MyHC-2a基因在不同比例花椒籽飼喂育肥豬的組織差異表達分析

張亞麗，郭順萍，尚學(xué)峰，李 杰，黃曉宇,2，滾雙寶,2*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070）

近年來，受非洲豬瘟疫情的影響，我國豬肉價格一路飆升，養(yǎng)豬業(yè)作為我國畜牧業(yè)的支柱性產(chǎn)業(yè)，受到了越來越多的關(guān)注。隨著我國畜牧業(yè)的集約化、規(guī)?；l(fā)展，飼料原料成為制約養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要因素。我國作為世界上花椒種植規(guī)模最大、種類最全的國家，擁有大量的花椒資源?；ń纷鳛橹参镄燥暳希譃榛ń饭ず突ń纷褍刹糠?，花椒果皮是人們常用的食用調(diào)料，可以被充分利用，然而花椒籽作為花椒生產(chǎn)的主要副產(chǎn)物，并沒有得到充分利用，大量的花椒籽被隨意丟棄，造成了資源浪費?；ń纷褷I養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，油脂和蛋白質(zhì)含量高，是一種優(yōu)質(zhì)的飼料資源。目前，已有試驗證實用5%的花椒籽代替玉米作為能量飼料，對育肥豬生長性能和胴體品質(zhì)具有積極作用。

肌纖維是肌肉的基本組成單位，主要由肌球蛋白和肌動蛋白構(gòu)成，肌球蛋白由4條輕鏈（MLC）和2條重鏈（MyHC）構(gòu)成，豬的肌纖維根據(jù)肌球蛋白重鏈（MyHC）的多態(tài)性可分為1、2a、2b和2x四種類型，在代謝上分別與慢速氧化型、快速氧化型、快速酵解型和中間類型相對應(yīng)[1]。還有學(xué)者將肌纖維分為兩類，即氧化型和酵解型。氧化型肌纖維含有的細胞色素、線粒體和肌紅蛋白多，又被稱為紅肌纖維，酵解型的肌纖維中細胞色素、線粒體和肌紅蛋白少，被稱為白肌纖維。肌纖維類型及組成不僅決定豬骨骼肌的生長發(fā)育類型，而且影響豬肉的生物化學(xué)性質(zhì)和感官品質(zhì)，是預(yù)測家畜肉質(zhì)性狀的常用指標(biāo)[2]。以往學(xué)者應(yīng)用實時熒光定量技術(shù)比較了中國地方品種豬和引入豬種4種MyHC亞型mRNA在豬背最長肌和半膜肌中的表達水平差異性，初步揭示了肌纖維類型的組成和表達量對豬肉品質(zhì)具有內(nèi)在的影響作用，揭示了品種的特性[3]。也有學(xué)者通過研究得出豬的腰大肌與背最長肌相比，具有相對豐富的2a型和2x型肌纖維，擁有更少量的2b型肌纖維，因而肉的品質(zhì)更佳[4]。本試驗研究豬MyHC-2a基因的調(diào)控機制，通過熒光定量技術(shù)研究其在不同比例花椒籽飼喂的育肥豬各組織中的表達情況，為花椒籽作為豬飼料的應(yīng)用、今后豬肉品質(zhì)的改良和育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

以甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳繁殖實驗室保存的試驗組和對照組生長育肥豬的心、肝、脾、肺、腎、背肌等組織樣品作為試驗樣品。具體試驗過程如下：試驗選擇健康的90日齡杜×（長×大）三元豬288頭，預(yù)試驗7 d，隨機分為4組，每組4個重復(fù)，每個重復(fù)18頭，以飼喂基礎(chǔ)日糧為對照組，花椒籽等量代替2.5%、5%、7.5%的玉米飼糧，分別作為試驗組Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，飼喂期100 d，自由采食，飼喂期滿，屠宰。宰殺后，在無菌條件下，采集試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組和對照組的各組織樣品備用，迅速放于液氮中，保存在實驗室-80℃冰箱中。

1.2 主要試劑、耗材

Trizol試劑，PrimeScript ? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，育肥豬各組織的cDNA，MyHC-2a基因的上下游引物，無酶水，內(nèi)參等。

1.3 引物設(shè)計與合成

以GenBank中豬MyHC-2a基因核苷酸序列和氨基酸序列（NM_214136.1和NP_999301.1）為參考，采用NCBI中的Primer Premier 5.0設(shè)計MyHC-2a基因的熒光定量PCR特異性引物，引物由金唯智生物公司合成，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物設(shè)計

1.4 總RNA提取和cDNA合成

采用Trizol萃取法提取試驗組和對照組育肥豬的心、肝、脾、肺、腎和背肌等組織的總RNA，運用瓊脂糖凝膠電泳實驗和微量分光光度計分別檢測RNA的完整性和純度，將得到的cDNA保存在實驗室-20℃的冰箱中。

1.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量反應(yīng)體系為20 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，SYBR酶10 μl，RNase Free H2O補足至20 μl。熒光定量反應(yīng)條件為95℃，5 min；94℃，30 s；61℃，30 s；72℃，1 min；35個循環(huán)。每個組織做4個樣品，每個樣品同批次做3個復(fù)孔。以2-ΔΔCt法計算相對表達量，數(shù)據(jù)用SPSS 26.0軟件進行單因素方差分析，表達量的結(jié)果均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，最終結(jié)果通過Graphpad Prism 8.0以圖片的形式展現(xiàn)出來。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因擴增曲線

通過圖1和圖2可以得知，MyHC-2a基因和內(nèi)參基因在擴增時，指數(shù)期條帶走向一致且清晰，由此說明cDNA的濃度合適，適用于該試驗進行熒光定量分析。

圖1 MyHC-2a基因的擴增曲線

圖2 內(nèi)參基因的擴增曲線

2.2 基因溶解曲線

通過圖3和圖4可知，MyHC-2a基因和內(nèi)參基因的溶解曲線的多個重復(fù)均曲線一致性較好，沒有多余的雜帶出現(xiàn)，證明試驗設(shè)計的引物良好，適合后續(xù)的試驗分析。

圖3 MyHC-2a基因的溶解曲線

圖4 內(nèi)參基因的溶解曲線

2.3 MyHC-2a基因在不同組織中的表達分析

采用qPCR方法檢測對照組、試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組育肥豬各組織中MyHC-2a基因的表達情況。結(jié)果表明：在育肥豬的脾和肺組織中，試驗Ⅰ組中MyHC-2a基因的表達量均顯著高于對照組、試驗Ⅱ組和Ⅲ組，對照組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，而試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯；在育肥豬的心、腎和背肌等組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量均顯著高于試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，其中心組織中試驗Ⅰ組MyHC-2a基因的表達量高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，而試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯。在腎和背肌中，試驗Ⅰ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組，但試驗Ⅰ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯；在育肥豬的肝組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量均顯著高于試驗Ⅱ組和Ⅲ組，試驗Ⅱ組和Ⅲ組MyHC-2a基因的表達量差異不明顯（見圖5）。

圖5 對照組和試驗組育肥豬的不同組織中MyHC-2a基因的表達分析

3 討論

花椒作為優(yōu)質(zhì)的飼料資源，擁有豐富的油脂和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，且價格低廉，目前對于花椒籽的研究主要停留在蛋雞方面，在生豬方面研究很少。鮮凌瑾研究表明，添加1.0%的花椒籽有利于雛雞提高體重和飼料轉(zhuǎn)化率[5]。付興周等研究得出添加花椒籽粉能夠減慢肌肉pH下降的速度，從而延長鮮肉的保存時間[6]。

肌肉中肌纖維類型組成對肌肉功能及屠宰后肉品質(zhì)量產(chǎn)生重要影響，不同品種的豬肌肉組織因能量代謝方式不同，經(jīng)常會導(dǎo)致肌纖維類型分布不同，進而造成肉品質(zhì)差異較大[7]。有許多研究表明肌纖維的類型和組成會直接影響豬肉品質(zhì)，營養(yǎng)和品種等因素不會影響肌纖維的數(shù)量，只會影響肌纖維的類型轉(zhuǎn)化[8]。梁永飛等通過向生長育肥豬的飼料中添加一定比例的花椒籽實，得出添加花椒籽對育肥豬豬肉的肉色、脂肪酸結(jié)構(gòu)改善具有積極作用[9]。本次試驗結(jié)果表明：不同比例花椒籽飼喂育肥豬后，育肥豬的肝、脾和肺組織中MyHC-2a基因高表達，育肥豬的心和背肌組織中MyHC-2a基因低表達；在育肥豬的心、脾和肺等組織中，對照組和試驗Ⅰ組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅱ組和試驗Ⅲ組；在育肥豬的肝組織中，對照組MyHC-2a基因的表達量顯著高于試驗Ⅰ組、Ⅱ組和Ⅲ組，說明不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表達。MyHC-2a基因?qū)?yīng)的是紅肌纖維，楊海玲等研究表明，紅肌纖維含量高的肌肉不易產(chǎn)生PSE肉且紅肌纖維含有的脂類多，分解和積累脂肪的能力強，更易形成肥美多汁、品質(zhì)優(yōu)良的大理石花紋肉[10]。相類似的，歐秀瓊等研究表明，肌肉品質(zhì)與酵解型肌纖維含量的高低呈負(fù)相關(guān)，而氧化型肌纖維的含量越高，動物屠宰后胴體的肌肉顏色、風(fēng)味和多汁性等品質(zhì)越好[11]。辛雪等通過對巴美肉羊進行研究，得出MyHC-2a型肌纖維數(shù)量越多，肉質(zhì)越軟，剪切力越低[12]，Yanru Hou等人通過對蒙古羊的放牧組和禁閉組進行比較分析，也得到了相同的結(jié)果[13]。就肌纖維直徑而言，氧化型肌纖維（如MyHC-2a型）直徑較細，酵解型肌纖維（如MyHC-2b型）直徑較粗[14]。肌纖維直徑越小，面積越小，密度越大，肌肉剪切力越小，肉質(zhì)越好[15]。這些結(jié)果均說明MyHC-2a型肌纖維的表達量對肉質(zhì)的感官、色澤和口感都具有十分重要的作用。

4 結(jié)論

不添加花椒籽或添加2.5%的花椒籽有利于MyHC-2a基因的表達，添加5%或7.5%的花椒籽對MyHC-2a基因的表達有負(fù)面影響。本研究可為花椒籽的利用和將來深入探討MyHC-2a基因在改良肉質(zhì)和促進育肥豬肌肉的生長發(fā)育方面提供參考。