生物可降解絲素蛋白在骨科中的應(yīng)用與進展

賈明鯤 閆景龍

0 引言

創(chuàng)傷、感染、腫瘤等多種因素可造成骨缺損，嚴重的骨缺損會引發(fā)骨的延遲愈合和不愈合，如果并發(fā)感染演變成骨髓炎，則需行截肢手術(shù)，導(dǎo)致嚴重的殘疾，給患者帶來經(jīng)濟和心理上的負擔(dān)[1]。骨缺損的治療一直是骨科醫(yī)生面臨的嚴峻挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)治療骨缺損的方法是自體骨和異體骨移植，但自體骨移植來源有限、伴有取材部位的二次損傷；異體骨移植面臨著倫理問題、排斥反應(yīng)、病毒傳播等風(fēng)險[2]。組織工程是解決組織和器官缺損的一種重要手段，它通過建立由細胞和生物材料構(gòu)成的三維空間復(fù)合體并以此來填充缺損，從而達到修復(fù)的效果[3]。種子細胞、支架材料、生物活性因子是組織工程中的三要素[4]，支架材料為細胞增殖和黏附提供空間環(huán)境，引導(dǎo)細胞生長，是組織工程中的研究熱點。合成聚合物和天然聚合物是常用的兩大支架材料，絲素蛋白(silk fibroin,SF)作為一種天然聚合物，具有良好的生物相容性，易降解、機械性能優(yōu)異，SF還具有優(yōu)異的可塑性，可通過不同生產(chǎn)工藝制備成各種形式，如薄膜、水凝膠、納米纖維以及多孔海綿[5]。本文簡要介紹了SF的組成結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性以及SF在骨科中的應(yīng)用與進展。

1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)和特性

1.1 SF的組成結(jié)構(gòu)

SF是許多節(jié)肢動物“紡紗”過程分泌的產(chǎn)物，節(jié)肢動物利用絲蛋白來筑巢、結(jié)繭、筑網(wǎng)等。絲纖維主要源于柞蠶、蓖麻蠶、家桑蠶和蜘蛛[6]。從組成成分上看，蠶絲主要由絲素蛋白和絲膠蛋白組成，絲素蛋白大約占70%～80%，絲膠蛋白和少量蠟質(zhì)組成了剩下的20%～30%[7]；SF包括18種氨基酸，其中甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸含量最多，大約占87%。從基本結(jié)構(gòu)上看，SF結(jié)構(gòu)主要由結(jié)晶區(qū)和非結(jié)晶區(qū)組成，結(jié)晶區(qū)的絲素蛋白之間形成穩(wěn)固的β-折疊，是高韌性和抗拉伸能力的來源；非結(jié)晶區(qū)肽鏈之間作用力弱，排列無序且含有較多極性基團，是高延展性和高彈性的來源[8]。從分子構(gòu)象上看，SF主要包括silk I和silk II兩類，silk I由無規(guī)卷曲和α-螺旋交替堆疊而成，silk II是反向平行的β-折疊，該結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，是SF的基礎(chǔ)構(gòu)象，silk I和sikl II兩者可通過濕熱、極性溶劑、pH等條件處理進行轉(zhuǎn)變。SF分子鏈上具有羥基、羧基、胺基等活潑基團，通過化學(xué)反應(yīng)可以引入一些功能基團、單體、大分子鏈等，開發(fā)出具有不同性能的蠶絲，或通過這些基團與多種生物材料結(jié)合成復(fù)合材料，從而拓寬SF的應(yīng)用領(lǐng)域[9]。

1.2 SF的生物學(xué)和理化特性

作為一種天然聚合物，SF具有以下優(yōu)點。(1)優(yōu)異的機械強度。研究[10]發(fā)現(xiàn)SF的力學(xué)性能與其二級結(jié)構(gòu)相關(guān)，其中形成silk II β-折疊結(jié)構(gòu)的肽鏈排列規(guī)整，相鄰鏈段間的氫鍵數(shù)量多、分子間引力穩(wěn)定，構(gòu)成了SF材料高生物力學(xué)強度的基礎(chǔ)。趙亮[11]通過雙層蛛絲蛋白制備出了爆破強度達到43～150 kPa的血管支架，滿足了人工血管強度應(yīng)高于18.7 kPa的力學(xué)要求，避免了因人體收縮壓導(dǎo)致的血管爆破。(2)良好的生物相容性。Chang等[12]將SF支架植入大鼠腹壁，HE染色結(jié)果顯示，SF植入支架周圍和內(nèi)部均有細胞生長，且支架周圍結(jié)締組織生長致密，支架內(nèi)細胞沿纖維生長良好、排列整齊，SF支架未對大鼠機體產(chǎn)生毒性反應(yīng)。Zhuang等[13]將制備出的聚氨酯/SF復(fù)合膜和人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行共培養(yǎng)，通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細胞在SF復(fù)合膜上分布均勻、黏附良好、細胞結(jié)構(gòu)完整、細胞核和細胞質(zhì)清晰。(3)生物可降解性。研究[14]表明作為一種蛋白質(zhì)，絲素蛋白可在生理環(huán)境下被糜蛋白酶、羧化酶等所分解，且分解后的產(chǎn)物主要為甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸等氨基酸，能夠為生物體內(nèi)所吸收利用。Wang等[15]通過凍干法制備出了SF/海藻酸鈉多孔支架，將多孔支架植入大鼠體內(nèi)21天，通過Masson染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SF/海藻酸鈉多孔支架被周圍組織浸潤包裹，多孔支架質(zhì)量減少并失去結(jié)構(gòu)完整性，表明該SF/海藻酸鈉復(fù)合支架在動物體內(nèi)能夠發(fā)生降解。

2 SF支架在骨組織修復(fù)中的應(yīng)用

2.1 SF水凝膠支架與軟骨修復(fù)

生理環(huán)境下關(guān)節(jié)軟骨缺乏血運，僅靠關(guān)節(jié)滑液進行營養(yǎng)支持，一旦損傷很難自行修復(fù)，臨床上治療關(guān)節(jié)軟骨疾病的方法有軟骨移植、關(guān)節(jié)置換、軟骨下穿透術(shù)等，雖然這些方法在短期內(nèi)可緩解癥狀，但不能確保軟骨長期的功能恢復(fù)，通過構(gòu)建SF水凝膠支架修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨為軟骨損傷修復(fù)提供了新思路，研究[16]表明SF水凝膠能夠為軟骨細胞增殖和軟骨基質(zhì)的產(chǎn)生提供微環(huán)境，促進軟骨細胞的修復(fù)再生。Singh等[17]的研究表明，SF水凝膠能夠上調(diào)軟骨形成轉(zhuǎn)錄因子sox-9、II型膠原(collagen II,Col II)和聚蛋白多糖(aggrecan)的表達，從而引起軟骨細胞外基質(zhì)的增加，進而促進軟骨細胞的增殖。此外其組織學(xué)和免疫組化分析的結(jié)果也證實，加入SF的水凝膠和軟骨細胞共培養(yǎng)后，表達出具有更高的細胞外基質(zhì)沉積和II型膠原蛋白。Liu 等[18]將硫代殼聚糖(thiolated chitosan，CS-NAC)和SF共混制備出具有雙網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠支架，并將其與軟骨細胞共培養(yǎng)。免疫組化染色顯示與不含SF的水凝膠支架相比，CS-NAC/SF水凝膠中Col II含量高達60%以上，表明加入SF的水凝膠能夠通過維持II型膠原的含量來保留軟骨細胞的正常功能和表型。Li等[19]制備出了結(jié)合殼聚糖納米顆粒的SF水凝膠支架，并將其植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，II型膠原免疫染色結(jié)果顯示，植入SF水凝膠支架的膝關(guān)節(jié)缺損處被透明軟骨修復(fù)填充，新生細胞團中出現(xiàn)軟骨陷窩，表明該SF水凝膠支架能夠有效修復(fù)軟骨缺損。

2.2 SF復(fù)合支架與骨缺損修復(fù)

大節(jié)段骨缺損的治療一直是骨組織修復(fù)的難題，支架植入體內(nèi)后常因與周圍骨組織無法融合導(dǎo)致植入失敗，將負載生長因子、骨種子細胞的SF復(fù)合支架植入骨缺損部位，促進缺損部位骨組織的分化和增殖以此修復(fù)骨缺損，已成為組織工程修復(fù)骨缺損的一種重要策略。作為參與組織基質(zhì)礦化的重要酶，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)常由成骨細胞分泌起到成骨誘導(dǎo)效應(yīng)[20]，Burger 等[21]將SF-纖維素支架與MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)與不含SF的支架相比其ALP含量更早達到頂峰，表明SF-纖維素支架能夠加速MC3T3-E1成骨分化進程，通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)低分子量SF的加入能夠抑制Notch通路，從而上調(diào)成骨相關(guān)因子ALP的表達。Kundu等[22]將SF支架和人骨髓間充質(zhì)干細胞(human adipose tissue-derived stem cells，hASCs)共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)hASCs中骨蛋白和骨橋蛋白表達上調(diào)，并出現(xiàn)棒狀礦化結(jié)晶，通過進一步的研究發(fā)現(xiàn)SF能夠通過替代纖維I型膠原為羥基磷灰石(hydroxyapatite，HAp)提供礦化的成核位點，從而發(fā)揮成骨效應(yīng)。Yang 等[23]研究了聚乙二醇(PEG)/HAp/SF復(fù)合支架對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)成骨分化的影響，研究發(fā)現(xiàn)與純PEG、純HAp、純SF支架相比，復(fù)合支架組的成骨相關(guān)標志物骨涎蛋白(bone sialoprotein,BSP)、骨鈣蛋白(osteocalcin,OCN)、骨保護素(osteprotegerin,OPG)、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(RUNX2)的表達上調(diào)了3～4倍。Gandhimathi等[24]通過靜電紡絲法制備出了聚己內(nèi)酯/SF/SiO2納米纖維支架，研究表明SF的添加不僅能夠上調(diào)BMSC細胞OCN的表達水平，還能增加支架的孔徑使其孔隙率達到92%，有利于新生骨細胞與支架的融合從而促進骨組織修復(fù)。

2.3 3D打印支架與骨組織修復(fù)

三維生物打印技術(shù)是一種基于預(yù)編程數(shù)字藍圖的3D打印細胞裝載結(jié)構(gòu)的技術(shù)，它可以構(gòu)建帶有細胞的3D結(jié)構(gòu)，模擬具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和功能的組織和器官[25]。SF可用作生物墨水的添加劑，通過3D打印技術(shù)，可以構(gòu)建出更適合骨缺損的內(nèi)固定支架開展個體化治療[26]。Hong等[27]以SF和甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl methacylate,GMA)為原料合成了生物油墨，并通過數(shù)字光處理3D打印制備出了SF-GMA水凝膠。研究人員將其與軟骨細胞進行共培養(yǎng)，RT-PCR結(jié)果顯示Col II、X型膠原表達上調(diào)，并在第4周發(fā)現(xiàn)作為軟骨細胞外基質(zhì)重要組成成分的糖胺聚糖顯著增加，表明該SF-3D水凝膠能夠促進軟骨的再生。Li等[28]通過3D打印構(gòu)建出由聚己內(nèi)酯和SF構(gòu)成的仿生半月板支架，力學(xué)實驗表明該3D支架能夠承受80%的壓縮應(yīng)變，且抗壓強度和抗拉強度均優(yōu)于純聚己內(nèi)酯。進一步的體內(nèi)實驗表明，該3D打印支架能夠誘導(dǎo)半月板再生，并在第12周完全被新生組織所替代，而空白對照組未見半月板組織再生。Ni等[29]通過3D打印構(gòu)建出SF/羥丙基甲基纖維素雙層網(wǎng)絡(luò)水凝膠，研究人員將該水凝膠支架植入動物軟骨缺損部位，影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，軟骨缺損部位有新生軟骨形成，通過進一步細胞實驗測定軟骨細胞表達因子發(fā)現(xiàn)，軟骨相關(guān)基因表達上調(diào)，該支架促進了間充質(zhì)干細胞的增殖和軟骨分化。

3 載藥SF支架在骨科治療的應(yīng)用

3.1 載藥SF支架治療骨腫瘤

對于癌癥治療，藥物輸送系統(tǒng)正在迅速發(fā)展，以克服傳統(tǒng)化療的局限性。傳統(tǒng)的治療方法存在著體內(nèi)藥物濃度分布不均和靶向性不強、水溶性差、治療指標低等缺點，亟待解決。新型載藥支架通過將藥物包埋于納微米級的球狀顆粒中，從而控制藥物的釋放速度，確保藥物在局部持續(xù)發(fā)揮作用，降低藥物的全身毒副作用，提高藥物療效[30]，和其他天然高分子相比，SF作為藥物緩釋材料可塑性優(yōu)異、生物相容性好、來源廣泛、可被生物體降解且降解產(chǎn)物無免疫原性。SF可通過噴霧干燥、鹽析、化學(xué)交聯(lián)等工藝制備成納微米球，并在納微米球中負載抗腫瘤藥物用于骨腫瘤的治療。Subia等[31]在葉酸偶聯(lián)SF納米顆粒上負載了抗癌藥物阿霉素，制備出一種直徑小于200 nm的SF納米級葉酸靶向載藥微粒支架。實驗人員通過人成骨細胞樣細胞和乳腺癌細胞共培養(yǎng)，從而模擬出了骨-乳腺癌轉(zhuǎn)移的三維微環(huán)境，結(jié)果表明和純阿霉素、非靶向阿霉素組相比，靶向載藥支架組的血管內(nèi)皮生長因子、乳酸顯著低于另外兩組，說明靶向組抑制了腫瘤細胞的增殖能力。Pierantoni等[32]將辣根過氧化鈣負載于SF水凝膠中，通過和人成骨肉瘤細胞共培養(yǎng)，與純SF水凝膠相比，該載辣根過氧化鈣SF水凝膠支架能夠有效抑制成骨肉瘤細胞的增殖，小鼠體內(nèi)植入實驗結(jié)果表明，該含鈣SF水凝膠持續(xù)6周釋放鈣離子。

3.2 載藥SF支架預(yù)防骨感染

缺損部位的骨組織因骨膜、周圍軟組織等受到破壞而缺乏血運，對細菌、病毒等微生物的抵抗能力較天然骨組織差[33]，傳統(tǒng)骨科內(nèi)固定材料植入體內(nèi)后不僅易受到病原體侵襲發(fā)生感染，而且在遠期植入后易形成無菌性炎癥[34]，因此，研制出一種具有預(yù)防感染功能的骨科內(nèi)固定材料尤為重要。Fathi等[35]將負載萬古霉素的SF納米纖維涂層應(yīng)用于TiO2-NTs，該支架的載藥濃度達到31.5 μg/mL，萬古霉素的釋放時間長達34 d，體外抗菌實驗結(jié)果顯示，和無SF納米纖維涂層的TiO2-NTs相比，該載藥涂層支架抑菌圈直徑大，具有對金黃色葡萄球菌增殖的抑制能力，研究人員將具載藥SF納米纖維涂層的TiO2-NTs與MG63細胞共培養(yǎng)，結(jié)果表明，載藥支架表面有細胞黏附，且細胞形態(tài)正常，有絲狀偽足，而在未涂層支架上沒有細胞黏附和生長。Zhou等[36]將載銀納米粒子和慶大霉素的SF涂層在鈦植入支架表面，體外抗菌實驗結(jié)果表明，和未涂層鈦支架相比，該涂層支架能夠顯著抑制金黃色葡萄球菌的增殖，大鼠缺損模型植入實驗結(jié)果表明，涂層SF的鈦支架植入部位未出現(xiàn)局部感染的癥狀，Micro-CT結(jié)果顯示，和未涂層SF鈦支架相比，涂層SF的鈦支架植入局部有新骨形成，新骨比例達到41.8%±4.0%，該新型支架能夠有效發(fā)揮抗菌和促進骨缺損愈合的作用。

4 總結(jié)與展望

SF作為一種天然的生物材料，它可與其他生物材料結(jié)合形成復(fù)合支架，模擬自然骨環(huán)境，誘導(dǎo)成骨，同時SF作為一種可降解、可調(diào)控的蛋白，作為載體在治療骨腫瘤、預(yù)防骨感染中具有巨大的潛能。但將其應(yīng)用到臨床，還有許多問題有待解決，如需要改進制備工藝以適應(yīng)大規(guī)模生產(chǎn)SF，以SF為材料制備的微粒載體，都會有初期爆釋藥物、后期釋放不足、整個緩釋時間較短等一系列問題，對于這些問題的研究和解決會是今后的一個重點方向。隨著新型的加工技術(shù)的發(fā)展，基于SF的新支架將在未來有望得到開發(fā)，并為其在骨科的應(yīng)用開辟更多可能。