Shh／Bmp4 信號通路在先天性肛門直腸畸形末端腸壁神經(jīng)系統(tǒng)中的作用

周 瑩 綜述 楊少波 黃焱磊 審校

肛門直腸畸形（anorectal malformation，ARM）是小兒外科常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率約為1／5 000。 近年來隨著對術中肛門直腸周圍肌群認識的提高以及術后個體化腸道管理的實施，術后肛門失禁的發(fā)生率和排便情況得到了改善，但仍有1／3的ARM 患者術后存在著不同程度的排便功能障礙如污糞、便秘等，嚴重影響患者術后生活質(zhì)量［1－3］。目前ARM 的胚胎發(fā)育機制及術后排便障礙機制尚不明確，相關研究更多傾向于ARM 的遺傳學因素［1］。 已有研究證實直腸末端腸壁神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）的發(fā)育與術后良好的排便功能密切相關，動物模型實驗和相關臨床研究均提示ENS 受Shh／Bmp4信號通路調(diào)節(jié)［3－5］。 本文就Shh／Bmp4信號通路在ARM 形成中的作用綜述如下。

一、Shh／Bmp4 信號通路的結(jié)構

Hedgehog基因最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，有三種同源基因， 即Sonic hedgehog（Shh）、Indian hedgehog（Ihh）、Desert hedgehog（Dhh），其中Shh與人類生長發(fā)育關系最為密切。 人類基因組群中Shh（Sonic hedgehog）定位在7p 36.3 處，編碼一種分泌性的信號蛋白即Shh蛋白，是一種與生長發(fā)育密切相關的信號轉(zhuǎn)導因子和形態(tài)發(fā)生因子，主要表達于內(nèi)胚層的上皮層，調(diào)控基底層細胞間質(zhì)的增生以及特異分化，在胚胎發(fā)育方面有重要作用。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是分布在大多數(shù)組織中的特異性生長因子，結(jié)構相對保守，參與調(diào)控組織的分化與發(fā)育。 1965 年，Urist 等［6］研究出脫鈣的骨基質(zhì)提取物具有促進間充質(zhì)細胞定向分化為骨細胞的作用，并將此提取物命名為骨形成蛋白，目前已確認的Bmp 家族成員多達40 多個，早期研究發(fā)現(xiàn)除Bmp-1 之外，均屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β 超家族的發(fā)育信號分子。 Bmp 家族不同成員之間扮演著不同角色，其中Bmp4主要參與調(diào)控胚胎中軸系統(tǒng)的發(fā)育［6］。Bmp4由408 個氨基酸組成，定位在14q22-q23，分子學提示Bmp4同屬于TGF-β 超家族（轉(zhuǎn)化生長因子），為Dpp（果蠅生長因子）同源基因。 Roberts 等［7］發(fā)現(xiàn)Bmp4多表達于腸道系統(tǒng)的中胚層，而在整個食管－直腸消化系統(tǒng)中、胃中未監(jiān)測出相關基因的表達，與之相反Akiko 等［8］認為不僅在小腸，在胃中Shh也誘導著Bmp4基因的表達，由此提示Bmp4在消化道胚胎發(fā)育初期以及在中軸系統(tǒng)形成末期均有參與，但在發(fā)育中期某個階段可能會有胃Bmp4表達的缺失［8］。故Bmp4在中軸系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中扮演Shh信號通路的下游靶點基因的角色，受Shh信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)，共同參與腸道系統(tǒng)的增殖與分化。

Shh信號通路由Shh、2 個跨膜蛋白受體Patched（Ptc）及Smoothened（Smo）組成的受體復合物、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）以及下游轉(zhuǎn)錄因子（GLI 家族）組成，最終將信號傳遞給下游靶點基因（Ptc，Wnt，Bmp4）［9，10］。Shh／Bmp4基因通路作為一高度保守信號通路在中軸系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

二、Shh／Bmp4 信號通路的效用方式

Shh／Bmp4信號通路參與腸道發(fā)育的方式多種多樣，例如引導上皮細胞增殖，誘導間質(zhì)細胞分化以及參與腸軸發(fā)育過程中的區(qū)域化。 不同的過程中，Shh／Bmp4信號有著它保守經(jīng)典的共用效用途徑：Shh分泌蛋白啟動，在靶細胞中引發(fā)一系列反應，最終與GLI 家族轉(zhuǎn)錄因子共同作用于調(diào)控靶基因（諸如Ptc，Wnt，Bmp）產(chǎn)生活化或抑制效用。 正常情況下轉(zhuǎn)錄基因GLI 家族將信號傳遞給三個靶基因（Ptc，Wnt，Bmp），Ptc 能抑制Smo 蛋白活性，從而抑制下游通路成分（大致為Gli2，Gli3，Bmp4等）表達，同時Gli 蛋白在蛋白酶體內(nèi)被截斷來抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此整個信號通路過程中啟動蛋白的異常、轉(zhuǎn)錄基因的調(diào)控以及下游靶點基因的非正常表達均會影響信號的傳遞， 產(chǎn)生不同的病變［9－12］。

Bmp4作為下游的靶點基因不僅促進了脊椎動物中胚層向內(nèi)臟平滑肌的發(fā)育，同時與其受體在腸道中胚層、內(nèi)胚層及ENS 中均表達強烈［6］。 早期研究表明胃平滑肌層相對于其他消化道較厚，Bmp4表達少，即Bmp4在某種程度上限制了胃中胚層的發(fā)育［7，10－13］；Bmp4在骶尾骨處能檢測到Shh的最初期表達（甚至早于直腸腹膜反折的發(fā)生），表明在胚胎發(fā)育的不同時期，Shh對于Bmp4的調(diào)節(jié)不同［14］。另有實驗研究檢測蝌蚪發(fā)育過程中不同階段Shh／Bmp4的表達，結(jié)果提示Shh對Bmp4的調(diào)節(jié)不是單一的，需要甲狀腺激素的共同作用［13］。 MiRNA 是調(diào)節(jié)細胞分化的經(jīng)典信號分子，其中miRNA-145 更能促進血管及平滑肌細胞的分化發(fā)育，參與影響中胚層腸道發(fā)育。 國外一項檢測miRNA-145 對于Shh／Bmp4調(diào)節(jié)作用的研究也通過外源性增加mi-RNA145 監(jiān)測Bmp4、Shh信號的表達，并表明Bmp4表達水平的下調(diào)能引起Shh受體α 表達水平的變化［15］。 當然對于Shh／Bmp4信號通路的外源調(diào)控也有很多解釋，有學者發(fā)現(xiàn)Shh信號通路上游存在3 個非編碼片段為特異調(diào)控內(nèi)胚層Shh基因表達的增強子，亦有研究表明Shh／Bmp4受相關上游基因的調(diào)控，但具體機制尚不明確［14］。 另外，在對Bmp受體（BMPrIA）的研究中發(fā)現(xiàn)，Bmp 信號傳遞的下游可監(jiān)控出Msx2（同源盒基因）的表達，該基因的表達是否反作用于Bmp4的轉(zhuǎn)錄或表達尚未有相關研究證實［16］。 簡而言之，Shh／Bmp4信號通路的信息傳遞過程中，不同靶基因間相互影響，也存在著不同的外源性調(diào)控機制。

三、Shh／Bmp4 信號通路在先天性ARM 末端直腸ENS 發(fā)育過程中的作用

肛門直腸正常的胚胎發(fā)育過程為：胚胎發(fā)育3周末，后腸末端膨脹與前尿囊相通，形成泄殖腔，泄殖腔的尾端為外胚層上皮細胞所包裹。 發(fā)育第4 周時，泄殖腔與后腸間的中胚層皺襞形成并向尾端生長延長，同時間充質(zhì)于泄殖腔兩側(cè)壁內(nèi)側(cè)增生形成皺襞向泄殖腔內(nèi)生長，這些構成了尿直腸膈的基本結(jié)構，也就將泄殖腔分為前后兩部分，前者為尿生殖竇，后者為直腸，隨著中胚層的發(fā)育，二者之間的交通越來越小，最終形成一個稱之為泄殖腔管的小管道，這種自然管道在胚胎發(fā)育的第7 周會自動閉合。 肛門直腸與泌尿生殖系統(tǒng)的分化由尿生殖膈逐漸發(fā)育向下與泄殖腔膜（即第三周末包裹泄殖腔尾端的上皮細胞所形成）融合引起。 胚胎發(fā)育過程中，任何節(jié)點的發(fā)育異常均能造成畸形，若尿生殖膈形成或者下降受阻，則會導致尿生殖膈與泄殖腔膜融合異常，背側(cè)泄殖腔的一直存在即被認為會產(chǎn)生肛門閉鎖或各類尿生殖瘺［17］。

Shh／Bmp4信號通路是細胞增殖、分化及組織特異性的重要調(diào)節(jié)器，對調(diào)控生物體肛門直腸的正常發(fā)育有著非常重要的意義，同時對腸道上皮生長、腸壁層次的形成及腸管沿前后軸的區(qū)域性分化等起重要作用。 當Shh基因發(fā)生突變或異常表達時，其介導傳遞的相關信號途徑發(fā)生改變，從而導致胚胎發(fā)育畸形，如氣管食管畸形、腸化生、環(huán)狀胰腺、十二指腸狹窄、腸神經(jīng)支配異常和肛門閉鎖［21］。國外學者通過動物實驗表明，Shh基因信號異?？蓪е赂鞣N類型ARM，且其畸形嚴重程度與Shh介導的信號通路消融水平呈正相關［18］。 早期Runck等［19］研究發(fā)現(xiàn)敲除Shh基因鼠的胚胎發(fā)育過程，前期即有上皮細胞發(fā)育障礙，并且監(jiān)測到Bmp4表達水平下降，此外他們也監(jiān)測了14 例ARM 患者的末端直腸上皮細胞中基因的表達，發(fā)現(xiàn)Shh／Bmp4表達趨勢一致，證實了Shh／Bmp4信號通路參與ARM 的形成。

近年來，有研究證實Shh／Bmp4信號通路不僅參與ARM 的形成，對末端直腸ENS 的發(fā)育也起著重要作用。 正常腸管蠕動需要腸壁神經(jīng)叢以及平滑肌有序的生長發(fā)育，整個ENS 包括了腸壁神經(jīng)元以及控制平滑肌收縮的肌間神經(jīng)叢。 腸壁神經(jīng)節(jié)細胞的密度、大小及數(shù)量可客觀反映腸道功能［20］。Golstein 等［21］認為先天性ENS 發(fā)育異常會引起諸多嚴重的腸道疾病，經(jīng)典疾病為先天性巨結(jié)腸，表現(xiàn)為病變區(qū)無腸神經(jīng)元發(fā)育。 Meirer-Ruge 等［1］也發(fā)現(xiàn)在ARM 末端直腸中ENS 異常發(fā)育的發(fā)生率為60%，主要包括無腸神經(jīng)節(jié)、腸神經(jīng)發(fā)育不良等，并認為ENS 的發(fā)育異常與術后排便功能障礙密切相關。 Mauricio 等［22］通過動物實驗研究發(fā)現(xiàn)ARM 胎鼠的直腸末端神經(jīng)節(jié)細胞密度降低，從而影響了肛門排便功能。 目前公認來源于腸道神經(jīng)嵴干細胞（gut neural crest cells，GNCC）的ENS 發(fā)育主要受神經(jīng)膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）和內(nèi)皮素-3 兩種信號通路的調(diào)節(jié)。 有學者發(fā)現(xiàn)ENS 的GNCC 信號通路啟動需要Bmp4的參與，Bmp4的活化可調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子3 受體的表達，最終作用于GNCC 的分化以及后期腸神經(jīng)元的發(fā)育［23］。 Fu 等［24］則發(fā)現(xiàn)使用noggin 或Bmps 單克隆抗體阻斷Bmps，可以促使鼠腸壁神經(jīng)嵴干細胞向結(jié)腸遠端遷徙，并增強對GDNF 的趨化性，反之使用Bmps 則導致相反的作用，由此可推斷Bmp4在不同發(fā)育階段具有不同的作用，具有時間及濃度依賴性，也證實了Bmp4對ENS發(fā)育的影響。 2016 年Nandar 等［3］利用禽類胚胎的多功能性，采用各種實驗方案（包括器官培養(yǎng)、組織重組等）來測試Shh在人類胚胎發(fā)育過程中的作用，發(fā)現(xiàn)Shh過度表達可顯著降低GNCC 增殖，促進其向早期神經(jīng)元分化，而這個過程與神經(jīng)元的非細胞表型相關，試驗揭示了Shh在調(diào)控GNCC 增殖、分化、遷移和模式方面的作用，與Fu 等［24］研究結(jié)果一致。 此外，該研究為了確定Shh信號通路是否能直接影響ENS，他們用GDNF 處理腸外植體，24 h 后細胞從腸壁中移除，Shh信號蛋白加入培養(yǎng)基中，該操作并沒有終止GNCC 的持續(xù)遷移，相反在細胞遷移之前加入Shh和GDNF 就會影響GNCC 的遷移，這表明Shh對GNCC 的影響是間接的，可能通過改變腸道微環(huán)境來抑制GNCC。 另外，任紅霞等［25］利用全反式維甲酸誘導鼠ARM 的研究結(jié)果顯示，Bmp4的表達與神經(jīng)源性特異性烯醇化酶定位在肌間及黏膜下神經(jīng)叢，在腸神經(jīng)節(jié)細胞胞質(zhì)及核周表達強烈，在直腸末端變化趨勢一致。 相較于正常組，ARM 組末端直腸Shh／Bmp4表達下降；另外ARM組間對比發(fā)現(xiàn)高位ARM 組Shh／Bmp4表達下調(diào)，ENS 發(fā)育落后于低位ARM 組，證實Shh／Bmp4的表達與ENS 發(fā)育相關，提示Bmp4對GNCC 有直接影響。 同時，該研究還發(fā)現(xiàn)Shh／Bmp4主要通過調(diào)節(jié)腸道發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄因子GDNF（是一種腸間質(zhì)分泌的糖蛋白，通過對GNCC 的分化、定位及移行進行調(diào)控來推動ENS 的發(fā)育）的靈敏度來調(diào)節(jié)GNCC的增殖、分化與遷移，干擾GNCC 對GDNF 的反應會造成腸壁神經(jīng)嵴干細胞遷移的停滯，從而導致遠端腸段GNCC 不能聚集成簇，最終影響神經(jīng)節(jié)的形成［24］。 此外有學者［13］對15 例高位ARM、25 例低位ARM 及10 例對照組（無ARM）進行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh、Gli2 以及Bmp4在高位ARM 患者腸道上皮細胞中的表達明顯低于正常或低位ARM 患者，這說明不同類型ARM 患者末端直腸中的Shh和Bmp4表達有差異性，提示Shh和Bmp4在腸神經(jīng)節(jié)形成過程中起著重要作用。 還有學者研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)胚層上皮細胞Shh信號通路障礙抑制了相鄰間質(zhì)中神經(jīng)節(jié)的形成以及平滑肌的分化，內(nèi)胚層上皮細胞的發(fā)育也同時影響著非平滑肌間質(zhì)（最終發(fā)育為黏膜固有層及黏膜下層） Patched 以及Bmp4的表達［8］。 該研究以雞胚胎為模型，環(huán)巴胺誘導致畸，結(jié)果顯示Patched 和Bmp4主要表達在黏膜層和黏膜下層，Shh主要表達在內(nèi)胚層上皮細胞；不同濃度的環(huán)巴胺會引起不同程度的腸神經(jīng)元數(shù)量變化，同時Bmp4表達有差異，藥物致畸組Bmp4過量表達、且引起間質(zhì)層神經(jīng)細胞發(fā)育的減少，揭示了Bmp4在ENS 發(fā)育中的重要作用［7］。 實驗結(jié)果同時也顯示Shh／Bmp4對胚胎發(fā)育早期的ENS 發(fā)育作用微弱，而在胚胎發(fā)育后期，由于上皮細胞及間質(zhì)細胞分化趨近成熟，神經(jīng)細胞遷移至正常分化場所，Shh／Bmp4信號通路通過調(diào)節(jié)平滑肌細胞及神經(jīng)秩蛋白的發(fā)育來參與ENS 的發(fā)育［8］。

目前研究認為Shh／Bmp4信號通路是在參與中軸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中一定程度上直接或間接影響了ENS 的發(fā)育［3］。 眾所周知，胚胎發(fā)育早期甲狀腺激素水平影響著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，有學者［26］通過監(jiān)測T3 分泌水平發(fā)現(xiàn)后胚層腸道發(fā)育期對于Shh／Bmp4信號的需求，T3 分泌高峰即為Shh信號表達最強烈，在腸道或其余相鄰器官中Bmp4表達也達到上限，Shh／Bmp4信號表達水平變化與體內(nèi)T3 水平變化大致類似，故認為Shh／Bmp4的表達為成熟干細胞T3 誘導的器官間相互協(xié)同發(fā)育的中間調(diào)節(jié)物，起調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及協(xié)同作用。 Pretti 等［27］發(fā)現(xiàn)在鼠大腦發(fā)育過程中，大鼠間腦以及垂體中能追蹤到Bmp4，而實驗數(shù)據(jù)又顯示人大腦發(fā)育與鼠相似，以此來說明Bmp4參與了腦形成并影響著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育［28］。

對于肛門直腸畸形末端直腸的現(xiàn)有研究，一般基于果蠅和小鼠這兩種動物模型，綜合近年動物模型試驗研究，發(fā)現(xiàn)肛門直腸畸形末端直腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響因子眾多，信號通路間互相影響強化信號的傳遞，除Shh／Bmp4信號通路之外，還存在著Wnt 通路［29］。 有文獻指出，Wnt 蛋白的異常激活能誘導Bmp 信號的活化，說明了Wnt基因等對Shh／Bmp4信號通路產(chǎn)生外源性調(diào)控的作用，增強信號通路間的聯(lián)系［15］。 除此之外，復旦大學附屬兒科醫(yī)院早期研究中監(jiān)測到肛門直腸畸形患者末端直腸Shh基因啟動子區(qū)的高甲基化表達，DNA 甲基化是表觀遺傳學研究最深入一種經(jīng)典酶介導的化學修飾，對于DNA 甲基化是否影響Shh／Bmp4信號傳遞通路來介導ARM 發(fā)生，國內(nèi)外報道甚少，因此甲基化對Shh／Bmp4信號通路的調(diào)控機制尚不明確［30］。

綜上所述，Shh／Bmp4信號通路異常不僅與ARM 形成有關，而且對末端直腸ENS 的發(fā)育起著重要作用，不同類型ARM 末端直腸組織中Shh／Bmp4信號表達水平差異與局部ENS 發(fā)育呈正相關。 對于Shh／Bmp4信號通路通過何種方式或者作用于何種靶點來調(diào)節(jié)ENS 的發(fā)育，目前機制尚不明確，因此還需進一步深入研究，這樣有助于產(chǎn)前指導基因分子診斷、提供相關靶基因預防ARM 形成以及輔助ARM 患者術后進行相關的ENS 干預性治療，可進一步降低污糞、便秘等排便功能障礙的發(fā)生率，提高ARM 患者術后的生活質(zhì)量。