入侵性南美番茄潛葉蛾高效藥劑篩選及其抗性基因突變檢測(cè)

王少麗 史彩華 徐丹丹 張友軍

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

南美番茄潛葉蛾〔Tuta absoluta（Meyrick）〕屬鱗翅目麥蛾科，又稱番茄麥蛾、番茄夜蛾、番茄食心蟲等，英文名稱為tomato leaf miner 或the South American tomato moth。該蟲源自南美洲的秘魯，2017 年首次在我國(guó)新疆伊犁被發(fā)現(xiàn)（張桂芬 等，2019），2018 年在云南臨滄被發(fā)現(xiàn)（張桂芬 等，2020）。南美番茄潛葉蛾作為番茄上的重大害蟲，可為害番茄苗期到成株期的任何生長(zhǎng)階段，主要為害葉片，其次是莖與果實(shí)。幼蟲孵化后鉆入番茄葉片組織取食葉肉，初期在葉片上形成小的潛道，隨著蟲體長(zhǎng)大，食量增加，潛道逐漸變大，甚至在葉片上形成不規(guī)則的透明斑，葉片被害部位可見(jiàn)黑色排泄物，影響植物光合作用，導(dǎo)致葉片皺縮、干枯、脫落；幼蟲還可蛀食番茄果實(shí)，形成明顯的孔洞，導(dǎo)致果實(shí)畸形或在孔洞處感染病菌后腐爛，從而失去商品價(jià)值，危害嚴(yán)重時(shí)可造成番茄減產(chǎn)80%～100%（Campos et al.，2017；張桂芬 等，2020）。除了番茄，南美番茄潛葉蛾還可為害茄子、辣椒、菜豆和菠菜等作物。由于其個(gè)體微小，成蟲體長(zhǎng)不足1.0 cm，初孵幼蟲僅0.4～0.6 mm，易于隨種苗、果實(shí)、運(yùn)輸工具、裝貨箱等進(jìn)行隱蔽的遠(yuǎn)距離傳播和擴(kuò)散。隨著國(guó)際貿(mào)易的日益頻繁，該蟲的傳播入侵和擴(kuò)散為害將進(jìn)一步加劇（冼曉青 等，2019）。

化學(xué)防控是南美番茄潛葉蛾綜合治理的重要方式之一（Desneux et al.，2011），例如施用氯蟲酰胺類和氟蟲酰胺類、茚蟲威等藥劑（Gontijo et al.，2013），但是藥劑的持續(xù)施用導(dǎo)致不同地域的南美番茄潛葉蛾種群產(chǎn)生了不同程度的抗藥性（Biondi et al.，2017）。智利、巴西、阿根廷等國(guó)家相繼報(bào)道南美番茄潛葉蛾對(duì)擬除蟲菊酯、阿維菌素、殺螟丹、芐氯菊酯、多殺菌素等藥劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，其中與菊酯類殺蟲劑的抗性相關(guān)基因中存在不同的點(diǎn)突變（Haddi et al.，2012；Silva et al.，2015，2016）。在歐洲，南美番茄潛葉蛾對(duì)酰胺類殺蟲劑茚蟲威產(chǎn)生了高抗性，其魚尼丁受體（ryanodine receptor，RyR）存在不同的點(diǎn)突變，其中G4903 位點(diǎn)的突變可能與該抗性形成密切相關(guān)（Roditakis et al.，2017）。在巴西，南美番茄潛葉蛾對(duì)多殺菌素和乙基多殺菌素產(chǎn)生了高水平抗藥性，其煙堿型乙酰膽堿受體α6 亞基存在G275E點(diǎn)突變（Silva et al.，2016）。上述研究表明靶標(biāo)抗性基因的點(diǎn)突變?cè)谀厦婪褲撊~蛾抗性形成過(guò)程中起著重要作用。

施用化學(xué)藥劑是快速控制南美番茄潛葉蛾田間為害的有效手段。為篩選高效防控南美番茄潛葉蛾的化學(xué)藥劑，本試驗(yàn)評(píng)價(jià)了7 種不同殺蟲劑對(duì)為害我國(guó)新疆伊寧縣番茄的南美番茄潛葉蛾的致死效果，并檢測(cè)了與菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的鈉離子通道擊倒抗性（knock-down resistance，kdr）基因的點(diǎn)突變，以期為該蟲的化學(xué)防控提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

南美番茄潛葉蛾試蟲于2018 年8 月采自新疆伊犁伊寧縣的露地番茄植株上，在田間直接采集帶蟲葉片進(jìn)行殺蟲劑的生物測(cè)定。同時(shí)，收集部分幼蟲保存于70%酒精中，用于后續(xù)抗性基因克隆及其突變頻率檢測(cè)。

1.2 供試藥劑及試驗(yàn)濃度

由于我國(guó)目前尚未有防控該蟲的指導(dǎo)藥劑和推薦劑量，本試驗(yàn)選用的藥劑和濃度參考了國(guó)際上南美番茄潛葉蛾的防控藥劑及十字花科蔬菜上小菜蛾的推薦用量（源自中國(guó)農(nóng)藥信息網(wǎng)）并稍作調(diào)整。

供試7 種殺蟲劑均為制劑：5%氯蟲苯甲酰胺懸浮劑〔SC，40～55 mL·（667 m2）-1，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司產(chǎn)品〕，6%乙基多殺菌素懸浮劑〔SC，20～40 mL·（667 m2）-1，美國(guó)陶氏益農(nóng)公司產(chǎn)品〕，1.8%阿維菌素水乳劑〔EW，30～40 mL·（667 m2）-1，廣西田園生化股份有限公司產(chǎn)品〕，5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽水分散粒劑〔甲維鹽WG，4～5 g·（667 m2）-1，河北中保綠農(nóng)作物科技有限公司產(chǎn)品〕，4.5%高效氯氰菊酯乳油〔EC，33～50 mL·（667 m2）-1，保定農(nóng)藥廠產(chǎn)品〕，24%溴蟲腈懸浮劑〔SC，25～35 mL·（667 m2）-1，山東濰坊潤(rùn)豐化工股份有限公司產(chǎn)品〕，蘇云金芽孢桿菌Bt（8 000 IU·μL-1）可分散油懸浮劑（OD，1 200～1 500 mL·hm-2，武漢科諾生物科技股份有限公司產(chǎn)品）。

1.3 藥劑篩選方法

南美番茄潛葉蛾為入侵性害蟲，為了降低其種群進(jìn)一步傳播擴(kuò)散的風(fēng)險(xiǎn)，在鱗翅目害蟲生物測(cè)定常用的葉碟浸漬法基礎(chǔ)上，發(fā)展了適合潛入葉片取食為害的害蟲生物測(cè)定方法——帶蟲葉片浸漬法，即采集帶有2～3 齡幼蟲的葉片在不同藥液中浸漬20 s 后取出，測(cè)定不同藥劑處理下幼蟲死亡率。具體操作：田間采集帶有南美番茄潛葉蛾2～3 齡幼蟲的番茄葉片，將帶蟲葉片在不同藥液中浸漬20 s，待葉片表面藥液自然晾干后，將葉片鋪在墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿（直徑15 cm）中，每皿放置幼蟲15～20 頭，蓋上皿蓋，放入培養(yǎng)箱中，48 h 后檢查和記錄各處理死亡率。用毛筆尖輕觸蟲體（對(duì)于葉片表皮內(nèi)的試蟲，先輕輕撕開葉表皮后再輕觸蟲體），不動(dòng)者記為死亡。設(shè)置清水處理作為空白對(duì)照，每個(gè)處理4 次重復(fù)，計(jì)算各處理組的校正死亡率。

1.4 kdr 基因克隆及序列檢測(cè)

利用基因組DNA提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取南美番茄潛葉蛾基因組DNA。擴(kuò)增引物參考Haddi等（2012）的方法。選擇kdr基因的兩個(gè)序列片段設(shè)計(jì)特異性引物。其中一段序列長(zhǎng)359bp，包含M918T和T929I兩個(gè)突變位點(diǎn)，上游引物為TAF2（5′-GGCCGACGTTTAATTTACTC-3′），下游引物為TARouter（5′-TGTTTCAACAGAATGACGATACTA-3′）；另一段序列長(zhǎng)281bp，包含L1014F 突變位點(diǎn)，上游引物為TAF3（5′-AGAATGGATTGAGAGTATGTGG-3′），下游引物為TAR1（5′-GGTGTCGTTATCGGCAGTA G-3′）。PCR擴(kuò)增體系為20μL：2×EsTaq MasterMix 10 μL，DNA 1 μL，10 μmol·L-1上下游引物各1 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性 3 min；95 ℃變性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸2 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)確認(rèn)條帶大小符合預(yù)期后，送交擎科（北京）新業(yè)生物技術(shù)有限公司測(cè)序，在NCBI中進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.5 數(shù)據(jù)分析

南美番茄潛葉蛾死亡率數(shù)據(jù)采用DPS 3.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan 新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。kdr基因突變頻率計(jì)算方法：基因點(diǎn)突變頻率=〔（抗性純合子個(gè)體數(shù)/檢測(cè)總數(shù)）+（抗性雜合子個(gè)體數(shù)/檢測(cè)總數(shù)/2）〕× 100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑對(duì)南美番茄潛葉蛾幼蟲的致死效果

采用帶蟲葉片浸漬法測(cè)定南美番茄潛葉蛾幼蟲對(duì)7種藥劑的敏感性。藥劑處理48 h后的結(jié)果表明：不同藥劑處理后幼蟲蟲體呈現(xiàn)不同狀態(tài)。其中，5%氯蟲苯甲酰胺處理后，多數(shù)幼蟲蟲體縮短且不取食；8 000 IU·μL-1Bt和4.5%高效氯氰菊酯處理后，幼蟲鉆出潛藏的葉片表皮；1.8%阿維菌素和6%乙基多殺菌素處理后，幼蟲仍然藏匿于葉片表皮；其余藥劑處理后試蟲無(wú)明顯上述表現(xiàn)。

1.8%阿維菌素EW、24%溴蟲腈SC 和5%氯蟲苯甲酰胺SC 處理后，試蟲死亡率達(dá)100%，顯著高于其他藥劑處理，表現(xiàn)出對(duì)南美番茄潛葉蛾的極高毒力活性；其次為5%甲維鹽WG 和6%乙基多殺霉素SC，試蟲死亡率分別為92.22% 和91.25%，毒力活性均顯著高于8 000 IU·μL-1蘇云金芽孢桿菌（Bt）OD；而4.5%高效氯氰菊酯EC對(duì)試蟲毒力活性極低，未見(jiàn)試蟲死亡（表1）。

表1 不同藥劑處理下南美番茄潛葉蛾幼蟲的死亡率

2.2 南美番茄潛葉蛾kdr 基因序列檢測(cè)

對(duì)南美番茄潛葉蛾菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的kdr基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序后發(fā)現(xiàn)，同時(shí)包含M918T 和T929I 兩個(gè)突變位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)359 bp，包含L1014F 突變位點(diǎn)的擴(kuò)增片段長(zhǎng)281 bp（圖1）。將兩個(gè)片段的測(cè)定結(jié)果在NCBI 中進(jìn)行序列比對(duì)，鑒定為鈉離子通道基因，即為預(yù)期擴(kuò)增基因片段。

圖1 南美番茄潛葉蛾kdr 基因片段擴(kuò)增

隨機(jī)選取20 頭南美番茄潛葉蛾幼蟲并提取其基因組DNA，分別檢測(cè)M918T、T929I 和L1014F 3 個(gè)位點(diǎn)的突變頻率。結(jié)果表明，這3 個(gè)基因點(diǎn)突變同時(shí)存在，其中M918T 位點(diǎn)檢測(cè)出12 個(gè)抗性雜合個(gè)體和8 個(gè)敏感純合個(gè)體，基因突變頻率為30%；T929I 位點(diǎn)檢測(cè)出10 個(gè)抗性純合個(gè)體和10個(gè)抗性雜合個(gè)體，基因突變頻率高達(dá)75%；L1014F位點(diǎn)檢測(cè)出的20 個(gè)樣本均為抗性純合個(gè)體，基因突變頻率為100%（表2）。

表2 南美番茄潛葉蛾kdr 基因突變頻率檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用帶蟲葉片浸漬法評(píng)價(jià) 7 種藥劑對(duì)南美番茄潛葉蛾的致死效果，結(jié)果表明，參照小菜蛾的防控劑量，1.8%阿維菌素EW、24%溴蟲腈SC、5%氯蟲苯甲酰胺SC、5%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽WG 和6%乙基多殺霉素SC 對(duì)入侵我國(guó)新疆的南美番茄潛葉蛾田間種群具有較高的毒力活性。因此，上述藥劑可以參照防控小菜蛾的推薦劑量用于南美番茄潛葉蛾田間幼蟲的化學(xué)防控。高效氯氰菊酯對(duì)南美番茄潛葉蛾幼蟲的毒力活性較低，帶蟲葉片在該藥劑中浸漬處理48 h 后，蟲口無(wú)死亡現(xiàn)象，表明該藥劑已不適合用于防控南美番茄潛葉蛾。本試驗(yàn)采用分子生物學(xué)手段進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菊酯類殺蟲劑抗性相關(guān)的鈉離子通道kdr基因存在3 個(gè)明顯的點(diǎn)突變，其中L1014F 位點(diǎn)的突變頻率為100%，T929I 位點(diǎn)75%，M918T 位點(diǎn)30%，表明kdr基因較高頻率的點(diǎn)突變可能是高效氯氰菊酯對(duì)入侵我國(guó)新疆的南美番茄潛葉蛾毒力活性極低的重要原因。根據(jù)以往研究，在巴西等12 個(gè)國(guó)家的南美番茄潛葉蛾田間種群中均發(fā)現(xiàn)L1014F、M918T 和T929I 的點(diǎn)突變，且突變頻率較高，例如L1014F 為98%，M918T 為35%，T929I 為60%（Haddi et al.，2012；Silva et al.，2015），這與入侵我國(guó)新疆地區(qū)的南美番茄潛葉蛾種群kdr基因點(diǎn)突變頻率基本處于一致水平，由此推測(cè)入侵我國(guó)新疆的南美番茄潛葉蛾種群的kdr基因點(diǎn)突變是在該蟲入侵我國(guó)新疆前已經(jīng)發(fā)生并存在，基于可能存在交互抗性，其他菊酯類殺蟲劑單劑也不建議用于該蟲的化學(xué)防控。