基于微流控技術的細菌快速檢測技術研究

（齊齊哈爾醫(yī)學院醫(yī)學技術學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

1 微流控芯片簡介

微流控芯片（microfluidic chip）也稱微全分析系統(tǒng)（Miniatrized Total Analysis System，μ-TAS），它是一種以在微米尺度空間對流體進行操控為主要特征的技術產(chǎn)品，在一塊芯片上利用可控流體在芯片中流動的原理完成采樣、稀釋、加試劑、反應、分離、檢測等功能，形成一種將實驗室中常規(guī)化學或生物實驗集中在一起的多功能技術平臺[1]。微流控芯片技術具有易自動化、試劑消耗少、分離率高、操作簡單、裝置便攜化等突出優(yōu)點[2]，因而被廣泛應用于生命科學的眾多領域。

2 傳統(tǒng)的微生物檢測技術

傳統(tǒng)細菌檢測方法主要包括直接涂片觀察、使用選擇/鑒定培養(yǎng)基分離鑒定微生物、分子生物學鑒定和血清學鑒定，但微生物的檢測金標準仍然是培養(yǎng)法[8]。平板培養(yǎng)法在各個領域有著廣泛的應用，根據(jù)細菌的代謝特點，在培養(yǎng)基中加入指示劑，通過顏色變化測定細菌的種類，但該法耗時、操作繁瑣、靈敏性較低。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA），在微生物的檢測中應用廣泛，是利用抗原－抗體發(fā)生特異性反應來檢測微生物的方法[3]，具有快速、特異的優(yōu)點，但操作繁瑣、試劑樣品耗量大，在樣品配置、濃縮等步驟耗時較長。聚合酶鏈反應（PCR）是一種體外特異性DNA 片段擴增的技術，可以實現(xiàn)目標核酸分子的絕對定量，操作簡便、快速，具有高度的特異性以及靈敏性，可達到分子生物學在定量分析中重復性和準確性的要求，但本方法在檢測前，需要有復雜的樣品處理過程，如果處理不當以及變性不徹底極易出現(xiàn)假陰性，并且微生物是否存活無法判定，這是造成假陽性出現(xiàn)的原因。

3 微流控芯片檢測技術應用于微生物檢測

微流控芯片與介質(zhì)之間有良好的電絕緣性、散熱性、光學性能、可修飾性和生物相容性，可以固載生物大分子，對檢測信號干擾極小，其制作工藝簡單，成本低廉，裝置具有微型化、分析通量高、反應時間短及樣品和試劑消耗量少的特點。

3.1 電化學芯片

細菌懸液在負壓吸引的作用下，一般會通過檢測樣孔，此時，由于細菌的體積大小、表面性質(zhì)等存在差異性，必然會形成不一樣的脈沖信號。通過放大、篩選后累計記錄，能夠?qū)⒚}沖信號轉(zhuǎn)換成細菌數(shù)量、類型等不同的信息。這些年來，電阻抗技術逐漸與微流控芯片研發(fā)相融合，將其應用到細菌檢測領域中，能夠?qū)崿F(xiàn)動態(tài)監(jiān)測交叉電極室的細菌累積情況。該系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)自動化集中處理，并利用計算機遠程控制，對電阻抗的變化情況進行記錄，由此來完成細菌檢測工作。電化學芯片具有靈敏、快速等檢測細菌的優(yōu)點，細菌通過檢測孔時細菌懸液已經(jīng)過負壓吸引，細菌不同的體積大小、不同的表面形狀產(chǎn)生的脈沖信號，經(jīng)放大、分選后累加記錄，細菌數(shù)量和種類等相關信息被脈沖信號反應出來。與傳統(tǒng)的電阻抗芯片相比，電化學芯片可以降低被檢測細菌的濃度。

3.2 基因芯片

基因芯片的研發(fā)是推動快速、精準檢測的一個重要力量。該檢測技術是在雜交測序方法基礎上拓展而成的，將某種已知的核酸探針固定于基質(zhì)上，待檢測菌的核酸序列與探針形成特異性反應后被捕獲，檢測核酸的探針序列依靠最大熒光強度的探針分布來確定?；蛐酒皇芡ǖ莱叽绲挠绊?，具有很高的準確度和靈敏度，微流控平臺結(jié)合PCR 技術則具有高通量、耗材少、耗時短、多分析模塊等優(yōu)勢。近年來，美國生物研發(fā)企業(yè)利用基因芯片分離擴增基因片段，由此創(chuàng)建全自動微生物分型系統(tǒng)，為基因芯片的產(chǎn)量化發(fā)展帶來了可能。

3.3 化學發(fā)光

拉曼廣譜屬于分子的振動廣譜，分子結(jié)構(gòu)的調(diào)整能夠通過拉曼光譜來呈現(xiàn)出來，同時能夠?qū)毦归_定性與定量分析。與傳統(tǒng)的光學檢測技術相比，增強拉曼光譜、微流控芯片的結(jié)合能夠大大提高細菌檢測效率?；瘜W發(fā)光的原理是利用化學反應過程中產(chǎn)生的光輻射現(xiàn)象。微流控芯片聯(lián)合化學發(fā)光檢測技術具有高靈敏度、操作簡便、抗光漂白等優(yōu)勢，并且，檢測不需要外來的光源，因而大大降低了對設備的要求，易于集成化和微型化。電化學發(fā)光既具有化學發(fā)光的優(yōu)點，發(fā)光試劑又可以通過電化學的方法循環(huán)使用，這符合微流控芯片的發(fā)展趨勢，在細菌快速、高效檢測方面的應用存在很大的發(fā)展空間。

3.4 環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated amplifica tion，LAMP）技術是用于基因診斷的恒溫擴增技術，在鏈置換型DNA 聚合酶的作用下，對目的基因進行特異、高效的復制，而且操作簡便，便于快速檢測[4]。環(huán)介導等溫技術在病毒、寄生蟲、耐藥基因的鑒定方面應用廣泛。LAMP 技術近些年受到學者們的廣泛關注，尤其在病毒、耐藥基因、細菌、真菌和寄生蟲的鑒定方面，其中在細菌檢測方面應用最為廣泛。Xia 等[5]設計的芯片靈敏性高，能同時檢測臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌、沙門菌、河流弧菌和副溶血弧菌，并且準確率達100%。

3.5 紙質(zhì)微流控芯片

紙質(zhì)微流控芯片是經(jīng)過多種加工修飾，能夠在紙上形成具有一定構(gòu)造的疏水程度不同的微細網(wǎng)絡通道[6]，具有極其便攜、價格低廉等優(yōu)點。但是由于其機械韌性較差，制作的方法復雜，制作的時間過長，因此不利于大規(guī)模生產(chǎn)。液體流速控制方法是紙質(zhì)微流控芯片的中心環(huán)節(jié)，胡付品等[6]采用紙片擴散法控制流速用來監(jiān)測細菌耐藥性，此方法較自動化儀器法實驗結(jié)果更可靠。

3.6 化學熒光芯片

化學熒光芯片是將特異性抗原抗體反應、熒光標記、熒光顯微鏡結(jié)合起來的檢測技術，能對細菌進行定性或定量分析。與傳統(tǒng)的方法相比，節(jié)省檢測時間、有良好的相容性。

3.7 非接觸電導檢測分析法

檢測器是一種可以檢測出色譜柱流出量的變化和組成成分的儀器，其中的電導檢測?是離子色譜中最為常用的檢測器。電導檢測器接觸式測量電極表面極易附著氣泡，電極表面易玷污，取而代之的是非接觸電導檢測。其優(yōu)點：①非接觸電導檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，穩(wěn)定性好，線性范圍更寬；②有高速、高效的檢測效果；③以微流控技術為基礎，具有集成化、高通量、低消耗、便攜化等特點；④避免電極與溶液直接接觸造成電極污染的問題。

3.8 介電泳分離技術

介電泳技術的特點就在于具有操作方便、響應速度快、非接觸、易于實現(xiàn)微型化和自動化等優(yōu)點。

3.9 化學發(fā)光免疫分析法

它具有以下優(yōu)點：①不需要激發(fā)光源；②可以避免使用復雜的光路；③具有極高的靈敏度。

4 微流控芯片的發(fā)展趨勢及展望

微流控芯片的研究都以某種材料為研究對象進行深層次的研究，但在材料方面多樣性和不同的模具類型和模具材料的研究較少，并且現(xiàn)存在多種研究過程中的問題有待于進一步解決。

4.1 發(fā)展趨勢

微流控技術在細胞生物學及細胞分析研究中發(fā)揮著不可替代的作用，相較于傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)方法，微流控芯片上的細胞培養(yǎng)能夠在時間和空間上使細胞所處的微環(huán)境與體內(nèi)相似，從而獲得更真實可靠的結(jié)果。微流控技術在心肌損傷標志物檢測和與臨床相關的多種生化指標監(jiān)測等方面持續(xù)發(fā)展，在重要標志物的快速篩查和心血管疾病早期預警等方面具有應用潛力。微流控芯片在病原體檢測中的應用研究已初有成效，部分設備已接近或達到臨床應用的要求。

4.2 展望

微流控技術能夠為細菌檢測事業(yè)的發(fā)展帶來極大的推動力。并且，微流控芯片在新藥物的合成與篩選、生物醫(yī)學、食品和商品檢驗、環(huán)境監(jiān)測、軍事科學、刑事科學和航天航空科學等多個領域都有具體應用，微流控芯片的應用還在DNA 測序、核酸分離和定量、基因差異表達分析和基因突變等方面受到關注。此外，微流控芯片也可用于檢測染色體DNA 的序列多態(tài)型基因變異的位點及特征等，或是用于研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分離以及病原微生物的檢測等領域。通過檢測后，設計和選擇出合適的核酸探針，之后通過PCR 擴增獲得病原微生物種屬、毒力、致病、亞型、抗藥、多態(tài)型、同源性、變異和表達等信息。微流控芯片中的反應體系體積小，對傳感器的靈敏度和穩(wěn)定性要求更高。特別是檢測技術與分析芯片的集成，更是未來研究的趨勢，需要付出更多努力來促進微流控細菌檢測的發(fā)展。希望隨著微流控芯片技術不斷的發(fā)展，其能替代更多的檢測儀器，成為我們生活中高效、便攜的檢測產(chǎn)品。同時，隨著3D 打印技術的不斷升級，將微流控芯片與其相結(jié)合，創(chuàng)建仿生實驗室，通過構(gòu)建感染器官模型，模擬細菌在體內(nèi)生活的微環(huán)境，可對臨床分析細菌的病理特點及生理機制等提供參考與支持，這將給臨床醫(yī)學的全面發(fā)展帶來極大的推動力。