芒果組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

王素杰，李 鳳，員 楠，張漢堯

(西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

芒果(MangiferaindicaL.)是一種原產(chǎn)于印度的漆樹科(Anacardiaceae)杧果屬(Mangifera)常綠大喬木，又名望果、蜜望、莽果、抹猛果。廣泛分布于亞熱帶和熱帶地區(qū)，中國的芒果資源十分豐富，其產(chǎn)區(qū)主要集中在廣西、廣東、云南、福建、海南等省份。芒果肉質(zhì)細(xì)膩、風(fēng)味獨(dú)特，享有“熱帶水果之王”的美譽(yù)，與蘋果、香蕉、柑桔、葡萄齊名世界五大水果，是亞熱帶和熱帶地區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)作物之一。早在1982年，學(xué)者開始探索芒果組織培養(yǎng)的技術(shù)，美國學(xué)者Litz R.E.等[1]最先通過分離芒果的胚珠進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了體細(xì)胞胚。1989年，Dewald等[2]以Paeeis和James Saigon 2種多胚芒果的珠心組織為外植體，在改良的B5培養(yǎng)基中誘導(dǎo)獲得了體細(xì)胞胚，繼續(xù)培養(yǎng)得到了完整植株。1995年，Raghuvanshi等[3]報(bào)道了從Amrapali芒果的嫩葉中誘導(dǎo)出愈傷組織并成功得到完整植株。20世紀(jì)90年代以來，我國的許多學(xué)者也相繼開始了芒果組織培養(yǎng)的研究工作，目前該技術(shù)達(dá)到一定水平，在芒果愈傷組織的增殖，早期體細(xì)胞胚的發(fā)生等諸多領(lǐng)域建立了離體再生體系。本文對(duì)近年來芒果組織培養(yǎng)技術(shù)的研究概況及應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行闡述，以期為芒果遺傳改良、種質(zhì)資源保存和創(chuàng)新提供參考。

1 外植體的選擇

1.1 外植體的來源

由于植物的胚珠和珠心細(xì)胞是不含病毒的，所以在芒果組織培養(yǎng)中，大多利用芒果的胚珠和珠心做為外植體，同時(shí)對(duì)其它器官和組織也進(jìn)行過再生研究[4]。黃鏡浩等[5]以扁桃芒未成熟的珠心組織為外植體，接種在改良的B5培養(yǎng)基上，培養(yǎng)35 d左右，長出少量的胚性愈傷組織；再經(jīng)過90～120 d的成熟培養(yǎng)，發(fā)育成乳白色的成熟體胚，最終有3個(gè)體胚萌發(fā)成苗。最近也有學(xué)者利用芒果的其它組織和器官誘導(dǎo)成功的報(bào)道。肖潔凝[6]研究發(fā)現(xiàn)，以芒果樹的頂芽、花枝、葉柄、幼果和子葉節(jié)等外植體誘導(dǎo)不定芽時(shí)，只有子葉節(jié)能誘導(dǎo)出腋芽，在IBA培養(yǎng)基上繼續(xù)誘導(dǎo)可以生根。而吳永杰[7]以紫花芒和紅芒的子葉和胚珠作為外植體的研究中，發(fā)現(xiàn)子葉外植體的胚性培養(yǎng)物誘導(dǎo)率明顯高于胚珠外植體。王曉峰等[8]以離體胚軸為外植體，在DK和WPM培養(yǎng)基上可以正常成苗。因此，外植體的選擇應(yīng)從植物的取材部位、消毒難易程度等諸多因素加以考慮。

1.2 外植體的消毒

外植體的消毒是組織培養(yǎng)中的重要環(huán)節(jié)。對(duì)于消毒劑的選擇既要考慮殺菌效果，又要考慮清洗難度，還要盡可能的使外植體組織保持活力。常見的消毒劑有70%～75%酒精、2%次氯酸鈉溶液、0.1%～1%的氯化汞溶液等。采用胚珠或珠心細(xì)胞作為外植體時(shí)，由于它們是無毒的，所以只需將芒果果實(shí)表面進(jìn)行消毒即可。消毒過程如下：先用70%的乙醇浸泡10 min，再用滴加2～3滴吐溫-20的1%次氯酸鈉溶液處理20～30 min，然后用無菌雙蒸水清洗2～3遍，最后無菌取出胚珠或珠心細(xì)胞即可[9]。Raghuvanshi等[3]采用Amrapali芒果的嫩葉做為外植體，帶回實(shí)驗(yàn)室后，先用自來水沖洗30 min，然后用1%吐溫-80浸泡5 min，用無菌水沖洗數(shù)次，之后用70%酒精處理30 s，0.05%氯化汞處理2 min，最后用雙蒸水至少?zèng)_洗5次；消毒處理后再用不同植物生長調(diào)節(jié)劑和培養(yǎng)基培養(yǎng)，存活率最高達(dá)36%。不同材料對(duì)消毒劑的敏感程度不同，通常葉片消毒繁瑣。因此，在消毒步驟中，應(yīng)根據(jù)外植體的采集部位、大小等因素選擇合適的消毒劑和消毒時(shí)間。

2 培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇

2.1 培養(yǎng)基

不同的外植體材料所需營養(yǎng)不同，所以選擇合適的培養(yǎng)基配方顯得尤為重要。一般而言，幼胚做為外植體時(shí)，常用改良的B5培養(yǎng)基[9-14]，也有使用WPM、MS等其它培養(yǎng)基的報(bào)道[1，15-16]。不同的外植體在不同種類的培養(yǎng)基上生長狀態(tài)不同。王曉峰等[8]比較了以芒果離體胚軸為外植體，在DK、MS、1/2 MS、WPM 4種基本培養(yǎng)基中的成苗情況，結(jié)果顯示僅在DK和WPM培養(yǎng)基中能正常成苗。Raghuvanshi等[3]在對(duì)芒果的嫩葉進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，先將嫩葉置于液體MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)，以減輕酚類物質(zhì)對(duì)外植體的抑制效果；然后再轉(zhuǎn)接到固體MS培養(yǎng)基上，可以長成完整植株。此外，利用芒果的珠心作為外植體培養(yǎng)時(shí)，研究人員先用1/2 MS培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)，然后再轉(zhuǎn)入改良的B5培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，也獲得了再生植株[17]。

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑

在植物組織培養(yǎng)過程中，不同種類和濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑以及配比，都會(huì)影響植物組織和器官的正常生長。常見的植物生長調(diào)節(jié)劑有2，4-D、NAA、6-BA等，2，4-D有利于植物愈傷組織的生長，而后兩者有利于植物器官的分化。有研究表明，2，4-D 0.5 mg·L-1時(shí)，有利于芒果愈傷組織的形成[17]。在增殖培養(yǎng)過程中，細(xì)胞分裂素KT最適質(zhì)量濃度為5 mg·L-1，高濃度的2，4-D不利于愈傷組織的增殖分化，因此應(yīng)降低其濃度或去除[18]。張?jiān)疥朳19]研究表明，將培養(yǎng)基中2，4-D濃度減半可以使愈傷組織增殖情況變好。

3 培養(yǎng)條件

3.1 光照

光照是植物生長和發(fā)育的必要條件之一，適宜的光照可以延長愈傷組織的保存時(shí)間。研究表明，愈傷組織培養(yǎng)所需的最適光照強(qiáng)度為1000 Lx，16 h·d-1；而再生植株幼苗則需要更強(qiáng)的光照，為1500～3500 Lx，16 h·d-1；光照強(qiáng)度的增強(qiáng)其成活率和生長速度也隨之提高[1，9，20]。

3.2 pH值

培養(yǎng)基的酸堿度過高或過低都會(huì)引起植物組織生長不良，最終導(dǎo)致外植體死亡。一般認(rèn)為，木本植物組織培養(yǎng)的最適pH為酸性。研究表明，適合芒果組培的pH值在5.7～5.8之間[20-21]。

3.3 碳源

蔗糖是植物組培中的重要碳源，同時(shí)可以調(diào)節(jié)植物細(xì)胞的滲透勢。芒果組培中，不同生長階段所需要的蔗糖濃度不同，質(zhì)量濃度一般在20～60 g·L-1之間，芒果外植體誘導(dǎo)愈傷組織時(shí)所需的蔗糖質(zhì)量濃度常規(guī)是60 g·L-1[1，14，20-22]。VLaxmi等[23]在研究芒果胚胎發(fā)生時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用不同的蔗糖濃度，胚胎萌發(fā)情況不同，蔗糖質(zhì)量濃度為60 g·L-1時(shí)，萌發(fā)比例可達(dá)28.3%，質(zhì)量濃度為30 g·L-1時(shí)的萌發(fā)率最低。Xiao等[20]用Zi-Hua芒果為實(shí)驗(yàn)材料培養(yǎng)再生植株時(shí)，蔗糖質(zhì)量濃度用40 g·L-1同樣取得了不錯(cuò)的效果。

4 芒果組織培養(yǎng)中存在的問題

4.1 污染

污染是指在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料或培養(yǎng)基上滋生細(xì)菌、真菌等微生物的一種現(xiàn)象。污染主要來自3個(gè)方面：一是由于外植體材料表面或內(nèi)部所帶的病毒、類菌原體等微生物消毒不徹底，隨著材料帶入培養(yǎng)[24]；二是接種和培養(yǎng)環(huán)境不清潔，再加上接種工具消毒不徹底都會(huì)造成污染的問題；三是接種人員操作不規(guī)范，接種過程中大聲說話，手接觸培養(yǎng)容器邊緣等。因此，盡可能選擇在人工氣候箱或溫室培養(yǎng)的材料，選擇合適的消毒方法徹底消毒，嚴(yán)格按照規(guī)范進(jìn)行操作以降低污染。農(nóng)艷豐等[25]在芒果莖段的組織培養(yǎng)中，為了減少污染，先將芒果胚埋進(jìn)消毒的沙床上進(jìn)行催芽，待長出的苗高15 cm后，剪去莖段做為外植體，再進(jìn)行消毒處理，這樣可顯著降低材料的污染率。

4.2 褐化

褐化是指在組織培養(yǎng)中外植體變成褐色從而死亡的現(xiàn)象，是組培過程中普遍存在的問題。研究表明，向培養(yǎng)基中添加吸附劑和抗氧化劑可以有效的控制褐化[26]。Raghuvanshi等[3]將消毒后的芒果幼葉接種到添加0.05% PVP的MS液體培養(yǎng)基中，放在搖床上震蕩培養(yǎng)并定時(shí)更換培養(yǎng)基，結(jié)果發(fā)現(xiàn)外植體褐化顯著減少，存活率提高到36%。黃鏡浩等[5]研究發(fā)現(xiàn)，繼代培養(yǎng)基中降低2，4-D濃度，同時(shí)添加Vc 50 mg·L-1，并與成熟培養(yǎng)基交替使用，可有效地降低褐化率。農(nóng)艷豐等[25]探索不同防褐化措施的防治效果，結(jié)果表明添加聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的培養(yǎng)基中外植體褐化率最低，比添加AC或Vc的培養(yǎng)基效果要好。王曉峰等[8]在對(duì)芒果離體胚軸的培養(yǎng)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，MS和1/2 MS液體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)的胚軸褐化嚴(yán)重，最終導(dǎo)致死亡，而在DK和WPM液體培養(yǎng)中褐化不顯著，可以誘導(dǎo)成苗。

5 展望

植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以縮短繁殖周期，在苗木快繁、花藥培養(yǎng)和培養(yǎng)脫毒苗等方面廣泛應(yīng)用。組織培養(yǎng)在芒果繁育上有了一定的進(jìn)展，但是在酚害控制和生根誘導(dǎo)領(lǐng)域的相關(guān)技術(shù)不夠成熟，應(yīng)積極攻克芒果組織培養(yǎng)中存在的難題，不斷完善芒果組織培養(yǎng)體系，可望為芒果優(yōu)良品種的保存和遺傳轉(zhuǎn)化提供技術(shù)支持。