動物細(xì)胞在疾病治療和診斷中的應(yīng)用

李曉奇，王鳳武，韓健健

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010021；2.通遼市動物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

動物細(xì)胞擁有大量的傳感和調(diào)節(jié)蛋白，用于維持細(xì)胞內(nèi)部狀態(tài)的穩(wěn)定。其中，跨膜受體蛋白持續(xù)監(jiān)測細(xì)胞外環(huán)境，將特定的細(xì)胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)為細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)。配體蛋白與其同源受體的結(jié)合觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄變化。研究人員一直在利用動物細(xì)胞的傳感蛋白及其生物合成能力構(gòu)建回路，用于基于細(xì)胞的診斷和治療方式上。動物細(xì)胞常用作回路改造的載體，以創(chuàng)建能夠直接與人類疾病信號相關(guān)的細(xì)胞模型。

大多數(shù)可編輯的調(diào)控回路均源于轉(zhuǎn)錄因子 (TFs)調(diào)節(jié)的網(wǎng)絡(luò)。早期動物細(xì)胞回路主要由來自細(xì)菌或酵母（例如TetR或GAL4）的TFs與轉(zhuǎn)錄激活或抑制域（例如VP16或KRAB）融合而成。然而，近年來內(nèi)源性TFs，如活化 T細(xì)胞的核因子(NFAT)、cAMP反應(yīng)元件結(jié)合(CREB)、活化B細(xì)胞的核因子kappa-輕鏈增強子(NF-kB)以及信號激活劑轉(zhuǎn)錄(STAT)由上游天然或嵌合受體及其信號級聯(lián)激活，已被廣泛用于調(diào)控回路的條件表達(dá)。此外，可編程DNA結(jié)合域成為技術(shù)發(fā)展的重點領(lǐng)域，例如成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(Crispr)/Cas系統(tǒng)[1]。這些都極大地促進(jìn)了針對內(nèi)源性基因調(diào)控的編輯回路的研究。

1 動物細(xì)胞可溶性分子的傳感響應(yīng)回路的研究進(jìn)展

構(gòu)建感知和響應(yīng)病理水平可溶性回路的最簡單的方法是使天然配體與受體相互作用并重新連接相應(yīng)的信號級聯(lián)以執(zhí)行特定的響應(yīng)。例如，分別過表達(dá)組胺HRH2受體或膽汁酸TGR5受體已被用于改造動物細(xì)胞以感知與過敏相關(guān)的組胺水平或與肝功能受損相關(guān)的高水平膽汁酸[2,3]。這兩種過表達(dá)受體都使用cAMP信號通路，該通路被重新連接以激活所需的轉(zhuǎn)錄輸出。此外，離子通道也被探索作為介質(zhì)為細(xì)胞提供新的感覺功能。例如，過度表達(dá)電壓門控鈣通道的HEK細(xì)胞可以觸發(fā)天然鈣信號和NFAT轉(zhuǎn)錄因子的激活，以響應(yīng)高葡萄糖水平；使用NFAT響應(yīng)啟動子，可以獲得高血糖誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達(dá)[4]。

另一類編輯傳感器和響應(yīng)回路依賴于蛋白酶的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)模塊。所謂的Tango受體系由天然受體組成，這些受體通過含有蛋白酶切割位點的柔性接頭在細(xì)胞內(nèi)與合成TF（例如tTA）融合[5]。配體與其受體的結(jié)合會募集一種與目標(biāo)蛋白酶融合的信號蛋白，該蛋白可從膜上切割并釋放 TF，使其進(jìn)入細(xì)胞核并激活目的基因的表達(dá)。對不同的G蛋白偶聯(lián)受體 （GPCR）、受體酪氨酸激酶 (RTK)和類固醇激素受體，已使用Tango方法激活轉(zhuǎn)基因表達(dá)[5]。

任何已知的天然受體都無法精準(zhǔn)識別眾多可作為診斷或治療目的的有價值的分子。為了拓展編輯細(xì)胞可以感知的分子庫，合成受體已在細(xì)胞外與選自噬菌體展示文庫的抗體單鏈可變片段(scFvs)融合，以靶向基于小分子或基于蛋白質(zhì)的抗原。這種方法已在模塊化細(xì)胞外傳感器架構(gòu)(MESA)載體中采用，該載體使用針對血管表皮生長因子的 scFv[6,7]。作為Tango樣受體，MESA受體基于將TF隔離在質(zhì)膜上的前提下，在被可溶性配體激活后，蛋白水解釋放。但是，與Tango受體不同，MESA受體依賴于配體誘導(dǎo)的受體鏈二聚化：一條鏈通過蛋白酶切割位點與 TF融合，另一條鏈與適當(dāng)?shù)牡鞍酌溉诤?。有研究證明了MESA受體可以通過使用與轉(zhuǎn)錄激活域融合的催化死亡Cas9蛋白(dCas9)來調(diào)節(jié)內(nèi)源基因表達(dá)(dCas9-TF)。配體結(jié)合觸發(fā)dCas9-TF的釋放，然后與靶向IL2基因座的單導(dǎo)RNA(sgRNA)結(jié)合以驅(qū)動細(xì)胞因子的表達(dá)[8]。然而，MESA方法有顯著的缺點：到目前為止，MESA系統(tǒng)在沒有配體的情況下顯示出明顯的活性，并可在配體結(jié)合后對基因表達(dá)進(jìn)行適度的折疊誘導(dǎo)，從而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性的診斷結(jié)果。

最近，將Tango架構(gòu)與dCas9轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合的工作在被優(yōu)化后得到了更好的性能?；漳崴沟热嗽O(shè)計將dCas9嵌合受體用于8種天然或進(jìn)化的GPCR，可感應(yīng)多種配體，包括合成小分子、激素、有絲分裂原、趨化因子和脂肪酸。將蛋白酶與GPCR的C端融合，將dCas9-TF與受體激活后募集的信號分子融合的策略優(yōu)于原始的Tango架構(gòu)（TF與受體融合，蛋白酶與募集的蛋白質(zhì)融合）。此外，優(yōu)化了將蛋白酶與受體融合的接頭的長度和組成，以實現(xiàn)更好的開關(guān)活性。Baeumler等人[9]開發(fā)了一個類似的系統(tǒng)，系基于拆分dCas9的策略。為了在關(guān)閉狀態(tài)下實現(xiàn)較低的基礎(chǔ)表達(dá)和激活劑處理后的較高誘導(dǎo)，他們篩選了控制受體dCas9分裂部分融合表達(dá)的啟動子，并在受體和蛋白酶切割位點之間添加了該輸出信號。

基于Tango和基于MESA的方法沒有利用進(jìn)化的天然信號級聯(lián)實現(xiàn)信號放大，這可能限制了它們的效率（每個激活受體僅釋放一個TF）。此外，它們的性能高度依賴正確選擇啟動子以調(diào)節(jié)不同組分之間的比例。最近報道的廣義細(xì)胞外分子傳感器(GEMS)避免了這些問題[10]。GEMS架構(gòu)是基于促紅細(xì)胞生成素受體與不同的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合，以感知和響應(yīng)廣泛的細(xì)胞外可溶性分子。重要的是，GEMS受體的細(xì)胞質(zhì)域由特定的信號域組成，用于激活四個可能的內(nèi)源性信號通路（JAK/STAT、ERK/MAPK、磷脂酶C和PI3K/AKT）來同時驅(qū)動目的基因的轉(zhuǎn)錄程序。GEMS面臨著涵蓋大范圍的非信號分子的挑戰(zhàn)，包括癌癥生物標(biāo)志物前列腺特異性抗原(PSA)，并在配體介導(dǎo)的受體二聚化時實現(xiàn)基因表達(dá)的高倍數(shù)誘導(dǎo)率。重要的是，PSA傳感GEMS能夠?qū)Ρ辉\斷為前列腺癌的患者的血清樣本進(jìn)行分類。由于GEMS可以輕松適應(yīng)新的可溶性抗原，因此有望成為開發(fā)基于細(xì)胞的多種疾病的診斷或治療的有效工具。

2 動物細(xì)胞表面結(jié)合分子的傳感響應(yīng)回路的研究進(jìn)展

感知和響應(yīng)結(jié)合到其他細(xì)胞表面的分子的合成受體最著名的例子是所謂的嵌合抗原受體(CAR)。它們是臨床上最先進(jìn)的工程T細(xì)胞，是細(xì)胞融合支持新療法的一個例子[11]。CARs包含細(xì)胞外抗體衍生的scFv或納米抗體，針對腫瘤相關(guān)抗原和T細(xì)胞受體復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)域。表達(dá)CAR的T細(xì)胞能夠檢測并攻擊帶有靶抗原的癌細(xì)胞。

盡管在細(xì)胞因子釋放增加和對非癌細(xì)胞的攻擊方面仍然存在安全問題，但是，以B細(xì)胞特異性抗原CD19為靶點的CAR的臨床結(jié)果顯示出治療淋巴瘤的顯著療效[12]。為了更嚴(yán)格地控制這種療法，已經(jīng)提出了幾種編輯策略[13,14]，包括與另一類受體的組合，這些受體依賴于Notch受體 (synNotch)的蛋白水解核心[15]。SynNotch受體由細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成，能夠?qū)斎牒洼敵鲞M(jìn)行編程。與天然Notch信號傳導(dǎo)一樣，SynNotch受體通過與鄰近細(xì)胞中表面結(jié)合的抗原結(jié)合而被激活，觸發(fā)合成TFs的蛋白水解釋放，然后可以調(diào)節(jié)目標(biāo)基因的表達(dá)。這些嵌合受體被設(shè)計用來感知來自免疫抑制性腫瘤微環(huán)境的抗原，并通過表達(dá)免疫刺激分子來做出反應(yīng)。重要的是，SynNotch和CAR受體可通過結(jié)合來限制T細(xì)胞的激活，因此它僅在攜帶兩種靶抗原的腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)時被激活。

作為靶向細(xì)胞結(jié)合抗原分子的一種方法，HEK細(xì)胞最近被設(shè)計成細(xì)胞間接觸信號通路，能夠識別癌細(xì)胞并在與靶細(xì)胞結(jié)合后釋放殺傷酶[16]。JAK-STAT信號由IL4和IL13受體部分的異二聚化介導(dǎo)，被用作載體來構(gòu)建合成的細(xì)胞特異性接觸傳感裝置。IL4和IL13受體的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域可與針對乳腺癌標(biāo)志物人表皮生長因子受體2(HER2)的scFv融合。此外，磷酸酶CD45胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域被用作JAK-STAT信號傳導(dǎo)的有效阻斷劑。殺傷細(xì)胞與靶細(xì)胞的結(jié)合消除了這種抑制，其通過STAT6誘導(dǎo)信號傳導(dǎo)，并從合成的STAT6響應(yīng)啟動子中表達(dá)所選基因。為了進(jìn)行概念驗證，使用與細(xì)胞穿透肽融合的前體切割酶開展轉(zhuǎn)錄輸出。回路轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEK殺傷細(xì)胞可以區(qū)分表達(dá)HER2的HEK細(xì)胞并提供殺傷程序。重要的是，該殺死模塊可移植到臨床使用的人類間充質(zhì)干細(xì)胞中，這可以殺死攜帶HER2的SKBR3乳腺癌細(xì)胞。

綜上所述，這里描述的編輯受體庫允許細(xì)胞進(jìn)行高度復(fù)雜的編程，以響應(yīng)人體內(nèi)的多種生化信號，并根據(jù)相鄰細(xì)胞和環(huán)境做出決定。

3 動物細(xì)胞作為診斷工具的研究進(jìn)展

關(guān)于使用編輯細(xì)胞進(jìn)行診斷的研究，無論是通過將細(xì)胞暴露于人類臨床樣本進(jìn)行體外診斷，還是通過將細(xì)胞植入體內(nèi)進(jìn)行體內(nèi)診斷，設(shè)計的回路必須包含具有易于測量的輸出的報告模塊。

為了彌補目前過敏診斷方法的缺陷，包括重現(xiàn)性差和與臨床癥狀的相關(guān)性差等，研究人員基于組胺傳感裝置開發(fā)了一種受體外診斷方法[2]。組胺通過結(jié)合和激活組胺GPCR(HRH1-4)來介導(dǎo)過敏癥狀。HEK細(xì)胞被設(shè)計用于其中一種受體(HRH2)的異位表達(dá)，并且相應(yīng)的cAMP信號通路被重新連接以通過合成的cAMP響應(yīng)啟動子驅(qū)動報告基因表達(dá)。將人類全血樣本暴露于過敏原會觸發(fā)免疫效應(yīng)細(xì)胞（如嗜堿性粒細(xì)胞）釋放組胺，從而在體外模擬患者體內(nèi)特定的過敏反應(yīng)。當(dāng)編輯細(xì)胞暴露于用不同濃度過敏原處理的人體血液樣本時，他們可以根據(jù)暴露水平對樣品進(jìn)行檢測。

相關(guān)研究也在體內(nèi)診斷方面取得了長足的進(jìn)步，可以加快實現(xiàn)對病理狀況的近實時監(jiān)測。有研究人員創(chuàng)建了一種新的體內(nèi)診斷策略，該策略借由植入的工程細(xì)胞來實現(xiàn)，當(dāng)檢測到血液中疾病生物標(biāo)志物水平的變化時，這些細(xì)胞會產(chǎn)生皮膚紋身[17]。編輯細(xì)胞可持續(xù)監(jiān)測血鈣并產(chǎn)生黑色素以響應(yīng)持續(xù)的輕度高鈣血癥，并在移植了這些細(xì)胞的患者的皮膚上產(chǎn)生可見的黑色標(biāo)記。這種診斷性紋身的設(shè)計是通過將異位表達(dá)的鈣受體CaSR的信號級聯(lián)重新連接到嵌合啟動子，從而觸發(fā)酪氨酸酶的Ca2+響應(yīng)性表達(dá)，最終產(chǎn)生黑色皮膚色素黑色素。作為概念驗證，生物醫(yī)學(xué)紋身系通過對接種乳腺癌或結(jié)腸癌細(xì)胞的小鼠的持續(xù)性的與癌癥相關(guān)的高鈣血癥反應(yīng)，有效地診斷出小鼠的無癥狀結(jié)腸癌和乳腺癌。在一個更接近人的模型中，微囊化紋身工程細(xì)胞被放置在豬的皮膚下，并在血鈣水平升高的動物皮膚中形成基于黑色素的黑色紋身。在具有已知風(fēng)險因素的患者體內(nèi)植入這種用于檢測前早期癌癥的診斷工具可以增加治療的選擇性和存活率。

雖然過敏診斷方法系基于感知組胺，但I(xiàn)L-4和IL-13細(xì)胞因子也可用作信號輸入，以開發(fā)過敏細(xì)胞療法[18]。當(dāng)免疫系統(tǒng)暴露于特定的過敏原時，Th2細(xì)胞會釋放大量的細(xì)胞因子。此外，中和過敏患者血液中的IgE抗體已被證明可以減輕癥狀。因此，設(shè)計了一種合成裝置來檢測IL-4或IL-13的存在，并觸發(fā)能夠結(jié)合并滅活I(lǐng)gE抗體的設(shè)計錨蛋白重復(fù)蛋白（DARPinE279）的產(chǎn)生。

4 結(jié)論與展望

編輯動物細(xì)胞具有從根本上改變診斷、預(yù)防和治療方法的潛力。正如我們上面所討論的，已經(jīng)提出了幾種策略來提高工程化T細(xì)胞的功效和安全性。此外，最近克服了僅針對腫瘤細(xì)胞表面結(jié)合抗原的嚴(yán)格限制，從而可以將CART細(xì)胞療法擴展到可溶性抗原，在結(jié)合后誘導(dǎo)受體二聚化。

與此同時，隨著基因編輯研究手段的多樣化，將為應(yīng)對隨著臨床實驗增加而不可避免地出現(xiàn)的新挑戰(zhàn)提供空間。例如，截至今天仍然缺乏具有快速響應(yīng)特性的合成回路，故難以使患有糖尿病等疾病的患者受益。為了實現(xiàn)幾分鐘的響應(yīng)時間這一目標(biāo)，其回路必須繞過基于轉(zhuǎn)錄的緩慢響應(yīng)，而依賴于轉(zhuǎn)錄后事件。