• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2檢測方法的研究進展

    2021-12-03 10:25:05韓一芳綜述張錦海汪春暉進審校
    醫(yī)學研究生學報 2021年2期
    關(guān)鍵詞:核酸測序抗體

    韓一芳綜述,張錦海,汪春暉,朱 進審校

    0 引 言

    2020年1月,科研人員檢出一種區(qū)別于SARS冠狀病毒(SARS-CoV)和中東呼吸綜合征病毒(MERS-CoV)的新型冠狀病毒,并獲得全部基因組序列[1]。同年2月11月,國際病毒分類委員會的冠狀病毒研究小組(CSG)將引起此次疫情的新型冠狀病毒(2019-nCov)[2]更名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2),同日世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒感染的肺炎命名為“COVID-19”。同年2月28日世界衛(wèi)生組織將此次疫情全球風險級別由此前的“高”上調(diào)至“非常高”。

    COVID-19患者主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、干咳和乏力,無明顯的特征性臨床表現(xiàn),與流感等呼吸道病毒性感染癥狀相似[3]。因此,特異靈敏的實驗室檢測對于COVID-19的診斷十分重要。《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》中,疑似病例的確診主要依據(jù)實時熒光RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性、病毒基因測序與已知的新型冠狀病毒高度同源、血清新型冠狀病毒特異性IgM和IgG抗體陽性以及血清新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及4倍以上升高。疫情暴發(fā)初期,核酸檢測能力相對不足,隨著篩查能力提升,核酸檢測手段的可靠性也存在一些爭議,如冠狀病毒復(fù)制過程突變率和重組率高對核酸檢測存在的可能影響;以及出院患者復(fù)診核酸檢測陽性是復(fù)發(fā)感染,還是采樣影響,或是核酸檢測漏檢[4];隨著免疫學檢測和核酸檢測的聯(lián)合使用是否可規(guī)避上述問題。本文就SARS-CoV-2感染的實驗室檢測作一綜述。

    1 SARS-CoV-2

    SARS-CoV-2為單股正鏈RNA病毒(positive-sense ssRNA viruses),屬套病毒目(Nidovirales)冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)β屬,呈圓形或橢圓形,有包膜,直徑60-140nm。基因組全長29903 bp(GenBank accession number MN908947),基因組排列順序是5‘-ORF1ab-S- ORF3a-E-M-ORF6-ORF7a-ORF8-N-ORF10,5′端約2/3區(qū)域編碼病毒RNA聚合酶蛋白,后1/3區(qū)域編碼4個結(jié)構(gòu)蛋白,刺突蛋白(spike,S)、包膜蛋白(envelope,E)、膜蛋白(membrane,M)、核衣殼蛋白(nucleocapsid,N),以及一些非結(jié)構(gòu)蛋白和輔助蛋白。SARS-CoV-2基因特征與α屬人冠狀病毒229E、NL63,及β屬人冠狀病毒OC43、HKU1、SARS-Cov(79%同源)和MERS-Cov(52%同源)均有明顯區(qū)別,與中國浙江舟山蝙蝠體內(nèi)分離得到的兩株SARS樣冠狀病毒(GenBank accession nos. MG772933,772934)高度同源[3,5-6]。盡管多個科研團隊發(fā)現(xiàn)新冠病毒與蝙蝠攜帶的SARS相關(guān)病毒相似,且有報道與穿山甲攜帶的冠狀病毒刺突蛋白受體結(jié)合區(qū)域基本相同,但北京大學陸劍與上海巴斯德所崔杰課題組近期研究結(jié)果提示,其可能的原因為趨同進化,更有意義的是比較基因組上的中性位點的差異,與基因組不同序列混為一談分析相比,對于中性位點的比對顯示新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13的遺傳距離要大很多,該課題組通過分子進化發(fā)現(xiàn),新冠病毒已經(jīng)演化出L和S兩個亞型[7]。

    2 實驗室診斷

    傳染病病原的診斷包括病原學診斷和血清學診斷,病原學診斷包括病原分離和病原核酸檢測,而免疫學診斷分為抗原檢測和抗體檢測。新型冠狀病毒病原分離需在生物安全3級實驗室中進行,接種Vero E6和Huh-7等細胞系培養(yǎng)需6天左右,該方法尚未納入診斷標準。參照《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》,確診主要采取的實驗室檢測方法有:實時熒光定量RT-PCR檢測新型冠狀病毒核酸陽性;病毒基因測序,與已知的新型冠狀病毒高度同源;新型冠狀病毒特異性IgM抗體和IgG抗體陽性;新型冠狀病毒特異性IgG抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍及4倍以上升高。

    2.1核酸檢測

    2.1.1 實時熒光RT-PCR檢測呼吸道樣本的實時熒光PCR(polymerase chain reaction,PCR)檢測是急性呼吸道傳染病的常規(guī)檢測手段,靈敏度高、特異性好且在病原檢測中應(yīng)用成熟。此次新型冠狀病毒突發(fā)公共衛(wèi)生事件中,實時熒光RT-PCR檢測法在早期診斷和篩查中都發(fā)揮了重要作用。目前市面上的核酸檢測試劑盒及中國疾病預(yù)防控制中心和多個課題組發(fā)布的檢測方法主要基于5′端標記熒光報告基團,3′端標記熒光淬滅基團的TaqMan探針RT-PCR 技術(shù)[8-9]。然而,由于新型冠狀病毒與蝙蝠冠狀病毒RaTG13在基因序列上有4%的差異,因此部分引物探針存在交叉反應(yīng),如香港大學公共衛(wèi)生學院所公布的SARS-CoV-2引物探針與SARS-CoV和蝙蝠源SARS冠狀病毒存在交叉反應(yīng),PCR陽性結(jié)果需經(jīng)序列分析進一步區(qū)分[8]。此外,因樣本類型及采集時間、樣本質(zhì)量、樣本運輸保存時間與條件、儀器設(shè)備、試劑、人員操作方法因素等多方面影響,目前報道COVID-19患者病毒核酸陽性檢出率僅為30%~50%[10],新型冠狀病毒RT-PCR法核酸檢測試劑對弱陽性樣本存在漏檢情況[11]。

    自公布SARS-CoV-2基因序列以來,國家藥品監(jiān)督管理局已應(yīng)急審批10個新型冠狀病毒核酸實時熒光RT-PCR檢測試劑盒,三類醫(yī)療器械注冊證的病毒核酸檢測試劑的研發(fā),常規(guī)經(jīng)臨床驗證、標準化生產(chǎn)、質(zhì)控等一整套流程,上市一般約三年。此次為滿足疫情防控的需求,經(jīng)應(yīng)急通道特批的核酸檢測試劑尚存在不穩(wěn)定的因素,如低濃度樣本假陰性,缺乏大規(guī)模臨床樣本驗證等[12]。有賴于免疫學檢測等方法的補充以及后續(xù)的不斷完善。

    2.1.2等溫擴增此次醫(yī)療診治力量相對薄弱的城市在遭受嚴重疫情時,反應(yīng)出防疫中對便攜、快速檢測設(shè)備的需求。由于實時熒光PCR需要依賴昂貴精密儀器,近年來環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和重組酶聚合酶擴增(recombinase polymerase amplification, RPA)、依賴核酸序列的擴增技術(shù)和依賴解旋酶的恒溫基因擴增技術(shù)等恒溫擴增技術(shù)不斷涌現(xiàn),目前已報道的恒溫擴增技術(shù)有十幾種,在病原監(jiān)測檢測中得到了廣泛的應(yīng)用[13-15]。目前已報道的流感病毒、合胞病毒等呼吸道病原RT-LAMP檢測方法均有較好的靈敏度和特異性[16-17],隨著技術(shù)的發(fā)展,中東呼吸道綜合征的RT-LAMP結(jié)合可視化垂直引流條[18]和探針的方法[19]可較好的防止高效恒溫擴增后造成產(chǎn)物氣溶膠污染。博蒙特衛(wèi)生系統(tǒng)提出新型冠狀病毒的RT-LAMP檢測法在風險點可能實現(xiàn)更快、更便宜的現(xiàn)場檢測[20]。成都信息工程大學葉松教授研究團隊擬研發(fā)基于微流控的即時檢測(point-of-care testing,POCT)技術(shù)和LAMP技術(shù)的現(xiàn)場智能一體化快速新型冠狀病毒核酸核酸檢測系統(tǒng)。此次疫情中應(yīng)急獲批的博奧公司“六項呼吸道病毒核酸檢測試劑盒(恒溫擴增芯片法)”基于LAMP技術(shù),能檢測新型冠狀病毒、甲型流感病毒通用,甲型流感病毒2009H1N1型、甲型流感病毒H3N2型、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒六個靶標,不僅可區(qū)分正常人和COVID-19患者分開,還可區(qū)分易混淆的輕癥新冠肺炎患者和流感患者,降低因診斷不明造成的人傳人風險。

    重組酶聚合酶核酸擴增的反應(yīng)條件為23~45 ℃,反應(yīng)時長只需5~20 min,特異性強、靈敏度高,特別是結(jié)合側(cè)流層析的RPA-LFD檢測可通過肉眼觀察檢測線和質(zhì)控線的顏色來判斷檢測結(jié)果,適用于現(xiàn)場簡單快速檢測[21]。而重組酶介導等溫核酸擴增技術(shù)(recombinase aided amplification, RAA)的出現(xiàn),不僅使得重組酶等溫擴增的成本降低,而且在病原檢測中的廣泛應(yīng)用、不斷優(yōu)化推廣[22-23],此次疫情中RAA檢測方法已納入江蘇省地方標準新型冠狀病毒檢測技術(shù)規(guī)范(DB32T 3762.4-2020)。但該方法尚未列入國家標準指南,尚不能作為實驗室診斷標準。近期美國雅培公司研發(fā)的COVID-19測試工具ID NOWTM是一種快速、基于儀器和切口酶恒溫擴增技術(shù)的檢測系統(tǒng),最快可在5 min內(nèi)獲得陽性結(jié)果,陰性結(jié)果確認也僅需13 min,目前該檢測工具已獲得美國食品和藥物管理局緊急批準。

    2.1.3測序新型冠狀病毒肺炎診療方案試行版一直將高通量測序列入確診病例的檢測方法。高通量測序技術(shù)又名第二代測序(next-generation sequencing,NGS),單次并行測序可達幾十萬到幾百萬條DNA分子[24]。2014年基于二代測序技術(shù)的病原宏基因組測序確診鉤體病后[2],病原宏基因組測序廣泛應(yīng)用于未知病原體鑒定、罕見重要病原體診斷和臨床大數(shù)據(jù)分析等[26-27]。

    高通量測序是早期不明原因肺炎階段明確病原的關(guān)鍵技術(shù),也是監(jiān)測新型冠狀病毒突變的重要手段[28]。但是NGS序列讀長較短,Illumina平臺為250~300 bp,454平臺最長500 bp左右[29]。NGS建庫前需通過PCR富集序列,含量較少的序列有可能無法被擴增而導致信息丟失,且PCR存在引入錯配堿基的可能。

    第3代測序為單分子測序,基于SMRT技術(shù)(PacBio公司)和納米孔單分子技術(shù)(Oxford Nanopore Technologies公司)等,運行速度快,數(shù)據(jù)可實時監(jiān)測,建庫過程無需PCR擴增即可以測定長度在數(shù)萬個堿基的核酸序列。而近來有學者報道對已知病原結(jié)合多重PCR后進行三代測序,有助于快速獲得病毒基因組全長[30]。此外,三代測序技術(shù)創(chuàng)新性的實現(xiàn)了RNA直接測序[31-32]。3月8日,澳大利亞科學家發(fā)表了首例使用納米孔技術(shù)對SARS-CoV-2的直接RNA測序研究,RNA直接測序數(shù)據(jù)還有助于識別病毒中可能存在的修飾影響宿主-病原體相互作用和病毒復(fù)制的堿基修飾。英國學者10h內(nèi)基于三代測序獲得SARS-CoV-2基因組,進一步通過非序列依賴單引物(SISPA)宏基因組測序分析識別與其他細菌和病毒混合感染的信息[33]。盡管測序精度高,可獲得全面的基因組數(shù)據(jù)有助于深度解讀SARS-CoV-2的來源、病毒突變等問題,但測序結(jié)果的判定依賴專業(yè)人員較長時間的生物信息學分析,且測序流程復(fù)雜、專業(yè)性強、檢測時間相對較長,難以大范圍推廣開展快速診斷[34]。

    2.1.4其他核酸檢測技術(shù)隨著科技的發(fā)展和多學科的融合,數(shù)字PCR技術(shù)、基因編輯技術(shù)、核酸POCT技術(shù)和核酸質(zhì)譜技術(shù)等核酸檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)[35]。如中國計量科學研究院研發(fā)并發(fā)布了高靈敏度的新型冠狀病毒數(shù)字PCR法核酸檢測試劑盒;麻省理工學院的張鋒研究團隊研發(fā)了基于CRISPR/Cas13技術(shù)的新型冠狀病毒檢測試劑盒[36];Nguyen等[37]利用CRISPR/Cas13d基因編輯系統(tǒng)靶向探索可能的新型冠狀病毒感染治療方案;多家企業(yè)還在研發(fā)整合核酸擴增、信號收集與結(jié)果分析功能的新型冠狀病毒核酸POCT平臺;此外,還有公司利用飛行時間質(zhì)譜法技術(shù)開發(fā)了“常見呼吸道病毒及新型冠狀病毒核酸檢測”,檢出限為100拷貝數(shù)/mL。

    盡管核酸檢測是目前廣泛使用的檢測金標準,但核酸檢測的樣本前處理需要在生物安全實驗室內(nèi)進行[38],并不十分適用于床旁檢測及現(xiàn)場快速篩查。使用含裂解液的病毒采樣管滅活病毒,結(jié)合可在37 ℃進行反應(yīng)的恒溫擴增方法是否有望實現(xiàn)簡便一體化的核酸提取與檢測仍有待進一步研究。

    2.2免疫學檢測法免疫學檢測包括對抗原的檢測和對抗體的檢測,SARS-CoV-2表面的S蛋白、N蛋白等可作為抗原表位[39],已有公司發(fā)布基于膠體金免疫層析法的2019-nCoV新型冠狀病毒抗原檢測試劑以及基于納米顆粒顯色技術(shù)和雙抗體夾心的新型冠狀病毒蛋白快速檢測檢測試劑盒,可在咽拭子、痰液和血液中檢測到SARS-CoV-2抗原。盡管重組抗原相對快速,但是選擇最佳抗原需要時間和大樣本試驗證據(jù),目前尚無抗原檢測試劑通過國家藥監(jiān)局審批應(yīng)用于臨床。

    《新型冠狀病毒肺炎診療方案(試行第七版)》將抗體檢測納入新冠肺炎的確診依據(jù)。IgM是初次體液免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體[40],新型冠狀病毒特異性IgM抗體在發(fā)病后3~5天開始出現(xiàn)陽性,IgM升高指示新近感染,可用于早期診斷,IgG抗體檢測可以確認患者的感染狀況。血清IgM/IgG抗體檢測用于發(fā)熱患者的初篩可提高疑似病例確診率[41]。此外,通過檢測IgM/IgG開展無癥狀人群大規(guī)模篩查有利于早期感染患者的檢出,可作為核酸檢測的互補。相對于核酸檢測,血液中的病毒含量相對來說比較低[42],可降低被感染的風險,對醫(yī)護人員更加安全。同時,抗體檢測和熒光定量RT-PCR核酸檢測的聯(lián)合有助于提高檢測的靈敏度,降低誤診率或漏診率。

    膠體金免疫層析檢測方法無需依托儀器,操作簡單方便,快速直觀判定結(jié)果,僅需15~30 min,可實現(xiàn)POCT,同時每個患者使用一份試紙條,可有效避免交叉污染。已有研究結(jié)果顯示,血清IgM和IgG抗體的敏感度分別為70.24%和96.10%[43], IgM和IgG聯(lián)合檢測可彌補新型冠狀病毒肺炎核酸檢測的假陰性,特別是IgM抗體陽性對核酸陰性疑似COVID-19患者的確診有重要價值[44]。

    研究表明,化學發(fā)光法檢測可采用全自動流水線設(shè)備進行,時間短、通量高,最快檢測速度可達每小時400人份,成本相對較低,并可以對患者的抗體水平進行定量。我國目前應(yīng)急批準了萬孚生物的膠體金免疫層析技術(shù)的新型冠狀病毒抗體快速檢測試劑、英諾特的2019-新型冠狀病毒IgM/IgG聯(lián)合檢測膠體金試劑、諾唯贊醫(yī)療科技的新型冠狀病毒IgM / IgG抗體膠體金檢測試劑盒和麗珠試劑的新型冠狀病毒IgM/IgG抗體膠體金檢測試劑盒,以及重慶醫(yī)科大學牽頭聯(lián)合博奧賽斯生物科技有限公司研發(fā)的基于磁微?;瘜W發(fā)光法的新型冠狀病毒IgM和IgG抗體兩個檢測試劑盒,共計六種新型冠狀病毒抗體檢測試劑。

    綜上,盡管常規(guī)認為免疫檢測的敏感性和特異性低于核酸檢測,但免疫檢測技術(shù)在新發(fā)傳染病突發(fā)公共衛(wèi)生事件應(yīng)急處置過程中彌補了核酸檢測手段的不足。

    2.3樣本的采集及處理按照診療指南采用RT-PCR或(和)NGS方法在鼻咽拭子、痰和其他下呼吸道分泌物、血液、糞便等標本中可檢測出新型冠狀病毒核酸。新加坡國家傳染病中心對18例確診患者實時RT-PCR檢測在糞便(50%)和血液(8%)中可檢測到病毒,但在尿液中未檢測到[45]。我國學者在同一雜志上發(fā)表的基于205名確診患者的1070份樣本論文表明痰液(69%)、鼻拭子(63%)、咽拭子(32%)、肺泡灌洗液(93%)、糞便(29%)、支氣管活檢樣本(46%)、血液(1%)中可檢出SARS-CoV-2病毒,而尿液中均為檢出[42]。雖然鼻拭子和支氣管活檢樣本的樣本數(shù)較少,但仍可以看出下呼吸道標本,如痰液的檢出率更高,但COVID-19患者多干咳,痰少。患者不同部位病毒拷貝數(shù)不盡相同,對檢測結(jié)果存在較大的影響,臨床上多以上呼吸道樣本代替下呼吸道樣本,可能出現(xiàn)假陰性[46],如前述普遍使用的咽拭子檢測率僅32%,特別是恢復(fù)期患者的咽拭子病毒載量偏低[47]。此外,采樣手法難以標準化也可能導致檢測結(jié)果偏差,基于臨床采集樣本的質(zhì)量是決定檢測結(jié)果的最主要因素,2月4日,中華醫(yī)學會檢驗醫(yī)學分會針對這一問題在其網(wǎng)絡(luò)公眾號上發(fā)布了標準咽拭子采樣教程。

    新型冠狀病毒是單鏈RNA病毒,對保存條件和環(huán)境要求高,運輸儲存不當極易導致降解,采樣管及保存液選擇不當也易導致核酸檢測結(jié)果假陰性[12]。同時,新型冠狀病毒對紫外線、熱、部分消毒劑敏感,如56 ℃(30 min)、75%乙醇、乙醚、含氯消毒劑、過氧乙酸和氯仿等脂溶劑均可有效滅活病毒。而新型冠狀病毒疫情突襲給定點救治醫(yī)院的檢驗科帶來了生物安全風險管理和院內(nèi)感染控制雙重挑戰(zhàn)[48],中華醫(yī)學會的《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室生物安全防護專家共識》提出核酸檢測前可60~65 ℃孵育20~30 min,或者使用核酸提取裂解液進行滅活[49]。中山大學陳培松等比較了2例樣本未經(jīng)滅活處理、經(jīng)56 ℃ 30 min滅活、75%乙醇滅活的核酸檢測結(jié)果,Ct值無明顯差別[50]。但浙江大學段秀芝等對比了56 ℃ 30 min水浴、56 ℃ 60 min干浴、60 ℃ 30 min干浴3種滅活鼻咽拭子方式對新型冠狀病毒核酸檢測的影響,病毒在高濃度時,滅活與否以及不同的滅活處理對2019新型冠狀病毒的陽性檢出率影響不大,但當標本病毒在低濃度時,滅活對造成病毒RNA的降解,影響檢出率[51]。因此,樣本的種類、采集、保存、運輸和前處理對檢驗結(jié)果均存在一定的影響。

    3 結(jié) 語

    實驗室檢測在病例確診和密切接觸者排查中都起到了至關(guān)重要的作用。盡管目前已審批了基于核酸熒光定量PCR檢測方法和膠體金及化學發(fā)光技術(shù)的抗體檢測法的檢測試劑,但綜合評估不同檢測手段的靈敏度和特異性,以及受病原變異、樣本采集和操作方法等因素的影響同樣重要。目前研究表明樣本采集部位選擇不同、采樣量不足、采樣后樣本保存不當、病程早期病毒分泌量少及檢測試劑盒靈敏度不高均可導致假陰性結(jié)果。國際疫情形勢嚴峻,為防止境外輸入病例在國內(nèi)的傳播,可將檢測關(guān)口前移,密切排查。病毒核酸是最先可檢測到的標志物,因此核酸檢測對于患者的早診斷、早治療和疫情的防控具有重要意義。而特異性抗體檢測可彌補核酸檢測實驗條件生物安全標準高的缺陷,實現(xiàn)快速、大規(guī)模批量操作,降低醫(yī)務(wù)人員在呼吸道樣本采集過程中的暴露風險。在有條件的情況下采取抗體檢測和核酸檢測并行的檢測手段控制檢測結(jié)果的假陽性及假陰性。隨著更多檢測手段的成熟,如細胞因子檢測、免疫細胞亞群檢測等血液學檢測可作為輔助診斷方法。各項技術(shù)的不斷創(chuàng)新、優(yōu)化和聯(lián)合也將為COVID-19患者的診斷和實驗室檢測提供幫助。

    猜你喜歡
    核酸測序抗體
    杰 Sir 帶你認識宏基因二代測序(mNGS)
    新民周刊(2022年27期)2022-08-01 07:04:49
    測核酸
    中華詩詞(2022年9期)2022-07-29 08:33:50
    全員核酸
    中國慈善家(2022年3期)2022-06-14 22:21:55
    第一次做核酸檢測
    快樂語文(2021年34期)2022-01-18 06:04:14
    二代測序協(xié)助診斷AIDS合并馬爾尼菲籃狀菌腦膜炎1例
    傳染病信息(2021年6期)2021-02-12 01:52:58
    核酸檢測
    中國(俄文)(2020年8期)2020-11-23 03:37:13
    抗BP5-KLH多克隆抗體的制備及鑒定
    基因捕獲測序診斷血癌
    乙肝抗體從哪兒來
    肝博士(2015年2期)2015-02-27 10:49:44
    單細胞測序技術(shù)研究進展
    性色av一级| 亚洲,欧美精品.| 国产一区二区激情短视频 | 哪个播放器可以免费观看大片| 2018国产大陆天天弄谢| 成人无遮挡网站| 亚洲精品国产av蜜桃| 亚洲欧美成人精品一区二区| 大香蕉久久成人网| av天堂久久9| 五月天丁香电影| 亚洲精品456在线播放app| 成年动漫av网址| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 久久这里只有精品19| 欧美性感艳星| 国产精品一二三区在线看| 成人午夜精彩视频在线观看| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产亚洲欧美精品永久| 咕卡用的链子| 免费少妇av软件| 香蕉丝袜av| 一区二区av电影网| 亚洲综合精品二区| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 久久青草综合色| 国产亚洲一区二区精品| 人妻一区二区av| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 久久热在线av| 丝袜在线中文字幕| 国产精品人妻久久久久久| 久久久亚洲精品成人影院| 国产一区亚洲一区在线观看| 久久久久网色| 国产淫语在线视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 校园人妻丝袜中文字幕| 免费黄网站久久成人精品| www.av在线官网国产| 成人黄色视频免费在线看| 久久影院123| 欧美xxxx性猛交bbbb| 日韩电影二区| 黄色配什么色好看| a级毛片在线看网站| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产xxxxx性猛交| 午夜福利乱码中文字幕| 亚洲三级黄色毛片| 精品一区二区三卡| 国产色爽女视频免费观看| 人妻 亚洲 视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 亚洲成人av在线免费| 国产成人精品无人区| 国产黄频视频在线观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 九色成人免费人妻av| 一区二区三区四区激情视频| 国产精品久久久久成人av| 激情视频va一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲精品美女久久av网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品 国内视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| av线在线观看网站| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 亚洲欧美精品自产自拍| 国产黄色免费在线视频| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 国产精品熟女久久久久浪| 国产黄色视频一区二区在线观看| 美女视频免费永久观看网站| tube8黄色片| 久久 成人 亚洲| 日日摸夜夜添夜夜爱| 下体分泌物呈黄色| 日韩精品免费视频一区二区三区 | av国产久精品久网站免费入址| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲成人av在线免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产在视频线精品| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产一区亚洲一区在线观看| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 久久久国产一区二区| 水蜜桃什么品种好| 午夜免费男女啪啪视频观看| 只有这里有精品99| 免费大片18禁| 国产精品蜜桃在线观看| www.av在线官网国产| 国产麻豆69| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 午夜福利视频在线观看免费| 在线看a的网站| 色哟哟·www| 亚洲精品成人av观看孕妇| 久久av网站| 婷婷色综合大香蕉| 嫩草影院入口| 一个人免费看片子| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 97在线视频观看| 久久久精品区二区三区| 十八禁网站网址无遮挡| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久午夜福利片| 国产色爽女视频免费观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 亚洲精品456在线播放app| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产成人免费观看mmmm| 五月天丁香电影| 国产成人午夜福利电影在线观看| freevideosex欧美| 久久热在线av| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 国产男女超爽视频在线观看| 一本色道久久久久久精品综合| 曰老女人黄片| 蜜桃在线观看..| 日本av免费视频播放| 毛片一级片免费看久久久久| 91成人精品电影| 久久99一区二区三区| 国产亚洲最大av| 国产一级毛片在线| 成人亚洲欧美一区二区av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 午夜激情av网站| 午夜福利,免费看| 日韩精品有码人妻一区| 久久国内精品自在自线图片| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 国精品久久久久久国模美| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜福利网站1000一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲av综合色区一区| 国产成人精品在线电影| 少妇的逼好多水| 三级国产精品片| 久久精品人人爽人人爽视色| 日韩中文字幕视频在线看片| 9热在线视频观看99| 亚洲,欧美精品.| 草草在线视频免费看| 国产亚洲精品久久久com| 免费看不卡的av| 大香蕉久久成人网| 99久久综合免费| 国产又爽黄色视频| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 卡戴珊不雅视频在线播放| 丁香六月天网| 一级片免费观看大全| 在线观看美女被高潮喷水网站| 老熟女久久久| 男的添女的下面高潮视频| 视频中文字幕在线观看| 亚洲精品日本国产第一区| 国产不卡av网站在线观看| 26uuu在线亚洲综合色| 一本大道久久a久久精品| 18+在线观看网站| 欧美日韩精品成人综合77777| 春色校园在线视频观看| av视频免费观看在线观看| 日韩中字成人| 国产精品久久久久成人av| 尾随美女入室| av免费在线看不卡| 一级黄片播放器| videosex国产| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩综合久久久久久| 一级a做视频免费观看| 香蕉精品网在线| 90打野战视频偷拍视频| 一边亲一边摸免费视频| 亚洲av综合色区一区| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 国产片内射在线| 久久久久久人妻| 男女免费视频国产| 色视频在线一区二区三区| 少妇精品久久久久久久| 最新的欧美精品一区二区| 亚洲成人手机| 成年女人在线观看亚洲视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 国产精品三级大全| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 国产免费一级a男人的天堂| 天堂8中文在线网| 涩涩av久久男人的天堂| 国产永久视频网站| 亚洲精品av麻豆狂野| 天天影视国产精品| 日本色播在线视频| 免费日韩欧美在线观看| 久久鲁丝午夜福利片| 精品午夜福利在线看| 国产69精品久久久久777片| 国产av码专区亚洲av| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 丝袜美足系列| 久热这里只有精品99| 在线看a的网站| 久久ye,这里只有精品| 亚洲图色成人| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产成人91sexporn| 天堂俺去俺来也www色官网| 国产有黄有色有爽视频| 天堂8中文在线网| 国产色婷婷99| av福利片在线| 久久精品夜色国产| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 夫妻午夜视频| av不卡在线播放| 午夜久久久在线观看| a级毛色黄片| 考比视频在线观看| 一级片免费观看大全| 黄色毛片三级朝国网站| 18禁动态无遮挡网站| 免费高清在线观看日韩| 多毛熟女@视频| 国产老妇伦熟女老妇高清| 两个人免费观看高清视频| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 午夜免费鲁丝| 国产在线一区二区三区精| 国产熟女欧美一区二区| 少妇的丰满在线观看| 免费日韩欧美在线观看| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 香蕉丝袜av| 日韩中文字幕视频在线看片| 成年人午夜在线观看视频| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 成人国产麻豆网| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 伊人久久国产一区二区| 波野结衣二区三区在线| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品国产综合久久久 | 国产精品秋霞免费鲁丝片| 久久精品国产综合久久久 | 十分钟在线观看高清视频www| av电影中文网址| 新久久久久国产一级毛片| 99视频精品全部免费 在线| 大码成人一级视频| 99久久精品国产国产毛片| 亚洲精品一区蜜桃| 国产熟女欧美一区二区| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品一区www在线观看| h视频一区二区三区| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日韩大片免费观看网站| 卡戴珊不雅视频在线播放| 乱人伦中国视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 成人无遮挡网站| 一个人免费看片子| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 香蕉国产在线看| 亚洲情色 制服丝袜| 超碰97精品在线观看| 久久久久精品人妻al黑| 国产一区二区三区av在线| 亚洲情色 制服丝袜| 欧美成人精品欧美一级黄| 中国美白少妇内射xxxbb| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 日日摸夜夜添夜夜爱| 免费少妇av软件| freevideosex欧美| 精品第一国产精品| 飞空精品影院首页| 久久国产精品大桥未久av| 在线观看三级黄色| 亚洲人与动物交配视频| 国产精品人妻久久久久久| 欧美日韩精品成人综合77777| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲第一av免费看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产片内射在线| 香蕉精品网在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 飞空精品影院首页| 99精国产麻豆久久婷婷| 日韩三级伦理在线观看| 亚洲国产色片| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 欧美性感艳星| 亚洲精品国产av蜜桃| 女性生殖器流出的白浆| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 亚洲人成网站在线观看播放| 蜜臀久久99精品久久宅男| 亚洲精品久久午夜乱码| 韩国精品一区二区三区 | 99久久综合免费| videos熟女内射| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 日韩av免费高清视频| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产毛片在线视频| 精品国产一区二区久久| 99久久综合免费| 天天影视国产精品| 成人亚洲欧美一区二区av| 一级片'在线观看视频| 妹子高潮喷水视频| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产麻豆69| 男人爽女人下面视频在线观看| 日韩一区二区视频免费看| av播播在线观看一区| 丰满少妇做爰视频| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 免费大片黄手机在线观看| 一区二区av电影网| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 成年动漫av网址| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产1区2区3区精品| 国产日韩欧美在线精品| 18在线观看网站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 少妇精品久久久久久久| 男女下面插进去视频免费观看 | 人妻 亚洲 视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 免费观看无遮挡的男女| 在线观看一区二区三区激情| 久久久亚洲精品成人影院| 丝袜美足系列| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 高清欧美精品videossex| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 一级毛片电影观看| 国产精品蜜桃在线观看| 99国产综合亚洲精品| 日韩av免费高清视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 亚洲欧洲国产日韩| 精品国产国语对白av| 国产高清三级在线| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产男女内射视频| 激情视频va一区二区三区| 深夜精品福利| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 人妻人人澡人人爽人人| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 久久久亚洲精品成人影院| 免费大片18禁| 亚洲成人一二三区av| 亚洲经典国产精华液单| 国产一区二区在线观看av| 亚洲欧美清纯卡通| 午夜影院在线不卡| 交换朋友夫妻互换小说| 国产综合精华液| 国产成人欧美| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 国产成人欧美| 欧美日韩综合久久久久久| 国国产精品蜜臀av免费| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产成人精品福利久久| 国产麻豆69| www日本在线高清视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| a级毛片在线看网站| 国产精品欧美亚洲77777| 少妇熟女欧美另类| 性高湖久久久久久久久免费观看| 七月丁香在线播放| 一二三四在线观看免费中文在 | 色网站视频免费| 亚洲内射少妇av| 激情视频va一区二区三区| 久久久久精品人妻al黑| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲精品美女久久av网站| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 亚洲国产欧美在线一区| 国产乱来视频区| 国产一区二区三区综合在线观看 | 免费黄网站久久成人精品| 久久人妻熟女aⅴ| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | av在线播放精品| 亚洲国产精品国产精品| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一边亲一边摸免费视频| 三级国产精品片| 伦理电影大哥的女人| av又黄又爽大尺度在线免费看| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品人妻在线不人妻| 看非洲黑人一级黄片| 一区二区三区乱码不卡18| 热99久久久久精品小说推荐| 日韩制服骚丝袜av| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 九九在线视频观看精品| 亚洲内射少妇av| 中文字幕制服av| 久久99一区二区三区| 日本av手机在线免费观看| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品久久久精品久久久| 蜜桃在线观看..| 草草在线视频免费看| 熟女人妻精品中文字幕| 国产在线免费精品| 男女边吃奶边做爰视频| 内地一区二区视频在线| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品久久精品一区二区三区| 乱码一卡2卡4卡精品| 超色免费av| 久久久久网色| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 我的女老师完整版在线观看| 另类精品久久| 国产精品久久久久久久电影| 久久久国产欧美日韩av| 欧美日韩综合久久久久久| av天堂久久9| 亚洲精品一区蜜桃| 午夜日本视频在线| 咕卡用的链子| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 亚洲成国产人片在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 大话2 男鬼变身卡| 久久97久久精品| 国产av一区二区精品久久| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 免费黄色在线免费观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 青春草亚洲视频在线观看| 性色av一级| 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美精品一区二区免费开放| www.熟女人妻精品国产 | 成人毛片a级毛片在线播放| 9色porny在线观看| 国产成人精品一,二区| av福利片在线| 三级国产精品片| 国产免费福利视频在线观看| 美女福利国产在线| 国产淫语在线视频| 我的女老师完整版在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 欧美bdsm另类| 一级毛片我不卡| 欧美激情国产日韩精品一区| 日韩中文字幕视频在线看片| 中文字幕亚洲精品专区| freevideosex欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| videosex国产| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 日韩视频在线欧美| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 丝袜在线中文字幕| 午夜日本视频在线| 99久久精品国产国产毛片| 少妇高潮的动态图| 久久热在线av| 另类亚洲欧美激情| 国产精品人妻久久久影院| 亚洲国产精品国产精品| 日本av免费视频播放| 国产 精品1| 亚洲成人av在线免费| 国产av国产精品国产| 久久亚洲国产成人精品v| 有码 亚洲区| 免费少妇av软件| 视频区图区小说| 妹子高潮喷水视频| 22中文网久久字幕| 国内精品宾馆在线| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久99热这里只频精品6学生| 成人午夜精彩视频在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 中文字幕制服av| 大香蕉久久成人网| 国产亚洲精品久久久com| 欧美最新免费一区二区三区| 成人漫画全彩无遮挡| av视频免费观看在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 香蕉精品网在线| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩 亚洲 欧美在线| 日本黄大片高清| 一本大道久久a久久精品| 亚洲中文av在线| 久久97久久精品| 国产毛片在线视频| av天堂久久9| 亚洲国产看品久久| 国产精品人妻久久久影院| 中文字幕制服av| 欧美日韩精品成人综合77777| 少妇熟女欧美另类| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品熟女久久久久浪| 在线天堂最新版资源| 咕卡用的链子| 插逼视频在线观看| 精品国产国语对白av| 亚洲人成77777在线视频| 卡戴珊不雅视频在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 在线观看国产h片| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 日韩三级伦理在线观看| 老女人水多毛片| 久久久久视频综合| 久久久a久久爽久久v久久| 成人国产麻豆网| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻人人澡人人看| 中文字幕免费在线视频6| 国产极品粉嫩免费观看在线| 美女视频免费永久观看网站| av播播在线观看一区| 国产精品国产三级国产专区5o| 国产又爽黄色视频| 亚洲精品色激情综合| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 十分钟在线观看高清视频www| 乱码一卡2卡4卡精品| 我的女老师完整版在线观看| 国产色爽女视频免费观看| xxx大片免费视频| 午夜福利乱码中文字幕| 欧美少妇被猛烈插入视频| 在线观看免费视频网站a站| av黄色大香蕉| 亚洲国产av影院在线观看| 新久久久久国产一级毛片| 最近最新中文字幕免费大全7| 97在线人人人人妻| 最近最新中文字幕免费大全7| 国产精品久久久av美女十八| 一边亲一边摸免费视频| 国产午夜精品一二区理论片| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 亚洲性久久影院| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 中文字幕最新亚洲高清| 亚洲性久久影院| 黄色毛片三级朝国网站| 成人亚洲欧美一区二区av| 国内精品宾馆在线| 视频在线观看一区二区三区| 一边摸一边做爽爽视频免费| 制服诱惑二区| 成年av动漫网址| 黑人高潮一二区| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久影院123| 黄色一级大片看看| 亚洲精品国产av成人精品| 人成视频在线观看免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 欧美精品一区二区免费开放| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 中国三级夫妇交换|