低溫脅迫及恢復對杏樹品種雌蕊生長發(fā)育的影響1)

于丹 劉肖娟 畢泉鑫 趙陽 句嬌 于海燕 王利兵

(國家林業(yè)和草原局林木培育重點實驗室(中國林業(yè)科學研究院林業(yè)研究所)，北京，100091)

杏(PrunusarmeniacaLinn.)，薔薇科(Rosaceae)杏屬(Armeniaca)，具有耐干旱、耐瘠薄、冬季耐低溫、抗鹽堿等特性，其分布范圍較廣，主要集中在華北、華東以及西北等地區(qū)，是我國北方地區(qū)重要的栽培樹種之一[1-2]。杏樹具有巨大的開發(fā)價值，杏果和杏仁中含有豐富的維生素、礦質(zhì)元素和胡蘿卜素等，具有止咳平喘、預防和治療癌癥等功效[1-3]，杏仁油富含油酸(63.39%)和亞油酸(28.79%)，不飽和脂肪酸占總脂肪酸含量的90%以上，是一種優(yōu)質(zhì)食用油[4-6]；杏木可作家具和工藝品；杏殼是制作活性炭的原料。但是，晚霜危害在西北地區(qū)普遍存在，而且由于杏樹開花時間較早，其花、芽等生殖器官極易受到晚霜的危害，嚴重影響其生長發(fā)育及產(chǎn)量，晚霜已成為限制杏樹生產(chǎn)和發(fā)展的重要環(huán)境因素[3，7]。因此，明確杏樹花期的抗寒機理、選育抗凍品種對杏樹的發(fā)展有重要意義。

杏樹花期的抗寒性與細胞膜的損傷程度、抗氧化酶活性以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等密切相關[8-10]。然而，有關杏樹雌蕊對低溫脅迫和恢復后的響應的比較研究較少，而且關于雌蕊的可承受的極限溫度以及雌蕊的解剖結構的研究也較少。文中通過對抗寒品種‘圍選1號’和冷敏感品種‘龍王帽’雌蕊的表型、解剖結構以及生理指標的觀測，探究杏樹花期對低溫脅迫及恢復過程的響應，為杏樹花期晚霜響應機理的研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自陜西省榆林市李杏優(yōu)良品種種質(zhì)資源圃。隨機采取抗寒性不同的2個杏樹品種‘圍選1號’和‘龍王帽’東、南、西、北方向的1年生枝條各30枝，混合并帶回溫室水培。試驗采用單株小區(qū)，重復3次。

1.2 低溫處理

將杏樹花枝在溫室(20 ℃)水培至盛花期，將枝條分批放入LED人工氣候箱中，試驗溫度設置為0、-2、-4、-6、-8 ℃共5個溫度。以0.5 h降溫10 ℃的速度從20 ℃降至2 ℃，再以3 ℃·h-1的降溫速度降至所需溫度并在所需溫度處維持1 h，并將枝條放在室溫下恢復3 h。隨機采取盛花期的雌蕊用于相對電導率的測定，并利用Logistic方程計算出杏樹雌蕊的低溫半致死溫度(LT50)。

1.3 測定方法

1.3.1 相對電導率的測定

稱取0.1 g新鮮雌蕊放入裝有10 mL去離子水的試管中，將試管放入真空干燥器中，反復抽氣4次，每次20 min，測定其初始電導，然后將其置入沸水中水浴30 min，冷卻至室溫后測其最終電導。計算相對電導率。相對電導率=(初始電導-去離子水電導)/(最終電導-去離子水電導)。

將杏樹雌蕊的相對電導率擬合成Logistic方程：

Y=K/(1+ae-bx)。

式中：Y為相對電導率；K為極限相對電導率；a，b均為方程參數(shù)；x為溫度。

求Logistic方程的二階導數(shù)，并令其為0，可得到方程的拐點溫度LT50。

LT50=(lna)/b。

1.3.2 雌蕊表型及褐化率的觀測

陳小華：盈利應該是正常經(jīng)營，而不是刻意做出來，而且是不是好公司不該由盈利與否來評判。58到家目前人員是第一大投入，廣告很少。58到家逐漸具備隨時盈利的能力，但是現(xiàn)在不會把盈利放在主要目標。

組織褐變是植物受到凍害最直接的形態(tài)表現(xiàn)[11-12]。低溫脅迫后，在室溫下靜置3 h后，隨機選取100個雌蕊，觀察其褐變程度并計算其褐化率，重復3次。

1.3.3 解剖結構的觀察

采用常規(guī)石蠟切片法[13]。將FAA固定液中的雌蕊依次進行一系列濃度的酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，包埋，連續(xù)切片，粘片，番紅-固綠染色，封片。切片厚度為10 μm。

1.3.4 生理指標的測定

丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性測定分別采用巴比妥酸法、過氧化氫法和愈創(chuàng)木酚法[14-15]。MDA質(zhì)量摩爾濃度，CAT和POD活性的測定所用的試劑盒均由中國北京索萊寶科技有限公司提供。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 21.00對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析以及Duncan多重比較分析。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下杏樹品種雌蕊相對電導率的變化以及LT50的確定

2個杏樹品種雌蕊相對電導率的變化如表1所示。隨著溫度的降低‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導率均呈現(xiàn)不斷升高的趨勢?！埻趺薄汀畤x1號’相對電導率的增長速率有所差異。‘龍王帽’相對電導率在0～-2、-2～-4、-4～-6、-6～-8 ℃的增長分別為1100%、117%、10%和33%，其中，在-4～-8 ℃時相對電導率有輕微升高直至趨于平緩；‘圍選1號’的相對電導率在0～-2、-2～-4、-4～-6、-6～-8 ℃的增長分別為992%、63%、52%和12%，其中，相對電導率在-6～-8 ℃趨于平緩。另外，在相同脅迫條件下，‘圍選1號’的相對電導率始終低于‘龍王帽’。

表1 低溫脅迫下杏樹相對電導率的變化

利用Logistic方程對‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導率進行擬合。由表2可知，‘龍王帽’和‘圍選1號’的擬合度R2分別為0.999和0.984，均達到顯著水平，表明擬合結果可靠、精確度高?！埻趺薄汀畤x1號’的LT50分別為-2.30 ℃和-3.44 ℃，表明相較于‘龍王帽’，‘圍選1號’雌蕊的抗寒性更強。

表2 杏樹雌蕊的Logistic方程以及低溫半致死溫度的確定

2.2 低溫脅迫和恢復處理對杏樹雌蕊表型及解剖結構的影響

在凍害下，植物組織解凍后會釋放一些酚類化合物，導致受損組織變成褐色[11]，因此，杏樹雌蕊在室溫恢復3 h后對其褐化率進行了觀測。隨溫度的降低‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐變程度加劇，褐化率也呈逐漸上升的趨勢(圖1，表3)。在-1 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊均未發(fā)生明顯的變化，表明雌蕊未受到凍害。在-2～-4 ℃時，‘龍王帽’的褐化率始終高于‘圍選1號’，其中，-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐化率急劇升高，分別是-2 ℃時的1.94倍和3.50倍。在-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的褐化率均達到100%。

圖1 低溫脅迫下杏樹雌蕊的表型變化

表3 低溫脅迫下杏樹雌蕊的褐化率

采用常規(guī)石蠟切片法，對‘龍王帽’和‘圍選1號’的雌蕊的連續(xù)切片進行觀察(圖2)。在低溫脅迫下，‘龍王帽’雌蕊在20、-1 ℃和-2 ℃均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，在-3 ℃時，‘龍王帽’雌蕊的子房壁出現(xiàn)小裂隙或空腔，-4 ℃和-6 ℃時，其子房壁和胚珠均出現(xiàn)較大裂隙和空腔；‘圍選1號’雌蕊在20、-1、-2 ℃和-3 ℃均未發(fā)現(xiàn)明顯變化，在-4 ℃和-6 ℃時子房壁和胚珠均出現(xiàn)裂隙和空腔。在恢復過程中，‘龍王帽’在-3 ℃的子房壁有小空腔，在-4 ℃和-6 ℃的子房壁、胚珠均出現(xiàn)較大裂隙；‘圍選1號’的子房壁和胚珠在-4 ℃出現(xiàn)輕微裂隙，在-6 ℃時子房壁和胚珠均出現(xiàn)較大的裂隙和空腔。另外，在-4 ℃時，低溫脅迫和恢復過程中‘圍選1號’的裂隙總是比‘龍王帽’小。

圖2 低溫脅迫和恢復處理對杏樹雌蕊解剖結構的影響

2.3 低溫脅迫和恢復處理對2個杏樹品種雌蕊生理指標的影響

2.3.1 對杏花雌蕊MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

低溫脅迫和恢復處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度變化如表4所示。‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊中的MDA質(zhì)量摩爾濃度均隨溫度的降低呈上升的趨勢，其中，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’的MDA質(zhì)量摩爾濃度與對照組(20 ℃)的差異極顯著。同一低溫脅迫下‘龍王帽’的MDA質(zhì)量摩爾濃度始終高于‘圍選1號’，而且隨著溫度的降低兩者MDA質(zhì)量摩爾濃度的差距越來越大?！埻趺薄疢DA質(zhì)量摩爾濃度在-2～-6 ℃的增長幅度較大，而‘圍選1號’MDA質(zhì)量摩爾濃度在-3～-6 ℃的增長幅度較大。

在低溫脅迫下，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’的MDA質(zhì)量摩爾濃度分別為43.77、29.42 nmol·g-1，分別是對照組(20 ℃)的2.28倍和1.43倍。在恢復處理下，-6 ℃時‘龍王帽’和‘圍選1號’MDA質(zhì)量摩爾濃度分別為38.75、26.16 nmol·g-1，分別是對照組(20 ℃)的1.90倍和1.16倍。在低溫脅迫和恢復處理下，‘龍王帽’MDA質(zhì)量摩爾濃度在-3～-6 ℃時極顯著高于‘圍選1號’。另外，相較于低溫脅迫，‘龍王帽’和‘圍選1號’恢復處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度均有所降低(表4)。

2.3.2 對杏花雌蕊抗氧化酶活性的影響

不同低溫脅迫下，杏樹雌蕊抗氧化酶活性(POD和CAT)變化如表4所示?！埻趺薄汀畤x1號’雌蕊的POD和CAT活性隨溫度的降低呈‘上升-下降’的趨勢，二者POD和CAT活性均在-3 ℃達到最大值，而且在同一溫度下‘龍王帽’的POD和CAT活性均低于‘圍選1號’的；低溫脅迫時的POD和CAT活性總是低于恢復過程中的酶活性。

POD是植物應對脅迫時的重要抗氧化酶[16]。以低溫脅迫過程為例，-1～-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的POD活性與對照組差異極顯著。其中，在-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的POD活性達到最大值，分別為491.27、606.18 U·g-1，分別是對照組的1.73倍和2.89倍；此外，在-3～-4 ℃時，‘圍選1號’的POD活性極顯著高于‘龍王帽’；在-6 ℃時，‘圍選1號’的POD活性顯著高于‘龍王帽’(表4)。

CAT對H2O2的清除有重要作用[17]。以低溫脅迫過程為例，在-1～-6 ℃，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性極顯著高于對照組。其中，-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的CAT活性分別為441.21、480.72 U·g-1，分別是對照組的2.43倍和2.27倍；此外，在-3 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性并無顯著差異，但在-4～-6 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’的CAT活性差異極顯著(表4)。

表4 低溫脅迫和恢復過程中杏樹雌蕊生理指標變化

品種處理POD活性/U·g-120℃-1℃-2℃-3℃-4℃-6℃‘圍選1號’低溫(156.00±31.00)K(307.64±48.70)GHIJ(483.08±48.78)CD(606.18±25.48)AB(554.17±28.44)BC(346.73±32.14)FGHI恢復(156.00±31.00)K(376.01±47.64)EFGH(532.21±35.42)BC(684.01±33.15)A(612.09±38.11)AB(382.11±46.14)EFG‘龍王帽’低溫(179.86±17.56)K(239.94±15.84)J(424.55±27.60)DEF(491.27±47.77)CD(391.17±18.07)EFG(273.91±38.38)IJ恢復(179.86±17.56)K(293.97±26.21)HIJ(506.07±38.03)CD(545.00±32.25)BC(442.18±35.46)DE(309.17±39.95)GHIJ

品種處理CAT活性/U·g-120℃-1℃-2℃-3℃-4℃-6℃‘圍選1號’低溫(147.10±14.14)MN(240.34±30.03)KL(370.67±44.67)EFGH(480.72±46.10)ABC(451.92±30.17)BCD (290.93±33.61)IJK恢復(147.10±14.14)MN(285.20±27.42)IJK(432.18±33.11)CDEF(551.68±40.26)A(511.71±25.82)AB(322.58±22.01)HIJ‘龍王帽’低溫(128.50±28.07)N(205.31±32.23)LM(359.75±38.22)FGHI(441.21±35.22)BCDE(345.73±24.10)GHI(204.54±31.78)LM恢復(128.50±28.07)N(250.34±29.30)JKL(418.13±24.48)CDEFG(491.01±28.23)ABC(391.87±30.75)DEFGH(233.50±38.01)KL

3 結論與討論

本試驗以2個抗寒性不同的杏樹品種‘龍王帽’和‘圍選1號’的雌蕊[7，18]為試驗材料，利用LED人工氣候箱模擬自然降溫過程，重點對低溫脅迫和恢復處理過程中杏花雌蕊的表型、解剖結構和生理指標進行了觀測。研究發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的降低，‘龍王帽’和‘圍選1號’的褐變程度加劇且褐化率增加，但-2～-4 ℃時，‘圍選1號’的褐化率始終低于‘龍王帽’。該結果與王萍等[7]的研究結果一致。在-6 ℃時，‘圍選1號’和‘龍王帽’雌蕊的褐化率均達到100%，表明此時2個杏樹品種的雌蕊均受到嚴重的凍害。

凍害會引起細胞間隙的水結冰，導致原生質(zhì)脫水，破壞蛋白質(zhì)結構；隨后，原生質(zhì)體結構也會因凍害而結冰，造成不可逆損傷[3]。本研究中，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊因凍害產(chǎn)生了一些空腔或裂隙，推測這些空腔或裂隙可能是因細胞失水或死亡導致的；另外，‘龍王帽’在-3 ℃發(fā)現(xiàn)裂隙，而‘圍選1號’在-4 ℃發(fā)現(xiàn)裂隙，相對于‘圍選1號’，‘龍王帽’裂隙出現(xiàn)的溫度較高，且裂隙較多或較大，這表明相同條件下‘龍王帽’的雌蕊細胞被凍害破壞較嚴重。彭偉秀等[19]在研究低溫脅迫對杏樹子房結構的影響中發(fā)現(xiàn)，在-3 ℃時，‘優(yōu)一’和‘一窩蜂’的子房均出現(xiàn)一些裂隙或空腔，這與本研究結果相似。

當植物受到凍害時，細胞膜透性變大，導致電解質(zhì)外滲，而且植物的相對電導率與植物的抗寒性呈負相關[20-21]。隨著溫度的降低，‘龍王帽’和‘圍選1號’的相對電導率均不斷升高，這表明細胞膜的損傷程度隨溫度的降低而加劇。‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的相對電導率分別在-2 ℃時增長速率最大，分別是對照組(20 ℃)的11.00倍和9.92倍，說明‘龍王帽’和‘圍選1號’的膜系統(tǒng)分別在0～-2 ℃受到嚴重的低溫傷害，但‘圍選1號’細胞膜透性受到的傷害較小。-4～-8 ℃時，‘龍王帽’和‘圍選1號’增長速率逐漸降低，表明杏樹雌蕊細胞膜透性逐漸變大，電解質(zhì)外滲嚴重?！埻趺薄汀畤x1號’雌蕊分別在-4～-8 ℃和-6～-8 ℃時相對電導率變化趨于平緩且均為82%以上，表明此時‘龍王帽’和‘圍選1號’的細胞膜透性基本已被完全破壞，細胞死亡。LT50可反映植物可承受的極限低溫，LT50越低其抗寒性越強[22]?！畤x1號’的LT50低于‘龍王帽’，表明‘圍選1號’可承受的極限溫度較低，抗寒性更強。低溫脅迫下，植物體內(nèi)會產(chǎn)生大量的活性氧和自由基，導致膜脂過氧化并積累大量MDA，所以MDA質(zhì)量摩爾濃度反映了細胞膜損傷的程度[23-25]。本研究中，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的MDA質(zhì)量摩爾濃度呈逐漸上升的趨勢，-6 ℃時，MDA質(zhì)量摩爾濃度極顯著高于對照組(20 ℃)?！埻趺薄迫锏腗DA質(zhì)量摩爾濃度始終高于‘圍選1號’，表明‘圍選1號’細胞膜損傷的程度較??；‘龍王帽’和‘圍選1號’在恢復處理過程中的MDA質(zhì)量摩爾濃度相較于低溫脅迫過程中均有所降低，這表明恢復室溫后其膜系統(tǒng)的損傷也有所緩解。

POD和CAT是植物體內(nèi)清除活性氧和自由基的重要抗氧化酶[26-28]。隨著脅迫的加劇，‘龍王帽’和‘圍選1號’雌蕊的POD和CAT活性呈‘上升-下降’的趨勢。這與孟慶瑞等[29]的研究一致。其在-3 ℃達到最大值，這表明‘龍王帽’和‘圍選1號’的抗氧化能力在-3 ℃時最強；在-3 ℃之后，二者的酶活性均有不同程度的降低。相較于低溫脅迫，恢復處理時POD和CAT活性總是較高，這表明在溫度恢復后，植物會產(chǎn)生更多的抗氧化酶盡快清除體內(nèi)的自由基和活性氧；而在-6 ℃時，低溫脅迫和恢復處理中的酶活性相差較小，這表明杏樹雌蕊的抗氧化酶系統(tǒng)已遭受到嚴重的破壞。此外，同一溫度下‘龍王帽’的POD和CAT活性均低于‘圍選1號’，表明‘圍選1號’具有較強的抗氧化能力。總之，相較于‘龍王帽’，‘圍選1號’具有較強的抗氧化能力且恢復能力較強，這為解析杏樹雌蕊的霜凍響應機理提供一定的基礎。