升溫方式對(duì)鰱魚(yú)肌球蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的影響

梁雯雯，楊 天，郭 建,，汪秋寬，叢?；?*，陳勝軍

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省水產(chǎn)品分析檢驗(yàn)及加工科技服務(wù)技術(shù)中心，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300）

隨著魚(yú)糜產(chǎn)業(yè)的飛速發(fā)展，魚(yú)糜需求量的上升，鰱魚(yú)（Hypophthalmichthys molitrix）作為四大淡水魚(yú)之一，因其產(chǎn)量豐富和價(jià)格低廉常用來(lái)生產(chǎn)淡水魚(yú)糜，從而提高鰱魚(yú)的附加值，并解決魚(yú)糜原料短缺的問(wèn)題。傳統(tǒng)魚(yú)糜熱處理方式為水浴二段加熱，一段式加熱魚(yú)糜在溫度50～65 ℃之間發(fā)生凝膠劣化，肌原纖維蛋白降解嚴(yán)重，因此，為避免凝膠劣化，行業(yè)中一般先采用5～40 ℃放置一段時(shí)間再90 ℃加熱一段時(shí)間進(jìn)行處理[1]。熱處理加工過(guò)程中，當(dāng)樣品中心溫度要求較高時(shí)，不同處理方式加熱至樣品目標(biāo)中心溫度的升溫時(shí)間差異顯著[2]，升溫過(guò)程的不同導(dǎo)致產(chǎn)品品質(zhì)不同這一結(jié)論已經(jīng)得到證實(shí)，但現(xiàn)有報(bào)道和實(shí)際熱加工生產(chǎn)中升溫過(guò)程往往被忽略，通常默認(rèn)為此階段樣品中心溫度已經(jīng)達(dá)到設(shè)定值，將升溫時(shí)間計(jì)入保溫時(shí)間。

微波加熱是一種新興的魚(yú)糜熟化方式。二段式微波加熱的魚(yú)糜凝膠強(qiáng)度明顯高于直接微波加熱[3]；閆虹[4]和Cao Hongwei[5]等發(fā)現(xiàn)先微波后水浴加熱（微波加熱代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴二段加熱的低溫段）產(chǎn)品的凝膠品質(zhì)低于水浴二段加熱，而先水浴加熱后微波加熱（微波加熱代替?zhèn)鹘y(tǒng)水浴二段加熱的高溫段）在提高白鰱魚(yú)糜凝膠特性方面，明顯優(yōu)于微波加熱，且均顯著優(yōu)于傳統(tǒng)水浴二段加熱，無(wú)論是保溫模式還是時(shí)間依賴(lài)模式都能明顯提高魚(yú)糜凝膠的品質(zhì)。目前研究對(duì)微波輔助水浴加熱的報(bào)道較少。肌球蛋白在魚(yú)糜凝膠化過(guò)程中起關(guān)鍵作用，基于交變電場(chǎng)變化的微波快速加熱更有利于肌球蛋白分子展開(kāi)，促進(jìn)肌球蛋白分子的聚集[6]。汪媛等[7]發(fā)現(xiàn)微波功率密度8 W/mL條件下，肌球蛋白分子在短時(shí)間（80 s）內(nèi)變性和聚集同時(shí)發(fā)生，而在2.67 W/mL條件下，肌球蛋白分子則呈現(xiàn)逐漸變性而后聚集的趨勢(shì)。

加熱方式不同引起的升溫速率差異導(dǎo)致魚(yú)糜蛋白變性和聚集程度不同[8]，在實(shí)際生產(chǎn)中傳統(tǒng)水浴二段加熱過(guò)程中往往忽略的升溫過(guò)程對(duì)肌球蛋白的影響尚未有研究。本實(shí)驗(yàn)比較分析了在傳統(tǒng)水浴二段加熱的低溫段和高溫段分別采取水浴升溫（water bath heating，WH）、微波升溫（microwave heating，MH）或微波輔助水浴升溫（microwave assisted water bath heating，MWH）對(duì)鰱魚(yú)肌球蛋白結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)的差異，以期為快速加熱方式在魚(yú)糜加工業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活白鰱購(gòu)于大連熟食品交易中心，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，宰殺后去頭去內(nèi)臟，用4 ℃去離子水沖洗干凈待用。

三磷酸腺苷（化學(xué)純） 美國(guó)Sigma公司；溴化鉀（光譜純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；三(羥甲基)氨基甲烷（生化試劑） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠；8807電子溫度計(jì) 得力集團(tuán)有限公司；HR/T20MM立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司；NEXUS670型傅里葉變換紅外光譜儀 美國(guó)PerkinElmer公司；Q20差示掃描量熱（differential scanning calorimeter，DSC）儀美國(guó)TA公司；Epoch2型酶標(biāo)儀、SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀美國(guó)伯騰儀器有限公司；F-2700熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；G80D23CSL-Q6格蘭仕微波爐 佛山市順德區(qū)格蘭仕微波爐電器有限公司；UV-9000型雙光束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

根據(jù)Cao Liwei等[9]的提取方法略作修改。手工剔取白鰱背部白肉，切成肉糜狀，加入10 倍體積的溶液A（0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris，pH 7.0）于4 ℃下漂洗10 min，3 000 r/min均質(zhì)，3 000 r/min離心5 min；沉淀于5 倍體積溶液B（0.45 mol/L NaCl、0.2 mol/L醋酸鎂、0.001 mol/L乙二胺四乙酸、0.02 mol/L Tris、0.005 mol/Lβ-巰基乙醇，pH 6.8）中懸浮，并加ATP至終濃度為0.005 mol/L，于4 ℃下放置2 h；8 000 r/min離心20 min，上清液加入3 倍體積溶液D（0.001 mol/L KHCO3）于4 ℃下放置15 min；9 000 r/min離心15 min取沉淀；沉淀加入2.5 倍體積的溶液C（0.5 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris、0.005 mol/Lβ-巰基乙醇，pH 7.5）懸浮，于4 ℃下放置10 min后加入2.5 倍體積的溶液D稀釋?zhuān)⒓覯gCl2至終濃度為0.01 mol/L，于4 ℃下放置過(guò)夜；10 000 r/min離心15 min，沉淀用1 倍體積溶液E（0.5 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris，pH 7.0）溶解，5 000 r/min離心10 min，取上清液，透析過(guò)夜，所得即為肌球蛋白。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)肌球蛋白純度。

1.3.2 肌球蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定

采用雙縮脲法[10]，使用Epoch2型酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取1 mL鰱魚(yú)肌球蛋白溶液，加入4 mL雙縮脲試劑并混合均勻，避光靜置30 min后測(cè)定540 nm波長(zhǎng)處的吸光度，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相應(yīng)的肌球蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3 升溫方式

將提取的肌球蛋白用含0.5 mol/L KCl的20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液稀釋成10 mg/mL，分別取稀釋后的肌球蛋白溶液25 mL于50 mL離心管中，按表1進(jìn)行加熱（溫度使用手持式電子溫度計(jì)測(cè)得）。WH：將離心管置于40 ℃或90 ℃的水浴鍋中，待樣品中心溫度升至40 ℃或90 ℃時(shí)停止加熱。MH：將離心管置于微波爐轉(zhuǎn)盤(pán)中心，微波間歇加熱（加熱10 s停10 s），待樣品中心溫度至40 ℃或90 ℃時(shí)停止加熱。MWH：將離心管放在裝有200 mL去離子水（20±2）℃的250 mL燒杯中，置于微波爐轉(zhuǎn)盤(pán)中心，微波間歇加熱（加熱10 s停10 s），待樣品中心溫度至40 ℃或90 ℃時(shí)停止加熱。

表1 肌球蛋白不同升溫方式Table 1 Different heating methods designed in this study

1.3.4 肌球蛋白理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.4.1 總巰基含量的測(cè)定

根據(jù)朱東宏等[11]的方法略作修改。取10 mg/mL肌球蛋白樣液0.5 mL，加入4.5 mL的Tris-HCl（0.2 mol/L Tris、8 mol/L尿素、質(zhì)量分?jǐn)?shù)2% SDS，10 mmol/L乙二胺四乙酸，pH 6.8）緩沖液，混勻后取混合液4 mL，加入0.4 mL的2-硝基苯甲酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%）溶液，40 ℃保溫25 min，于412 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按下式計(jì)算總巰基含量。

式中：A為412 nm波長(zhǎng)處的吸光度；D為稀釋倍數(shù)；ρ為蛋白質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.4.2 表面疏水性的測(cè)定

根據(jù)Benjakul等[12]的方法略作修改。將10 mg/mL樣品稀釋成0.1～0.5 mg/mL，然后取各質(zhì)量濃度肌球蛋白溶液2 mL加入10 μL 8-苯胺基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）（10 mmol/L ANS、20 mmol/L Tris，pH 7.5），混勻避光靜置10 min。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)肌球蛋白純度，使用Image J軟件分析計(jì)算。使用SynergyH1/H1M酶標(biāo)儀設(shè)置激發(fā)波長(zhǎng)303 nm、發(fā)射波長(zhǎng)485 nm、增益50。以熒光強(qiáng)度對(duì)肌球蛋白各質(zhì)量濃度作圖，所得直線斜率即為肌球蛋白表面疏水性系數(shù)（ANS-S0），以此表示表面疏水性。

1.3.4.3 濁度的測(cè)定

根據(jù)Liu Ru等[13]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成1 mg/mL，充分混勻后靜置20 min，于320 nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光度，以吸光度表示蛋白濁度。

1.3.4.4 溶解度的測(cè)定

根據(jù)周建中等[14]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成3 mg/mL，4 ℃放置30 min后10 000 r/min（4 ℃）離心10 min，雙縮脲法測(cè)上清液蛋白質(zhì)量濃度，用上清液蛋白質(zhì)量濃度與原始蛋白質(zhì)量濃度的百分比表示溶解度。

1.3.4.5 色氨酸熒光光譜分析

根據(jù)Li Yue等[15]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成1 mg/mL。使用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，設(shè)定激發(fā)光的起始波長(zhǎng)300 nm，熒光發(fā)射波長(zhǎng)280 nm，激發(fā)光的終止波長(zhǎng)450 nm，該條件下熒光強(qiáng)度為熒光圖譜中的峰值。

1.3.4.6 紫外吸收光譜分析

根據(jù)康懷彬等[16]的方法略作修改。將肌球蛋白樣液稀釋成0.5 mg/mL，以Tris-HCl緩沖液作為空白，進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，掃描速率10 nm/s，掃描波長(zhǎng)范圍190～600 nm。利用Origin軟件對(duì)紫外吸收光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算，并繪制二階導(dǎo)數(shù)圖譜。

1.3.4.7 傅里葉變換紅外光譜分析

根據(jù)Liu Jianhua等[17]的方法略作修改。將熱處理后的肌球蛋白冷凍干燥并粉碎，取凍干后的肌球蛋白粉末與溴化鉀按質(zhì)量比1∶50充分混合，在約18 MPa的壓力下加壓2 min，掃描范圍為450～4 000 cm-1。利用Peakfit 4.12軟件在1 600～1 700 cm-1進(jìn)行基線校正，在二階導(dǎo)數(shù)譜基礎(chǔ)上采用Gauss分峰擬合，根據(jù)積分面積計(jì)算各二級(jí)結(jié)構(gòu)組分的相對(duì)含量[18]。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)凝膠化過(guò)程中涉及的主要結(jié)構(gòu)α-螺旋和β-折疊二級(jí)結(jié)構(gòu)組分進(jìn)行定量分析，各子峰與二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)關(guān)系：1 610～1 639 cm-1被認(rèn)為是β-折疊結(jié)構(gòu)，1 661～1 680 cm-1被認(rèn)為是α-螺旋結(jié)構(gòu)[19]。

1.3.4.8 熱穩(wěn)定性分析

根據(jù)Dergez等[20]的方法略作修改。稱(chēng)量熱處理后的肌球蛋白樣液（15±1）mg于鋁坩堝中密封。以空鋁坩堝作為空白，掃描溫度為0～150 ℃，升溫速率為5 ℃/min。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010軟件整理，采用Origin 2018軟件進(jìn)行繪圖。采用SPSS Statistics 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan’s顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS-PAGE分析結(jié)果

如圖1所示，提取的肌球蛋白主要由分子質(zhì)量約為220 kDa的肌球蛋白重鏈亞基譜帶和15～25 kDa的肌球蛋白輕鏈亞基譜帶以及43 kDa的肌動(dòng)蛋白條帶組成，測(cè)定肌球蛋白純度為87.8%。

圖1 鰱魚(yú)肌球蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE patterns of myosin extracted from silver carp

2.2 升溫方式對(duì)肌球蛋白總巰基含量的影響

巰基含量的變化可作為肌球蛋白性質(zhì)變化的一個(gè)重要指標(biāo)。從圖2可以看出，低溫段和高溫段3 種升溫方式的總巰基含量C處理組＞A處理組＞B處理組，且C處理組顯著高于A與B處理組（A和B處理組之間無(wú)顯著差異）。與Cao Hongwei等[6]發(fā)現(xiàn)肌球蛋白總巰基含量在40 ℃時(shí)微波加熱比水浴加熱略有下降的研究結(jié)果一致，微波加熱的肌球蛋白分子之間形成二硫鍵，更容易導(dǎo)致總巰基的數(shù)量逐漸減少，由于微波與水浴加熱機(jī)制不同，微波加熱時(shí)極性分子隨著電磁場(chǎng)的變化而不斷變化，導(dǎo)致介質(zhì)溫度快速升高，引起水分分布、蛋白質(zhì)分子聚集方式和空間結(jié)構(gòu)的改變[21]。加熱導(dǎo)致肌球蛋白凝膠化的其中一種條件是反應(yīng)發(fā)生在較低的溫度，如40 ℃時(shí)改變肌球蛋白分子的重鏈形態(tài)，導(dǎo)致輕鏈脫落，暴露了肌球蛋白頭部許多部位的疏水區(qū)域，使得肌球蛋白分子形成分子間頭對(duì)頭聚集[22]。升溫至90 ℃時(shí)，微波快速加熱會(huì)使巰基轉(zhuǎn)化為二硫鍵，二硫鍵含量一定程度的提高為獲得更高的凝膠強(qiáng)度、促進(jìn)蛋白質(zhì)分子交聯(lián)提供基礎(chǔ)[23]。二硫鍵的形成導(dǎo)致大分子聚集從而使一些暴露的巰基重新被掩埋，肌球蛋白尾部纏繞形成穩(wěn)定的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

圖2 肌球蛋白總巰基含量Fig. 2 Effect of different heating methods on total sulfhydryl group content of myosin

2.3 升溫方式對(duì)肌球蛋白表面疏水性的影響

肌球蛋白受熱變性導(dǎo)致空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)使更多的疏水性氨基酸殘基暴露出來(lái)，增加了蛋白質(zhì)表面疏水性[24]。從圖3可以看出，低溫段與高溫段C處理組的表面疏水性顯著低于A與B處理組（A和B處理組之間無(wú)顯著差異），當(dāng)樣品升溫時(shí)間長(zhǎng)，整體受熱多時(shí)，促進(jìn)肌球蛋白結(jié)構(gòu)的展開(kāi)導(dǎo)致更多的疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，暴露的疏水基團(tuán)直接參與肌球蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)的形成[6]；也可能是肌球蛋白展開(kāi)但交聯(lián)程度不同所致，微波加熱時(shí)二硫鍵不易形成與聚集，不易導(dǎo)致表面疏水性降低[25]，這與圖2結(jié)果相互印證。在90 ℃時(shí)MH和MWH樣品的肌球蛋白聚集時(shí)間不充分，肌球蛋白分子缺少有效的時(shí)間重新排列，參與凝膠網(wǎng)絡(luò)形成與加強(qiáng)的疏水基團(tuán)少，也可能是MH和MWH樣品形成的肌球蛋白聚集體沒(méi)有造成大量疏水基團(tuán)被包埋[6]。不排除表面疏水性檢測(cè)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)操作或者誤差導(dǎo)致C處理組數(shù)據(jù)顯著降低。加熱后，肌球蛋白分子運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，巰基轉(zhuǎn)化成二硫鍵導(dǎo)致肌球蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，肌球蛋白分子內(nèi)外共價(jià)鍵等斷裂使分子伸長(zhǎng)，疏水區(qū)域暴露，一些疏水基團(tuán)暴露在表面，變性的肌球蛋白分子參與分子間或分子內(nèi)的氫鍵和二硫鍵以及靜電和疏水相互作用，導(dǎo)致聚集[26-28]。

圖3 肌球蛋白表面疏水性Fig. 3 Effect of different heating methods on surface hydrophobicity of myosin

2.4 升溫方式對(duì)肌球蛋白濁度的影響

濁度反映了溶液中懸浮顆粒的數(shù)量和大小，可以用來(lái)表征蛋白質(zhì)聚集的程度，蛋白質(zhì)聚集后溶液中懸浮顆粒的直徑增加，聚集到一定程度時(shí)可能導(dǎo)致光散射，阻礙光的傳播[29]。低溫段3 種升溫方式的濁度差異顯著（P＜0.05），且C1處理組＞B1處理組＞A1處理組（圖4），表明不同升溫方式的肌球蛋白在低溫條件發(fā)生了不同程度的交聯(lián)。高溫段3 種升溫方式，C2處理組的濁度顯著高于A2和B2處理組（P＜0.05），但A2和B2處理組的濁度無(wú)顯著差異（P＞0.05），不同升溫速率導(dǎo)致肌球蛋白變性和聚集的相對(duì)速率不同，使得肌球蛋白分子展開(kāi)和分子間聚集的程度不同[30]，WH樣品的濁度最大，表明肌球蛋白發(fā)生了一定的構(gòu)象變化，形成的聚集體越大，變性程度越大，而MH降低了與肌球蛋白聚集相關(guān)的濁度[6]。肌球蛋白的變性和聚集過(guò)程實(shí)際上反映了魚(yú)糜凝膠的形成過(guò)程。在微波加熱過(guò)程中，交變電場(chǎng)會(huì)改變蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的電荷場(chǎng)和電場(chǎng)分布，從而破壞蛋白質(zhì)之間的靜電相互作用，肌球蛋白分子通過(guò)疏水相互作用和其他分子間作用力聚集[31]。

圖4 肌球蛋白濁度Fig. 4 Effect of different heating methods on turbidity of myosin

2.5 升溫方式對(duì)肌球蛋白溶解度的影響

溶解度是反映蛋白質(zhì)變性程度的指標(biāo)之一。從圖5可以看出，低溫段、高溫段3 種升溫方式的肌球蛋白溶解度均差異顯著（P＜0.05），A處理組＞B處理組＞C處理組。A1處理組溶解度高與Nguyen等[32]研究微波處理所得酶解水產(chǎn)副產(chǎn)物在pH值為7條件下水解比水浴處理具有較高的溶解性的結(jié)果一致，適當(dāng)?shù)奈⒉ㄌ幚碛兄诘鞍踪|(zhì)的展開(kāi)，在這種情況下內(nèi)部的親水性氨基酸可能更多的接觸水分子[33]。溶解度變化與濁度變化呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，尤其是低溫段，反映出肌球蛋白變性聚集過(guò)程，微波加熱除了有熱效應(yīng)還有場(chǎng)效應(yīng)，會(huì)引起肌球蛋白之間的相互作用減弱[34]。溶解度的降低表明蛋白分子間的靜電和疏水相互作用不平衡，肌動(dòng)球蛋白快速變性和聚集；溶解度升高表明分子間的靜電排斥作用大于疏水相互作用[35]。

圖5 肌球蛋白溶解度Fig. 5 Effect of different heating methods on solubility of myosin

2.6 不同升溫方式的肌球蛋白色氨酸熒光光譜

肌球蛋白的球狀頭部和棒狀尾部含有大量的色氨酸殘基，色氨酸殘基的暴露情況可以反映蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化，可以通過(guò)檢測(cè)肌球蛋白的色氨酸熒光強(qiáng)度來(lái)反映構(gòu)象變化[36]。從圖6可以看出，鰱魚(yú)肌球蛋白的熒光峰在340 nm波長(zhǎng)處左右。3 種升溫方式色氨酸熒光強(qiáng)度A處理組＞B處理組＞C處理組，熒光強(qiáng)度越高說(shuō)明肌球蛋白越容易變性展開(kāi)，對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響越大，MH樣品暴露的色氨酸殘基多，MH樣品的光譜藍(lán)移程度高于MWH樣品，表明發(fā)射基團(tuán)位于更為疏水的微環(huán)境。升溫至相同溫度，MH和MWH樣品的肌球蛋白的變性程度小于WH樣品，說(shuō)明微波有效地抑制了加熱過(guò)程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，這表明可能存在由微波輻射產(chǎn)生非熱效應(yīng)[37]，有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6 不同升溫方式的肌球蛋白色氨酸熒光光譜Fig. 6 Tryptophan fluorescence spectra of myosin subjected to different heating methods

2.7 不同升溫方式肌球蛋白紫外吸收光譜的變化

色氨酸（tryptophane，Trp）或酪氨酸（tyrosine，Tyr）等殘基的微環(huán)境的變化在一定程度上能夠反映蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化。當(dāng)所處的微環(huán)境疏水時(shí)，特征譜峰會(huì)發(fā)生藍(lán)移，芳香族殘基暴露于肌球蛋白分子表面。從圖7可以看出，不同升溫方式的肌球蛋白的紫外吸收光譜的峰位置基本一致，在波長(zhǎng)280 nm左右出現(xiàn)吸收峰，波長(zhǎng)未發(fā)生遷移，這一現(xiàn)象表明肌球蛋白中酪氨酸和色氨酸的微環(huán)境變化不明顯。低溫段和高溫段3 種升溫方式的紫外吸收峰強(qiáng)度MH和MWH均高于WH，表明微波導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸的吸收較強(qiáng)，這種升溫方式可能改變了蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)色氨酸和酪氨酸轉(zhuǎn)移到表面，導(dǎo)致紫外吸收更強(qiáng)。

圖7 肌球蛋白在不同升溫方式紫外吸收光譜Fig. 7 UV absorption spectra of myosin subjected to different heating methods

為了進(jìn)一步研究不同升溫方式的肌球蛋白構(gòu)象的細(xì)微差異，得到的紫外吸收二階導(dǎo)數(shù)光譜在289 nm和296 nm波長(zhǎng)處附近有兩個(gè)正吸收峰，在285 nm和291 nm波長(zhǎng)處附近有兩個(gè)負(fù)吸收峰。r取決于Trp和Tyr的相對(duì)含量和暴露于水相的量，即r＝a/b（a和b分別為第一次和第二次正吸收峰與負(fù)吸收峰的差值），r越高，表明Tyr殘基的表面暴露量越大[38]。C1和C2處理組在289 nm波長(zhǎng)處的吸收峰紅移程度較其他升溫方式大，表明極性環(huán)境減弱，會(huì)導(dǎo)致表面疏水性降低，與圖3表面疏水性結(jié)果一致。如表2所示，低溫段3 種升溫方式r由大到小依次為C1處理組＞B1處理組＞A1處理組，表明WH暴露的Tyr殘基更多，MH和MWH對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的影響更小。高溫段3 種升溫方式r由大到小依次為B2處理組＞A2處理組＞C2處理組，表明升溫到高溫段的肌球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)微波更敏感，在90 ℃時(shí)更有利于肌球蛋白分子展開(kāi)，肌球蛋白分子內(nèi)的疏水殘基更容易暴露[6]，與酪氨酸熒光光譜高溫段分析結(jié)果一致。

表2 285 nm/289 nm和291 nm/296 nm正吸收峰與負(fù)吸收峰的峰谷值比Table 2 Peak-to-trough ratios of positive and negative absorption peaks at 285 nm/289 nm and 291 nm/296 nm

2.8 不同升溫方式肌球蛋白傅里葉變換紅外光譜

傅里葉變換紅外光譜可以用來(lái)研究肌球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，酰胺I帶（1 600～1 700 cm-1）是蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)較為主要的研究?jī)?nèi)容，1 664 cm-1處的特征吸收峰歸屬于酰胺I帶C＝O的伸縮振動(dòng)。從圖8中可以看出，不同升溫方式的鰱魚(yú)肌球蛋白的傅里葉變換紅外光譜峰型基本一致，峰位置也基本一致。低溫段3 種升溫方式下，α-螺旋相對(duì)含量C1處理組＞A1處理組＞B1處理組，β-折疊相對(duì)含量B1處理組＞C1處理組＞A1處理組，MH的-β折疊相對(duì)含量比MWH的低。Liu Ru等[39]發(fā)現(xiàn)α-螺旋的展開(kāi)和β-折疊含量的增加有利于豬肌球蛋白的凝膠化，在熱誘導(dǎo)肌球蛋白凝膠形成過(guò)程中普遍存在α-螺旋含量減少、β-折疊片段含量增多的現(xiàn)象，其中α-螺旋含量的減少與肌球蛋白的展開(kāi)有緊密的關(guān)系[29]，說(shuō)明WH樣品的肌球蛋白變性程度高，MWH促進(jìn)肌球蛋白展開(kāi)。α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要來(lái)源于羰基（C＝O）和氨基（—NH2）之間的氫鍵，當(dāng)溫度超過(guò)35 ℃時(shí)，氫鍵逐漸被破壞，導(dǎo)致α-螺旋結(jié)構(gòu)含量減少[40]。高溫段3 種升溫方式下，α-螺旋相對(duì)含量A2處理組＞B2處理組＞C2處理組，β-折疊相對(duì)含量C2處理組＞B2處理組＞A2處理組，在加熱條件下α-螺旋含量降低代表蛋白質(zhì)分子展開(kāi)程度增加，而β-折疊含量增加代表蛋白質(zhì)分子間聚集程度增加[41]，與圖4高溫段濁度結(jié)果一致。不論低溫段還是高溫段升溫，MH樣品的β-折疊相對(duì)含量低于MWH樣品，MH樣品的α-螺旋相對(duì)含量高于MWH，說(shuō)明MH樣品的肌球蛋白變性程度高，肌球蛋白展開(kāi)程度低，β-折疊相對(duì)含量結(jié)果也與表3中β-折疊/（α-螺旋+β-折疊）比值增加的結(jié)果一致。微波加熱和微波輔助加熱升溫方式在較低溫度更容易破壞肌球蛋白分子內(nèi)的α-螺旋結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)逐漸消失，但在較高溫度時(shí)比傳統(tǒng)水浴加熱升溫方式，更多地保留了α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖8 不同升溫方式肌球蛋白傅里葉變換紅外光譜Fig. 8 FTIR spectra of sliver carp myosin subjected to different heating methods

表3 不同升溫方式下肌球蛋白α-螺旋和β-折疊的比例Table 3 Percentages of α-helix and β-sheet structures in silver carp myosin subjected to different heating methods

2.9 不同升溫方式下肌球蛋白熱穩(wěn)定性

DSC能夠直觀地反映肌球蛋白在變性時(shí)吸收的熱量值，根據(jù)峰值和峰面積可以分別確定肌球蛋白的熱轉(zhuǎn)變溫度Td和熱焓值ΔH，不同升溫方式的肌球蛋白DSC圖譜如圖9所示，熱轉(zhuǎn)變溫度和熱焓值結(jié)果如表4所示。肌球蛋白受溫度改變而發(fā)生變性，不同升溫方式的鰱魚(yú)肌球蛋白變性溫度為46.56～54.78 ℃，結(jié)果與Rahbari等[42]的報(bào)道差異不大，不同升溫方式的肌球蛋白吸收峰未完全消失，表明肌球蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)未完全變性。低溫段3 種升溫方式下，A1和C1處理組表現(xiàn)出非常小的熱焓值，然而，B1處理組的肌球蛋白熱焓值較高，同時(shí)B1處理組的熱轉(zhuǎn)變溫度高，表明肌球蛋白越不容易變性或部分肌球蛋白沒(méi)有變性，MWH能夠改變肌球蛋白的熱穩(wěn)定性，C1處理組的肌球蛋白熱轉(zhuǎn)變溫度最低，說(shuō)明該方式的肌球蛋白熱穩(wěn)定性低，變性程度大，抗變性能力弱。高溫段3 種升溫方式下，A2處理組的肌球蛋白熱焓值明顯高于其他升溫方式，熱轉(zhuǎn)變溫度較低，而B(niǎo)2處理組的熱轉(zhuǎn)變溫度高，表明MWH的肌球蛋白的空間結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，因此在加熱時(shí)不易聚集，與圖3高溫段濁度加熱結(jié)果一致。

表4 不同升溫方式肌球蛋白熱穩(wěn)定性Table 4 Thermal stability of myosin under different heating methods

圖9 不同升溫方式肌球蛋白DSC圖譜Fig. 9 DSC spectra of sliver carp myosin subjected to different heating methods

3 結(jié) 論

升溫方式不同導(dǎo)致鰱魚(yú)肌球蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)出現(xiàn)差異。MH和MWH與WH相比明顯縮短了升溫時(shí)間，大大提高了效率。低溫段MH和MWH促進(jìn)肌球蛋白交聯(lián)，MWH促進(jìn)肌球蛋白展開(kāi)，有利于肌球蛋白的凝膠化。高溫段WH樣品的肌球蛋白聚集程度高于MH和MWH樣品，MH對(duì)肌球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)影響較大，暴露出更多的氨基酸殘基。在生產(chǎn)加工過(guò)程中不能忽略升溫過(guò)程，MWH促進(jìn)蛋白凝膠化效果優(yōu)于MH，在實(shí)際生產(chǎn)中生產(chǎn)效率明顯高于WH。推測(cè)可能存在一定的非熱效應(yīng)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)需采取能精準(zhǔn)控溫的計(jì)算機(jī)模擬方法對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證。