新型鴨呼腸孤病毒病研究進(jìn)展

謝碧林 林志敏 林彬彬 翁漢東 王秀禎 莆田市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建莆田 351144

新型鴨呼腸孤病毒病是由一種有別于番鴨呼腸孤病毒的新型鴨源病毒引起的， 可引起番鴨、 半番鴨、麻鴨和北京鴨等水禽發(fā)病[1-5]，臨床上表現(xiàn)為肝臟不規(guī)則塊狀或斑狀壞死、出血性混雜、法氏囊出血以及脾臟不同程度壞死為特征的新疫病，命名為“新肝病”或“鴨出血性壞死性肝炎”。 研究表明，該病是由一種RNA 病毒引起的，該病毒分類(lèi)為呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬新型呼腸孤病毒[1]。 由于呼腸孤病毒的基因組屬于多節(jié)段RNA， 容易發(fā)生基因突變，出現(xiàn)新的致病毒株可能性大大增加，給水禽養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)新的危害。 本文對(duì)新型呼腸孤病毒病研究現(xiàn)狀進(jìn)行梳理，綜述如下。

1 病原學(xué)

1.1 病原特性 新型鴨呼腸孤病毒直徑70 nm 左右，在電鏡下呈球形，二十面體對(duì)稱(chēng)，無(wú)囊膜，雙層衣殼結(jié)構(gòu)。分離毒不能凝集鴿、雞、鴨、鵝、兔、鼠和人O型紅細(xì)胞[1,6]。

該病原核酸在SDS-PAGE 電泳圖譜中具有禽呼腸孤病毒（ARV）的特征：有10 個(gè)RNA 片段，按片段大小可分為三類(lèi)即大片段、中片段和小片段，分別標(biāo)識(shí)為L(zhǎng)1-L3、M1-M3、S1-S4； 其電泳圖譜與ARV相似，與MDRV 差異較大[1,6]。 L、M 和S 基因組片段分 別 表 達(dá) λA、λB、λC、μA、μB、μN(yùn)S、σC、σA、σB、σNS 等10 種蛋白，S1 基因含有三個(gè)開(kāi)放閱讀框，分別表達(dá)P10、P18 和σC。 NDRV 基因組表達(dá)的蛋白中，除了μN(yùn)S、P10、P18 和σNS 四種非結(jié)構(gòu)蛋白外，其余的都是結(jié)構(gòu)蛋白， 這些蛋白在病毒繁殖周期的各個(gè)階段具有重要的作用[7]。

1.2 理化特性 NDRV 對(duì)FUDR、氯仿等不敏感，對(duì)胰蛋白酶中度敏感， 對(duì)pH3、 紫外線、 甲醛和熱敏感[1,6]。

1.3 致病性 1 日齡雛番鴨、 雛半番鴨人工感染NDRV 分離毒后， 均能復(fù)制出與自然病例相同的臨床癥狀和病理變化。主要剖檢特征為肝臟出血壞死，心臟出血，法氏囊和腎臟出血[1,6]。分離毒對(duì)雛番鴨和雛半番鴨的致死率分別為20%～53%和13%～33%。攻毒試驗(yàn)顯示， 其發(fā)病率和病死率與攻毒劑量呈正相關(guān)， 且爪墊接種攻毒較口鼻和腿肌接種攻毒更敏感；相對(duì)于雛半番鴨，雛番鴨對(duì)病毒更敏感，而雛雞和雛鵝對(duì)NDRV 不敏感[8-9]。

NDRV 分 離 株 能 在AD293、CEF、MDEF、Vero、MDCK、Marc145、ST、BHK-21 等單細(xì)胞中增殖并產(chǎn)生巨融合狀細(xì)胞病變， 但NDRV 分離株在PK、DF1細(xì)胞中盲傳3 代均未出現(xiàn)病變[9-10]。

2 流行病學(xué)

各品種鴨均可發(fā)生，且一年四季均可發(fā)??；發(fā)病日齡為5～25 日齡，大部分在5～10 日齡發(fā)病；病程5～7 d，發(fā)病率5%～15%、病死率2%～13%，感染日齡越小或并發(fā)其它疫病時(shí)，發(fā)病率和病死率會(huì)更高[1]。

林鋒強(qiáng)等采用分離株攻擊1 日齡雛鴨， 以研究新型鴨呼腸孤病毒在番鴨體內(nèi)分布和排毒規(guī)律。 應(yīng)用RT-PCR 檢測(cè)番鴨攻毒后的相關(guān)樣本，了解病原在番鴨體內(nèi)分布規(guī)律。 結(jié)果顯示在攻毒后12 h，病毒在血液、脾、胸腺、肝、法氏囊中分布；攻毒后1 d在心、肺、腎、盲腸扁桃體、腦組織中分布。 攻毒后1 d 即可在喉頭和泄殖腔棉拭子中檢測(cè)到病毒核酸，而在12 d 后已不能檢出。 表明番鴨接種毒株后1 d 開(kāi)始向外界排毒，12 d 后停止排毒，向外界排毒時(shí)間為PI 1 d～9 d，其中3～6 d 是排毒高峰期[11-12]。

對(duì)主要發(fā)病日齡(3～15 日齡)的番鴨進(jìn)行NDRV核酸檢測(cè)，檢出率最高的是脾，可達(dá)100%，其次是肝、心和法氏囊。因此，肝、脾可作為病毒檢測(cè)和分離的首選臟器[11]。

3 病原學(xué)診斷

3.1 RT-PCR 方法 該方法是先應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶以RNA 為模板合成cDNA， 再以cDNA 為模板，在DNA 聚合酶作用下擴(kuò)增合成獲得目的片段。 具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)點(diǎn)，在動(dòng)物疾病臨床診斷上得到了廣泛的應(yīng)用。

王劭等[13]根據(jù)NDRV-NP03 株S3 基因全序列，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件， 設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，以NDRV 分離株的RNA 為模板， 建立了一種特異性強(qiáng)、 靈敏度高的NDRV 檢測(cè)方法。 該方法可以從NDRV 分離毒中擴(kuò)增出長(zhǎng)度為586 bp 的特異性核酸片段，靈敏度達(dá)到2 pg 病毒RNA，可應(yīng)用該檢測(cè)方法開(kāi)展NDRV 的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查。 孔豐等[14]參考NDRV S3 基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，建立起NDRV 的RT-PCR 檢測(cè)方法，該方法能特異地從NDRV 分離毒中擴(kuò)增到長(zhǎng)度為298 bp 的核酸片段，靈敏度可達(dá)83.4 pg 病毒RNA。

3.2 多重RT-PCR 方法 多重RT-PCR 方法是在常規(guī)的RT-PCR 基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)。 在同一RT-PCR體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)檢測(cè)2 種以上病原核酸，它兼具快捷、高靈敏度及特異性等優(yōu)點(diǎn)。

孫曉軍等[15]根據(jù)鴨甲肝病毒（DHAV）的3D 基因序列和新型鴨呼腸孤病毒的S3 片段，建立可區(qū)分DHAV 和NDRV 的多重RT-PCR 檢測(cè)方法。 該方法對(duì)DHAV 和NDRV 的最低檢出量均為100 copies，臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果顯示， 該方法是一種快速鑒別診斷DHAV 和NDRV 感染的有效手段。

3.3 熒光定量RT-PCR 方法 熒光定量RT-PCR方法是在常規(guī)RT-PCR 反應(yīng)體系中改良發(fā)展起來(lái)的。 該方法通過(guò)熒光信號(hào)累計(jì)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RT-PCR 的整個(gè)進(jìn)程，最后與已經(jīng)制訂好的標(biāo)準(zhǔn)曲線比對(duì)，從而對(duì)監(jiān)測(cè)對(duì)象進(jìn)行定量分析的方法。 它融合了常規(guī)RT-PCR 技術(shù)靈敏、快速、特異的特點(diǎn)以及光譜探測(cè)技術(shù)的高敏感性和定量精確等優(yōu)點(diǎn)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量精確等優(yōu)點(diǎn)。

丁明洋等[16]根據(jù)GenBank 中呼腸孤病毒S1 基因全序列， 設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物， 建立SYBR Green II 熒光定量PCR 檢測(cè)方法， 檢測(cè)反應(yīng)在101～108copies/uL 具有良好的線性關(guān)系， 反應(yīng)的檢出下限為10 copies/uL，具有較高的敏感性和特異性。 韓宏宇等[12]根據(jù)NDRV 的S1 基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了基于SYBR Green I 的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 檢測(cè)方法，敏感性試驗(yàn)顯示，該方法最低可檢出15 copies 的病毒cDNA， 其病毒最低檢出量為0.5 TCID50，具有良好的特異性和重復(fù)性。

3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）能在等溫（60～65 ℃）條件下，短時(shí)間內(nèi)（通常是1 h 內(nèi)）進(jìn)行核酸擴(kuò)增。 與常規(guī)PCR 相比，不需要模板的熱變性、 溫度梯度循環(huán)、 電泳及紫外觀察等過(guò)程，是一種“簡(jiǎn)便、快速、精確、低價(jià)”的基因擴(kuò)增方法。

蔡躍佳等[17]針對(duì)新型鴨呼腸孤病毒保守序列設(shè)計(jì)特異性引物， 將RT-LAMP 技術(shù)與熒光染料鈣黃綠素結(jié)合， 建立NDRV 鈣黃綠素可視化RT-LAMP快速檢測(cè)方法，并對(duì)該方法的反應(yīng)溫度、時(shí)間及體系進(jìn)行優(yōu)化。該方法可特異性檢測(cè)出NDRV，最低檢測(cè)限約為200 fg，且讀取結(jié)果方便、直觀。 于可響等[18]基于NDRV S3 基因的6 個(gè)保守區(qū)域設(shè)計(jì)4 條LAMP 引物，建立一步反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RTLAMP） 方法， 該方法具有良好的特異性， 對(duì)病毒RNA 的最低檢出量為0.1 pg，是常規(guī)RT-PCR 方法的100 倍，適于基層實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。

4 血清學(xué)診斷

王錦祥等[19]為建立快速檢測(cè)新型鴨呼腸孤病毒病抗體的方法， 以純化的重組σC 蛋白作為包被抗原，并對(duì)該方法的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了NDRV間接ELISA 抗體檢測(cè)方法。該方法僅對(duì)NDRV 血清檢測(cè)為陽(yáng)性，具有良好的特異性；其批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，具有良好的重復(fù)性。利用建立的σC 蛋白間接ELISA 方法對(duì)80 份疑似鴨血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示與NDRV 全病毒間接ELISA 的符合率為88.75%。 該ELISA 方法為NDRV 的流行病學(xué)調(diào)查提供了快速、 特異的血清學(xué)檢測(cè)方法。之后，王錦祥等[20]對(duì)以上檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，增加NDRV NP03 株的重組σB 蛋白作為包被抗原， 重新建立檢測(cè)該病抗體的間接ELISA 方法，與NDRV 全病毒間接ELISA 相比較， 符合率高達(dá)92.5%，進(jìn)一步豐富了該病抗體的檢測(cè)方法。

陳海鵬[21]利用pET-28a 原核表達(dá)系統(tǒng)成功地表達(dá)了新型呼腸孤病毒σC 蛋白并純化， 用純化后的σC 蛋白作為包被抗原， 建立了具有良好特異性、重復(fù)性和敏感性的N-MDRV 間接ELISA 檢測(cè)方法。對(duì)臨床送檢的血清樣品進(jìn)行檢測(cè)， 檢出率達(dá)到98.5%。

Yun T 等[22]克隆NDRV 的外衣殼（σC）并作為包衣抗原建立一種高靈敏度、 特異性間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ELISA） 方法檢測(cè)抗體， 可用于大規(guī)模的NDRV 感染血清學(xué)調(diào)查和抗體滴度監(jiān)測(cè)。

5 防治措施

5.1 滅活疫苗 滅活苗是指先對(duì)病原進(jìn)行培養(yǎng)，然后用加熱或化學(xué)劑(通常是福爾馬林)將其滅活，但仍保留其免疫原性， 注射后能使動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)該病原的特異抵抗力。

陳仕龍等[23-24]以NDRV JM85 株為種毒研制安全、有效的油佐劑滅活苗，并通過(guò)免疫血清學(xué)檢測(cè)及攻毒保護(hù)試驗(yàn)評(píng)價(jià)疫苗效果。結(jié)果顯示，麻鴨二免后28 d 能夠產(chǎn)生較高的中和抗體， 并能較長(zhǎng)時(shí)間維持，且其子代雛鴨體內(nèi)具有一定的母源抗體，能夠抵抗強(qiáng)毒的攻擊。 該疫苗可用于防控鴨新型呼腸孤病毒病。為了提升該病滅活苗的免疫效果，陳仕龍等采用透析的辦法對(duì)病毒尿囊液中抗原進(jìn)行濃縮， 提高了抗原濃度。 分別采用病毒尿囊液和濃縮后病毒尿囊液為抗原研制濃縮疫苗， 開(kāi)展兩者免疫原性對(duì)比試驗(yàn)。 通過(guò)對(duì)比得知，濃縮疫苗安全性好、免疫效果好；濃縮疫苗免疫雛鴨后的免疫保護(hù)性達(dá)100%。 表明濃縮疫苗安全、高效，在雛鴨上具有良好的免疫保護(hù)效果，具有良好的市場(chǎng)前景。

5.2 重組載體疫苗 重組載體疫苗是將病原體中可編譯有效免疫原的基因片段通過(guò)生物技術(shù)手段插入載體基因組中， 接種后隨含有該重組載體的疫苗株在體內(nèi)不斷增殖， 實(shí)現(xiàn)該有效抗原在體內(nèi)表達(dá)的目標(biāo)。

Zhu Y 等[25]為研制新型鴨呼腸孤病毒病疫苗，將NDRV 的σC 基因克隆到塞姆利基森林病毒(SFV)復(fù)制子載體pSCA1 中，構(gòu)建了一種基于該復(fù)制子的自殺性DNA 疫苗，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)。 結(jié)果表明，雛鴨可誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗體、中和抗體、IFN-γ和IL-4。 此外，所有雛鴨都受到NDRV 野毒攻擊的保護(hù)。

5.3 重組亞單位疫苗 重組亞單位疫苗是指將保護(hù)性抗原基因在原核或真核細(xì)胞中表達(dá)， 并以基因產(chǎn)物-蛋白質(zhì)或多肽制成疫苗。

梅敏敏等[26]根據(jù)NDRV XX 株σB 基因編碼序列構(gòu)建原核表達(dá)載體， 成功表達(dá)出約55 kU 的融合蛋白。 經(jīng)Ni2+柱親和層析純化獲得可溶性重組蛋白，經(jīng)Western blotting 和蛋白質(zhì)譜鑒定為高純度的σB重組蛋白。 NDRV σB 蛋白的成功表達(dá)，為其功能的深入研究及基因工程疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

畢莊莉[27]用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)和桿狀病毒真核表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了NDRV （NDRV TH11 株）σC 蛋白，獲得的蛋白具有良好的免疫原性。 應(yīng)用桿狀病毒表達(dá)的σC 蛋白制備疫苗，免疫1 周齡雛鴨，免疫2 周后使用NDRV 強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，發(fā)現(xiàn)免疫組得到良好的保護(hù)性，保護(hù)率可達(dá)70%。 該蛋白可為后期研制有效的新型鴨呼腸孤病毒病疫苗提供了基礎(chǔ)。

Bi Z 等[28]構(gòu)建了含有NDRV σC 基因的重組桿狀病毒，純化后的蛋白作為亞單位疫苗的抗原。根據(jù)體液免疫反應(yīng)、細(xì)胞免疫反應(yīng)和對(duì)NDRV 攻毒的免疫保護(hù)來(lái)評(píng)估σC 疫苗的療效。 結(jié)果表明， 用重組σC 蛋白免疫的所有雛鴨均能產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。此外，還觀察到免疫后的雛鴨對(duì)致死劑量NDRV TH11 菌株攻毒的100%保護(hù)。結(jié)果顯示，重組σC 蛋白可以作為疫苗的候選蛋白。

6 致病機(jī)制

Xiao R 等[29]利用共免疫沉淀法、GST pull-down試驗(yàn)和共聚焦顯微鏡研究σC 與宿主的易位相關(guān)膜蛋白1（TRAM1）之間的相互作用，分別通過(guò)RNA 干擾敲除TRAM1 基因和過(guò)表達(dá)TRAM1 基因， 探討σC 對(duì)病毒復(fù)制的影響。結(jié)果表明，TRAM1 沉默有利于抑制病毒復(fù)制， 證實(shí)TRAM1 在NDRV 感染中的重要作用。

Chen X 等[30]對(duì)3 日齡雛鴨接種NDRV NP03 株和注射無(wú)菌Hank's 溶液以比較雛鴨盲腸內(nèi)的微生物菌群情況，結(jié)果顯示，相對(duì)于對(duì)照組，接種NDRV NP03 株的試驗(yàn)組雛鴨腸道細(xì)菌的相對(duì)豐度發(fā)生變化， 尤其是瘤胃球菌科和毛螺旋菌科的細(xì)菌顯著減少，而志賀氏桿菌明顯增多。 所以，番鴨感染NDRV可導(dǎo)致腸道菌群改變， 包括益生菌凈損失與致病菌代償性擴(kuò)張，這些結(jié)果為NDRV 的潛在致病機(jī)制提供了新的見(jiàn)解。

7 小結(jié)與展望

當(dāng)前， 對(duì)新型呼腸孤病毒的研究報(bào)道主要集中在NDRV 的小片段基因上， 關(guān)于σC、σB 蛋白的研究相對(duì)比較深入，而NDRV 致病機(jī)制方面的研究報(bào)道相對(duì)較少。

目前認(rèn)為呼腸孤病毒σC 蛋白在病毒致病機(jī)制上具有多重功能，且該蛋白是NDRV 唯一能與宿主細(xì)胞吸附的蛋白， 為病毒入侵細(xì)胞提供前提條件[31-34]。σC 蛋白攜帶有特異性中和反應(yīng)的表面抗原，能夠產(chǎn)生中和抗體， 該蛋白將是研制亞單位疫苗的候選蛋白。 由于呼腸孤病毒科的核酸屬于多節(jié)段基因， 以及RNA 聚合酶缺乏矯正功能， 導(dǎo)致病毒容易發(fā)生基因重組或抗原變異， 產(chǎn)生新的致病性菌株[35-36]，呼腸孤病毒的這個(gè)特性為研制有效的疫苗提出了挑戰(zhàn)。 Du X 等[37]研制了一種具有廣譜抗病毒活性的金絲桃素（HY）與具有高載藥量和低細(xì)胞毒性的氧化石墨烯（GO）復(fù)合物，并研究該復(fù)合物（GO/HY） 在DF-1 細(xì)胞和NDRV TH11 株感染雛鴨體內(nèi)的抗病毒活性。 結(jié)果提示GO/HY 對(duì)NDRV 具有體內(nèi)外抗病毒活性， 為開(kāi)發(fā)新型呼腸孤病毒病新療法提供新的探索。由于抗生素對(duì)病毒無(wú)治療作用，應(yīng)用疫苗預(yù)防該病毒的侵襲是最為經(jīng)濟(jì)有效的做法，研制安全、高效的疫苗仍然是當(dāng)前的研究重點(diǎn)。完善的NDRV 致病機(jī)制研究將在分子生物學(xué)水平上預(yù)防治療新型呼腸孤病毒病成為可能。