線粒體靶向遞送PCN-224體系的構(gòu)建與表征

余文杰, 楊明月, 華成煥, 彭 娜 *, 劉 義

(1. 武漢科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,湖北 武漢 430081; 2. 天津工業(yè)大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院,天津 300387)

光動力療法(PDT)是一種利用光敏劑(PSs)在特定波長的激發(fā)光下產(chǎn)生具有細胞毒性的活性氧(ROS),從而誘導(dǎo)細胞凋亡和組織損傷的抗腫瘤治療方法[1]。因此,可以通過調(diào)節(jié)光照條件(例如光照時間和光照強度)來精確調(diào)控光動力治療的效果[2]。然而,ROS的半衰期很短(<40 ns),只能作用于其產(chǎn)生的位點附近(<20 nm),這一范圍遠遠小于細胞尺寸[3],故許多研究者致力于設(shè)計、制備多功能納米載體,將各類PSs遞送至腫瘤組織后,進一步將其遞送到相關(guān)細胞器(線粒體、溶酶體等),以達到在細胞器附近原位生成ROS的目的,從而提高PDT治療效果[4-6]。

線粒體作為細胞的動力工廠,在細胞新陳代謝中起著至關(guān)重要的作用,線粒體的損傷將導(dǎo)致一系列細胞功能異常。由于線粒體可以調(diào)節(jié)細胞程序性死亡而不會引起任何不良的炎癥反應(yīng),是提高PDT治療效果的優(yōu)良細胞器靶標[7-9]。帶離域正電荷的親脂性三苯基膦(TPP)可以選擇性地結(jié)合到帶負電的線粒體膜上,主要因為其化學(xué)結(jié)構(gòu)中的3個苯基使其具有很強的親脂性,同時,磷原子上的正電荷可以離域到3個苯環(huán)上形成離域正電荷,使TPP易于滲透磷脂雙分子層,從而將TPP修飾過的納米粒子富集于線粒體[10-14]。Mou等[15]合成了一種新型的綠色二氧化鈦(G-TiO2-x),其近紅外光(920 nm)吸收強于黑色二氧化鈦(B-TiO2-x),為了降低激光功率密度和副作用,提高光動力治療效果,將TPP配體修飾到G-TiO2-x上,得到的納米粒子用于靶向線粒體的PDT和光熱的聯(lián)合治療,該納米粒子在體外和體內(nèi)都表現(xiàn)出優(yōu)異的治療效果。

此外,在用于遞送PSs的多功能納米載體中,具有多孔晶體結(jié)構(gòu)的金屬有機骨架(MOF)因其具有較高的比表面積和易于調(diào)節(jié)的孔徑優(yōu)勢,受到廣泛關(guān)注[16]。特別是基于Zr(Ⅳ)的卟啉金屬有機框架納米粒子PCN-224,不僅可以作為載藥的納米載體[17],而且本身也是一種具有很強滲透力的PSs[18]。

本研究合成含TPP的兩親性聚合物,通過兩親性聚合物的自組裝,將光敏劑PCN-224包封進膠束中,得到具有靶向線粒體功能的納米粒子(Scheme 1)。并通過核磁共振譜(1H NMR)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)、透射電子顯微鏡(TEM)、動態(tài)光散射(DLS)、紫外-可見吸收光譜(UV-Vis)、熒光光譜(FL)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(ICP-OES)等,表征了合成的納米粒子的理化性質(zhì);通過熒光探針2′,7′-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),表征了合成的納米粒子產(chǎn)生ROS的能力;通過共聚焦顯微鏡(CLSM),觀察納米粒子在細胞內(nèi)部的分布情況;通過細胞毒性(MTT)測試,檢測納米粒子對小鼠乳腺癌細胞的毒性。結(jié)果證明將光敏劑包封進膠束后,其產(chǎn)生ROS的能力明顯高于卟啉配體,且含TPP的膠束成功將光敏劑PCN-224富集于線粒體,對癌細胞的毒性大于單純的光敏劑PCN-224,為后續(xù)抗腫瘤的研究奠定了理論基礎(chǔ)。

Scheme 1

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UV-2450型紫外/可見分光光度計;Agilent Varian 600 MHz型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標);Bruker TENSOR27型紅外光譜儀;JEM-2100UHR型透射電子顯微鏡;Malvern Instruments Nano-ZS ZEN3600型粒度儀;Shimadzu RF-6000型分光光度計;Agilent 730型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀。

半胱胺鹽酸鹽、三氟乙酸乙酯、3-巰基丙酸甲酯,阿拉丁工業(yè)有限公司;5,10,15,20-四(4-羧基苯基)卟啉(TCPP)、苯甲酸(BA),梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;聚乙二醇2000(PEG2000)、 ZrOCl28H2O, Sigma-Aldrich; 2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA),上海畢得醫(yī)藥科技股份有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素、磷酸鹽緩沖液(PBS),卡爾斯巴德;活性氧檢測試劑盒、Mito-Tracker Red CMXRos(線粒體紅色熒光探針)、Hoechst 33342染色液,碧云天生物科技有限公司;其余所用試劑均為分析純或化學(xué)純。

1.2 合成

(1) 兩親性聚合物的合成

兩端具有不飽和鍵的硫代硫縮酮分子(TK)的合成：將10 g半光胺鹽酸鹽和24 mL三乙胺溶解在250 mL甲醇中,將溶液置于冰浴中,加入10 mL三氟乙酸乙酯攪拌3 h后,室溫繼續(xù)反應(yīng)12 h,經(jīng)萃取、洗滌后,經(jīng)硅膠柱層析純化得中間產(chǎn)物2-巰基三氟乙酰胺。將5.7 g 2-巰基三氟乙酰胺,4.4 g的3-巰基丙酸甲酯和2 g的丙酮溶于50 mL乙腈中,冰浴冷卻,加入13 mL的三氟化硼乙醚，繼續(xù)反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后,經(jīng)萃取、洗滌后利用柱層析分離得到產(chǎn)物,加入6 mol/L氫氧化鈉溶液使三氟乙酸酯基團脫保護,得到TK-NH2。將0.64 g的TK-NH2溶于15 mL二氯甲烷中,置于冰浴中,分別加入2.3 mL三乙胺和1.1 mL丙烯酰氯,反應(yīng)5 h后,室溫繼續(xù)反應(yīng)19 h,經(jīng)萃取、干燥得兩端具有不飽和鍵的硫代硫縮酮分子(TK)。

將0.262 g的三苯基膦溶于20 mL無水乙腈中,升溫至100 ℃,在氮氣保護下,緩慢滴加5 mL溶解有0.195 g 6-溴己酸的乙腈,滴畢,氮氣保護下繼續(xù)反應(yīng)16 h得TPP-COOH。將8.0 g的PEG2000溶于10 mL無水二氯甲烷中,置于冰浴中,氮氣保護下,加入2 mL甲基磺酰氯和2 mL三乙胺后,室溫反應(yīng)24 h,經(jīng)過濾、濃縮后,加入大量乙醚沉淀,減壓抽濾后,得到淡黃色固體,干燥后加入100 mL 體積分數(shù)為25%的氨水,室溫反應(yīng)4 d,敞口放置3 d,用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH至13,經(jīng)萃取、干燥后,用乙醚沉淀,減壓抽濾得到固體粗產(chǎn)物,重復(fù)二氯甲烷溶解、乙醚沉淀、過濾操作兩遍,所得固體充分干燥后即為NH2-PEG-NH2。將2.265 g的TPP-COOH溶于40 mL無水二氯甲烷中,加入0.576 g 4-二甲氨基吡啶(DMAP)和1.008 gN,N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC),攪拌1 h,加入30 mL溶解有11.988 g NH2-PEG-NH2的無水二氯甲烷,室溫反應(yīng)12 h,經(jīng)濃縮、乙醚沉淀后得NH2-PEG-TPP。

將TK、 NH2-PEG-TPP、 1H-咪唑-2-胺混合于雙頸燒瓶中,在氮氣保護下,于120 ℃下反應(yīng)10 h。粗品溶于適量二甲亞砜(DMSO)中,透析、冷凍干燥備用。

(2) PCN-224的合成

將100 mg TCPP、 300 mg ZrOCl2·8H2O和2.8 g BA依次溶于裝有100 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)的250 mL圓底燒瓶中,攪拌至固體溶解后,在溫度為90 ℃、轉(zhuǎn)速為300 r/min條件下,恒溫反應(yīng)5 h。懸濁液通過離心分離得到的固體粒子依次用DMF和蒸餾水洗滌3次,避光保存。

(3) 膠束@PCN-224的制備

將1 mg PCN-224分散到5 mL蒸餾水中,向其中加入1 mL溶解有10 mg兩親性聚合物的DMSO,室溫攪拌12 h后,轉(zhuǎn)移到透析袋(3500)中透析48 h。透析結(jié)束后將透析液冷凍干燥備用。

1.3 性能或活性測試

(1) PCN-224穩(wěn)定性測試

將PCN-224分散于水溶液中,利用動態(tài)光散射(DLS)測試其粒徑、電位,測試之后,將其放置1 d后繼續(xù)進行DLS測試,該步驟一共重復(fù)7次,從而得到PCN-224在蒸餾水中的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。

(2) 利用DCFH-DA檢測ROS

取0.5 mg的TCPP分散到10 mL的磷酸緩沖溶液(10 mmol/L, pH=7.4, PBS)中配成50 μg/mL的樣品,取一定質(zhì)量的PCN-224、膠束@PCN-224分散到PBS中配制含PCN-224質(zhì)量濃度為50 μg/mL的樣品,隨后,在相同體積的樣品溶液中分別加入相同含量的DCFH-DA(10 μM)活化后的2′,7′-二氯二氫熒光素(DCFH)溶液,DCFH被ROS氧化為2′,7′-二氯熒光素(DCF)后具有熒光,在660 nm激發(fā)光(1.5 W/cm2)照射下光照2 min后,立即測得其熒光光譜,PBS作為空白對照。

(3) 細胞攝取及細胞內(nèi)ROS檢測

將小鼠乳腺癌細胞(4T1)在小皿中孵育24 h,然后與PCN-224、膠束@PCN-224(光敏劑PCN-224質(zhì)量濃度均為15.0 μg/mL)共孵育24 h,隨后,移除培養(yǎng)基,并將細胞用PBS溶液洗滌3次,加入含有10 μM DCFH-DA的無血清培養(yǎng)基孵育15 min后,用新鮮培養(yǎng)基洗滌3次,以去除多余的DCFH-DA染色液,在660 nm(20 mW/cm2)激光下光照一段時間,隨后用PBS洗滌3次,再加入含有200 nmol/L Mito-Tracker Red CMXRos的無血清培養(yǎng)基孵育20 min,以標記細胞內(nèi)線粒體,隨后用PBS溶液洗滌細胞3次后,加入含有10 μg/mL的Hoechst 33342染色液孵育20 min,以標記細胞核,用PBS洗滌數(shù)次除去多余的染色液,用共聚焦顯微鏡掃描拍照。

(4) 細胞毒性測試

將4T1細胞以10000個/孔的數(shù)量接種到96孔板中,孵育24 h后,移除培養(yǎng)基,往各孔中加入100 μL含有不同質(zhì)量濃度的PCN-224的納米粒子的培養(yǎng)基,孵育24 h后,移除培養(yǎng)基,重新加入新鮮培養(yǎng)基,用20 mW/cm2的排燈照射30 min后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育24 h,隨后往各孔中加入20 μL 3-(4,5)-二甲基噻唑-2-甲基-2,5-二苯基溴化四氮唑(MTT, 5 mg/mL),繼續(xù)孵育4 h,最后,移除培養(yǎng)基,往各孔中加入100 μL DMSO,用來溶解結(jié)晶的甲瓚。使用酶標儀測量各孔的光密度(OD),并計算細胞存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 PCN-224的表征

(1)1H NMR

合成的兩親性聚合物的核磁譜如圖1所示。從圖1中可以看出,TK鍵的甲基特征峰a(1.54), PEG的亞甲基特征峰b(3.50),咪唑環(huán)上—CH=CH—的特征峰c(6.94～6.69),以及TPP的芳香環(huán)特征峰d(7.94～7.73),由此證明兩親性聚合物已成功合成。

δ圖1 兩親性聚合物的1H NMR譜圖

(2) 粒徑分析,TEM和IR

通過溶劑熱法,合成了光敏劑PCN-224, PCN-224框架由Zr6簇和配體TCPP組成,其中,Zr具有高穩(wěn)定性,配體TCPP具有對稱的分子結(jié)構(gòu),其四個羧基與Zr—O鍵進行酯化反應(yīng)后形成Zr—O—C,將進一步提高PCN-224的穩(wěn)定性和產(chǎn)生ROS效果。

通過DLS測得的結(jié)果來證明PCN-224是否具有納米級尺寸,這將有利于后續(xù)的包封實驗。如圖2所示,通過DLS測得PCN-224的水合粒徑約為100 nm,表明成功合成了具有納米級尺寸的PCN-224。如圖3a所示,通過TEM觀察到PCN-224的粒徑約為80 nm,且具有規(guī)則的類球形。DLS測得的粒徑大于TEM觀察的結(jié)果,這是因為：一方面,TEM測試的PCN-224是干燥后的,而DLS測試的水合粒徑,在制備TEM樣品時,干燥后的PCN-224會失去表面附著的水分子,導(dǎo)致粒徑變小;另一方面,與TEM在干燥狀態(tài)下測定的尺寸相比,水合粒徑的明顯增加,可能是由于PCN-224的表面疏水性,導(dǎo)致納米粒子在水溶液中的輕微聚集,從而導(dǎo)致水合粒徑的增加。如圖3b所示,對透射電鏡圖中PCN-224粒子進行數(shù)量統(tǒng)計,得到PCN-224的粒徑分布直方圖,大部分PCN-224的粒徑分布在80～90 nm。

粒徑/nm

圖3 PCN-224的透射電鏡照片和粒徑分布

通過對照有機配體TCPP、 PCN-224的FT-IR譜圖,判斷PCN-224是否成功合成。從圖4 TCPP的紅外光譜圖中可以看到,在1670～1725 cm-1存在C=O的吸收峰,而合成的PCN-224的紅外光譜圖在1700 cm-1附近無吸收峰;在1650 cm-1附近出現(xiàn)類似TCPP在1700 cm-1附近的羰基吸收峰。由此可知,在合成PCN-224的過程中,TCPP的羧基變成羧酸鹽,使得羰基的峰位置發(fā)生了變化;在650 cm-1處的峰是由Zr—OH鍵引起的,從而證明了PCN-224的成功合成。

ν/cm-1

(3) UV-Vis和FL

如圖5a所示,通過對PCN-224的UV-Vis光譜的分析,可以看到PCN-224在425 nm處有一個強吸收峰(Soret帶),在500～700 nm之間有4個弱吸收峰(Q帶)[19],這4個小峰的存在歸因于金屬有機框架PCN-224中存在的卟啉配體在500～700 nm之間的Q帶,而紫外可見吸收光譜反映的主要是分子中的生色團和助色團,所以Zr基金屬的加入不會引起有機配體TCPP的UV-Vis光譜發(fā)生變化。由此可知,合成的PCN-224中存在卟啉結(jié)構(gòu)。熒光發(fā)射光譜測試是在某一固定波長的激發(fā)光作用下檢測PCN-224納米顆粒的熒光強度在不同波長處的分布情況。如圖5b所示,以440 nm激發(fā)波長作為激發(fā)光進行發(fā)射光譜的測試,可以觀察到PCN-224納米粒子的光致發(fā)光(PL)光譜在紅光區(qū)680 nm處出現(xiàn)發(fā)射峰,表明此時的熒光強度最強。卟啉有機配體TCPP具有很強的熒光性能,通過對合成的PCN-224進行熒光發(fā)射光譜的測試,進一步證明PCN-224中存在配體TCPP結(jié)構(gòu)。

λ/nm

(4) PCN-224的穩(wěn)定性

通過DLS測試,得到7 d內(nèi)PCN-224在水溶液中的粒徑電位數(shù)據(jù),探究PCN-224在水溶液中的穩(wěn)定性。如圖6所示,可以看到7 d內(nèi)用DLS測得的數(shù)據(jù)曲線波動不大。其中,PCN-224的水合粒徑均為100 nm左右,電位約為+30 mV,兩個圖中曲線的平緩程度證明合成的PCN-224在水溶液中有較好的穩(wěn)定性,表明PCN-224的結(jié)構(gòu)不易坍塌。

時間/d

2.2 膠束@PCN-224的表征

通過DLS測試得到PCN-224包封進膠束后的粒徑電位變化,結(jié)果見表1。由表1可知,當PCN-224包封進膠束后,納米粒子的粒徑由132.7 nm增大到136.7 nm,電勢由+13.5 mV降低到+7.04 mV。

表1 膠束、PCN-224、膠束@PCN-224的粒徑、電勢和多分散系數(shù)

通過對照PCN-224、膠束、膠束@PCN-224的FT-IR圖譜,判斷PCN-224是否成功包封進膠束中,其IR譜圖見圖7。由圖7可知,膠束本身在1400 cm-1左右沒有特征峰,而包封PCN-224后,在1403 cm-1出現(xiàn)了特征峰,該峰為PCN-224羧酸基團中的O—H彎曲振動峰。

通過ICP-OES測得納米粒子中包封的金屬Zr的質(zhì)量為215.2 μg,以及投入的PCN-224中Zr的質(zhì)量為250.3 μg,換算得到膠束@PCN-224中包封的PCN-224的質(zhì)量為0.85 mg,計算得到膠束@PCN-224中PCN-224的載藥量為7.91%。

2.3 體外ROS檢測分析

相同濃度的TCPP、PCN-224、膠束、膠束@PCN-224在光照之后產(chǎn)生ROS的情況,如圖8所示。熒光強度越高,說明光照產(chǎn)生的ROS越多。PCN-224與TCPP相比較,發(fā)現(xiàn)由金屬Zr和TCPP合成金屬有機框架后,其產(chǎn)生ROS的能力大大增強,這是由于金屬有機框架的結(jié)構(gòu)使得TCPP周期性地排列在陣列中,能夠有效降低激發(fā)能的猝滅;同時,框架的多孔性也有利于底物的進入[20-21]。將PCN-224與膠束@PCN-224對比,發(fā)現(xiàn)當PCN-224被包封進膠束后,其產(chǎn)生ROS的能力下降,這可能是由于膠束中所含的TK被ROS裂解,從而消耗了一部分ROS。將TCPP和膠束@PCN-224對比,可知膠束@PCN-224產(chǎn)生ROS的能力明顯強于TCPP,說明膠束包封了PCN-224之后仍具有較強的產(chǎn)生ROS的效果。

2.4 4T1細胞對納米粒子的攝取

為了研究經(jīng)TPP修飾過的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,本研究應(yīng)用CLSM來評估PCN-224和膠束@PCN-224在4T1細胞中的分布情況。PDT所產(chǎn)生的ROS用DCFH-DA標記,線粒體用Mito-Tracker Red CMXRos染色,細胞核用Hoechst 33342染色,PCN-224因其本身能在420 nm激發(fā)光下發(fā)出約650 nm的熒光,因此不需要染料進行染色即可從共聚焦顯微鏡下觀察到PCN-224。納米粒子進入細胞后的分布如圖9所示,從圖9a中可以看到與PCN-224共孵育的4T1細胞觀察到少量的紫色熒光,且紫色與藍色標記的細胞核位置幾乎相同,而紅色熒光標記的線粒體和紫色熒光位置不同,表明PCN-224本身進入細胞的能力有限,且進入細胞后也不會主動富集于線粒體,而是會擴散到細胞核中。從圖9b中可以看到,與膠束@PCN-224共孵育的4T1細胞能觀察到明顯的紫色熒光,且與紅色熒光標記的線粒體重疊的部分較多,說明膠束@PCN-224能提高PCN-224進入細胞的能力,且在TPP的作用下,將其靶向遞送到線粒體。

圖9 納米粒子在細胞內(nèi)的分布*

納米粒子進入細胞后產(chǎn)生的ROS分布如圖10所示,從圖10a中可以看到,綠色熒光標記的ROS與紅色熒光標記的線粒體和藍色熒光標記的細胞核都有所重疊,但綠色熒光強度太弱,說明進入細胞有限的PCN-224產(chǎn)生的ROS不足。從圖10b中可以看到,與膠束@PCN-224共孵育的4T1細胞能觀察到明顯的綠色熒光,且綠色熒光的位置與紫色熒光和紅色熒光標記的線粒體一致,說明膠束@PCN-224進入細胞后在TPP的作用下靶向到線粒體,且在線粒體處經(jīng)光照后將產(chǎn)生足夠的ROS。CLSM的結(jié)果有效說明了含TPP的兩親性聚合物的線粒體靶向能力。

圖10 細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS的分布*

2.5 納米粒子對4T1細胞的毒性

為了進一步研究經(jīng)TPP修飾過的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,本研究應(yīng)用MTT法來評估PCN-224和膠束@PCN-224對4T1細胞的毒性。由圖11可見,隨著PCN-224質(zhì)量濃度的增加,在沒有光照的條件下,PCN-224、膠束@PCN-224均對4T1細胞有低的細胞毒性,而在光照條件下,PCN-224、膠束@PCN-224對4T1細胞毒性的影響都逐漸增大,且在最大藥物濃度時細胞存活率分別為32 %、29 %,將相同質(zhì)量濃度下的PCN-224和膠束@PCN-224對比,可以看到后者對4T1細胞的毒性均大于前者,這一結(jié)果進一步證明了含TPP的兩親性聚合物的線粒體靶向作用,實驗結(jié)果表明所合成的納米粒子增強了PDT效果。

cPCN-224/μM

合成了具有線粒體靶向的兩親性聚合物,并通過水熱法制備得到了具有納米級尺寸的光敏劑PCN-224,隨后利用兩親性聚合物的自組裝,將PCN-224包封進膠束,得到具有線粒體靶向功能的納米粒子(載藥量7.91%)。最后,利用熒光探針DCFH-DA對ROS的特異性識別,在相同條件下測試了各體系的熒光強度,結(jié)果證明金屬有機框架PCN-224有效提高了TCPP產(chǎn)生ROS的效果;將其包封進膠束后,膠束@PCN-224仍具有較強的產(chǎn)生ROS的效果,利用CLSM、MTT測試證明了膠束具有線粒體靶向功能,能將PCN-224主動靶向至線粒體,有效增強了PDT效果。該納米體系的構(gòu)建有利于提高PDT治療效果。