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學(xué)特性的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年12月至2020年6月贛州市人民醫(yī)院收治的脊柱退行性變患者13位。對13位患者腰椎進行MRI檢查，根據(jù)Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)[6]將Ⅰ、Ⅱ級患者分為輕度髓核退變組；將Ⅲ、Ⅳ級患者分為中度髓核退變組；將Ⅴ級患者分為重度髓核退變組。輕度組患者5例，平均(35.3±4.7)歲；中度組患者4例，平均(34.2±4.6)歲；重度患者4例，平均(37.7±5.2)歲。3組患者臨床一般資料無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。詳見表1及圖1。

表1 Pfirrmann分級標(biāo)準(zhǔn)

1A：Pfirrmann分級Ⅰ級；1B：Pfirrmann分級Ⅱ級；1C：Pfirrmann分級Ⅲ級；1D：Pfirrmann分級Ⅳ級；1E：Pfirrmann分級Ⅴ級圖1 病例的Pfirrmann分級

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

①患有血液系統(tǒng)疾病者；②腰椎外傷者；③患有脊椎感染性疾病者；④合并腫瘤疾病者；⑤影像資料不全者。

1.3 方法

取3組患者的椎間盤軟骨終板組織，放入含有DMEM/F12培養(yǎng)基的離心管中，用PBS清洗標(biāo)本，分離軟骨終板、髓核和纖維環(huán)，將軟骨組織剪成1 mm3左右，放入0.25%胰蛋白酶在37 ℃的水浴箱10 min；0.2%Ⅱ型膠原酶和Ⅰ型膠原酶以1∶1的比列放置在37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中2 h，過濾得到CEMSCs；每2～3 d更換培養(yǎng)液，原代細胞形成單層后，加入0.25%胰蛋白酶消化，計數(shù)后按1∶3傳代。

1.4 觀察指標(biāo)

①CEMSCs細胞活力；②CEMSCs細胞復(fù)蘇能力；③CEMSCs細胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CEMSCs細胞活力

根據(jù)熒光結(jié)果顯示，輕度髓核退變組患者的CEMSCs細胞活力較好，中度組患者其次，重度組患者CEMSCs細胞活力最差。詳見圖2。

2A：輕度髓核退變組；2B：中度髓核退變組；2C：重度髓核退變組圖2 CEMSCs細胞活力免疫熒光檢測

2.2 CEMSCs細胞凋亡情況

比較3組患者CEMSCs細胞凋亡情況，由實驗結(jié)果可以得知，輕度組凋亡最少，中度組其次，重度組最多。詳見圖3。

3A：重度組；3B：中度組；3C：輕度組圖3 CEMSCs細胞凋亡分析

2.3 CEMSCs細胞生物學(xué)特征

比較3組患者CEMSCs細胞生物學(xué)特征，包括細胞活力、細胞復(fù)蘇活力和凋亡率，根據(jù)實驗數(shù)據(jù)結(jié)果可以得知，輕度組患者的細胞活力和復(fù)蘇活力均最好，中度組其次，重度組最差(P<0.05)；輕度組細胞凋亡率最低，中度組其次，重度組最高(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組CEMSCs細胞生物學(xué)特征比較

3 討論

椎間盤是人體最大的無血管組織，其退行性變會造成椎間盤突出、椎管狹窄等問題，給患者諸多方面帶來不便，雖然其機制尚不明確，但有研究表明軟骨終板退行性變與椎間盤退行性變密不可分。軟骨終板功能在椎間盤退變機制中發(fā)揮重要作用，終板途徑是椎間盤營養(yǎng)通路的主要途徑，任何對此通路的干擾作用，都可能是影響椎間盤代謝的潛在危險因素[7-8]，而軟骨終板干細胞有修復(fù)椎間盤退變的作用[9]，因此，軟骨終板結(jié)構(gòu)功能改變可能是引起椎間盤退變或者加重椎間盤退變的重要因素。本文就髓核退變程度對軟骨終板干細胞生物學(xué)特性的影響進行了研究。

臨床上早已證實椎間盤組織內(nèi)含有內(nèi)源性干細胞，CEMSCs作為軟骨終板的內(nèi)源性干細胞，與其他外源性細胞相比，能夠更好地適應(yīng)椎間盤組織的內(nèi)環(huán)境以及能夠更好地向軟骨細胞分化。軟骨終板不僅是椎間盤的主要營養(yǎng)通路，還是維持脊柱生物力學(xué)的重要結(jié)構(gòu)，其退行性變是從軟骨終板開始的，軟骨終板的變化在椎間盤病變中有著重要影響。由此猜測，CEMSCs細胞在椎間盤退化的過程中細胞的特性和生物學(xué)特征發(fā)生改變，這可能是導(dǎo)致椎間盤退變的一大重要因素。

本研究采用了新型的消化酶消化椎間盤組織來獲得CEMSCs細胞，此種方法操作簡單，耗時較短。本實驗中，原始CEMSCs細胞傳3代后，對CEMSCs細胞進行活力測定，由實驗結(jié)果可以得知，髓核退變程度較輕的CEMSCs細胞熒光活性較強，說明隨著髓核退變程度加深，CEMSCs細胞的活性降低。采用流式細胞術(shù)檢測CEMSCs細胞的凋亡率，由實驗結(jié)果可以得知，隨著髓核退變程度的加深CEMSCs的凋亡率上升，說明髓核退變程度影響著CEMSCs細胞的凋亡。亦有研究表明，椎間盤內(nèi)部存在的凋亡異常與年齡的大小、退變的程度有關(guān)[10]，與本實驗觀點一致。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)軟骨終板隨著外在壓力的增加，細胞凋亡的數(shù)量也會增加，且這種變化與MAPK信號通路有關(guān)[11]。椎間盤組織呈低氧、營養(yǎng)缺乏、高滲透壓內(nèi)環(huán)境，在這樣的條件下，CEMSCs細胞易凋亡，凋亡相關(guān)蛋白BNIP3、Bax和Bak表達上調(diào)[12]。巨噬細胞遷移抑制因子是固有免疫的調(diào)控因子，在CEMSCs退變過程中高表達，可以通過與CEMSCs細胞表面CD74作用，抑制CEMSCs細胞的遷移。我們推測巨噬細胞遷移抑制因子可能是治療軟骨終板退變的新靶點。本實驗還對CEMSCs細胞進行了凍存與復(fù)蘇，由實驗結(jié)果可以得知，輕度組患者的細胞活力和復(fù)蘇活力最好，中度組其次，重度組最差，說明髓核退變程度會影響CEMSCs細胞的活力和復(fù)蘇，且隨著髓核退變程度的加深，CEMSCs細胞的活力和復(fù)蘇活力都會有所下降。

綜上所述，髓核退變程度影響軟骨終板干細胞的活性、凋亡和復(fù)蘇，髓核退變程度越高，軟骨終板干細胞的活力越低，凋亡越多，復(fù)蘇活力越弱。