5-氟尿嘧啶與4,4′-聯(lián)吡啶共晶的合成與表征的研究

肖忠偉 楊釗 徐紅 李敏 趙永鳳

(1 青島大學(xué)藥學(xué)院，山東 青島 266021； 2 青島大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科； 3 青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院； 4 山東科技大學(xué))

藥物共晶是活性藥物成分和共晶配體以特定的化學(xué)計(jì)量比通過分子間作用力結(jié)合在同一晶格中的晶體，是一種可以改善活性藥物成分諸多理化性質(zhì)的新型固體形式[1-3]。通過向原料藥中引入共晶配體，可以改善藥物的物理化學(xué)性質(zhì)，例如增加穩(wěn)定性[4]、提高生物利用度等[5-8]。如今已有多款共晶藥物上市，如安斯泰來公司研制的伊格列凈/L-脯氨酸就是一種治療糖尿病的新型共晶藥物[9-10]。

5-氟尿嘧啶(5-FU)是嘧啶類抗代謝藥物，臨床用于治療乳腺癌、皮膚癌等[11-12]，為一種BCS Ⅲ類藥物，口服吸收不穩(wěn)定、半衰期短(7.5～10 min)，生物利用度低，藥物動(dòng)力學(xué)性能差[13-16]。為了優(yōu)化藥效和減少副作用，科研人員制備了各種5-FU共晶來克服其性質(zhì)缺陷[17-23]。如ZHANG等[24]制備了5-FU-煙酰胺共晶提高了5-FU的生物利用度，同時(shí)有效地降低了急性毒性。

藥物共晶多晶型是指具有2種或2種以上不同晶體結(jié)構(gòu)的共晶。由于其內(nèi)部晶體結(jié)構(gòu)的差異，同一種藥物的不同晶型會(huì)表現(xiàn)出熔點(diǎn)、穩(wěn)定性以及生物利用度等理化性質(zhì)的不同，從而顯著影響藥物的療效。通過調(diào)控制備方法、選擇不同溶劑種類可以進(jìn)行共晶多晶型的篩選。5-FU存在2種晶型且氫鍵結(jié)合位點(diǎn)多，這些因素使其在制備共晶過程中較易產(chǎn)生多晶型。本研究選擇具有較強(qiáng)僑聯(lián)能力的4,4′-聯(lián)吡啶(BPY)作為配體[25-26]，并擬通過超聲輔助的溶劑蒸發(fā)法以獲得一種新的5-FU-BPY多晶型，并進(jìn)一步對(duì)其晶體結(jié)構(gòu)的表征進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1

藥用原料藥5-FU購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，BPY購自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，乙腈購自德國(guó)默克股份公司，Spectrum 65傅里葉變換紅外光譜儀購自美國(guó)PerkinElmer公司，DSC 6000差示掃描量熱儀購自美國(guó)鉑金埃爾默儀器有限公司D8 Focus X 射線粉末衍射儀、Xcalibur&Gemini 單晶衍射儀購自德國(guó)布魯克公司，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱購自上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司，BT125D型電子天平購自美國(guó)Sartorious公司。

1.2

1.2.1共晶的制備 準(zhǔn)確稱取50 mg 5-FU并加入到10 mL乙腈溶液中，超聲溶解后加入60.03 mg BPY，繼續(xù)超聲溶解1 h。冷卻至室溫以后過濾至50 mL燒杯中，用封口膜封口并用針頭扎一定數(shù)量小孔，靜置1 d后待晶體析出。在顯微鏡下挑取單晶保存于礦物油中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2X-射線單晶衍射(SCXRD)檢測(cè)晶體結(jié)構(gòu)采用Xcalibur&Gemini單晶衍射儀檢測(cè)單晶結(jié)構(gòu)，收集衍射強(qiáng)度數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)條件：石墨單色儀Cu-Kα靶，波長(zhǎng)為1.541 84 ?，溫度為20 ℃。然后使用SHELXTL-97程序進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，所有原子可以使用直接法確定，其中非氫原子坐標(biāo)使用最小二乘法求出。對(duì)非氫原子進(jìn)行各向異性分析，并用最小二乘法對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行精修[27]。

1.2.3X-射線粉末衍射(PXRD)檢測(cè)共晶和原始組分的衍射峰 利用Bruker D8 Focus X-射線粉末衍射儀對(duì)晶體粉末進(jìn)行掃描，用以確定5-FU-BPY和5-FU、BPY以及二者的物理混合物所具有的不同的晶相特征。射線源為Cu-Kα，波長(zhǎng)1.540 60 ?，發(fā)散狹縫和散射狹縫均設(shè)置為1°，接收狹縫設(shè)置為0.15 mm，光管電壓和電流分別為40 kV和40 mA，在衍射角(2θ)為10°～40°范圍內(nèi)以1°/min的速度進(jìn)行掃描。

1.2.4差示掃描量熱法(DSC)檢測(cè)共晶和原始組分的熔點(diǎn) 利用差示掃描量熱儀對(duì)5-FU、BPY、兩者混合物及共晶進(jìn)行程序升溫，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min，升溫速度為10 ℃/min。 熔點(diǎn)數(shù)據(jù)采用Pyris Manager軟件處理。

1.2.5傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)檢測(cè)樣品的紅外光譜 利用傅里葉變換紅外光譜儀對(duì)5-FU、BPY、兩者混合物及共晶進(jìn)行紅外光譜檢測(cè)，分別取各樣品約2 mg置瑪瑙研缽中，加入干燥的溴化鉀細(xì)粉約200 mg作為分散劑，充分研磨混勻之后，置于壓片模具中制成供試片。設(shè)置掃描范圍4 000～400/cm，掃描次數(shù)4次，分辨率4/cm。

1.2.6掃描電子顯微鏡(SEM)檢測(cè)晶體形態(tài) 取適量5-FU-BPY、5-FU以及BPY，使用雙面膠固定在銅板上，用金噴射，利用電鏡掃描儀在20.0 kV電壓下進(jìn)行掃描，以獲取5-FU-BPY、5-FU和BPY的晶體形態(tài)。

2 結(jié) 果

2.1

采用SCXRD對(duì)該共晶的單晶結(jié)構(gòu)測(cè)定顯示，5-FU-BPY屬于單斜晶系P21/c空間群，晶胞軸長(zhǎng)：a=3.734 4(5)?，b=20.017 0(2)?，c=18.860 1(19)?，晶胞軸角：α=90.000 deg，β=94.765(2)deg，γ=90.000 deg，Z=2，R1=0.098 0，wR2=0.215 0。不對(duì)稱單元包含兩個(gè)5-FU分子和半個(gè)BPY分子(圖1A)。晶體結(jié)構(gòu)中存在大量分子間氫鍵，一個(gè)5-FU分子的亞氨基NH和BPY一個(gè)氮原子形成一個(gè)氫鍵N2-H2···N5 (2.178 ?，178.65°)，同時(shí)這個(gè)5-FU分子的亞氨基和另一個(gè)5-FU分子的一個(gè)醛基形成另一個(gè)氫鍵N3-H3···O2(1.932 ?，123.26°)。第二個(gè)5-FU分子中的亞氨基NH與第三個(gè)5-FU分子中的磺酰氨基形成分子間氫鍵N3-H3···O2(1.932 ?，123.26°)。5-FU分子與BPY分子通過氫鍵以4∶1的化學(xué)計(jì)量比形成共晶(圖1B)。在三維超分子結(jié)構(gòu)中，5-FU分子與另7個(gè)5-FU分子通過分子間氫鍵相連形成八圓環(huán)，兩端各空出一個(gè)氫鍵供體，分別與BPY分子中的氫鍵受體相結(jié)合形成雙孔狀環(huán)形結(jié)構(gòu)(圖1C)。

A：球形圖,B：氫鍵圖,C：三維結(jié)構(gòu)圖

2.2

5-FU-BPY的PXRD圖譜顯示，在衍射角2θ為12.94°、14.90°、16.78°及33.83°處有新的特征衍射峰；5-FU在衍射角2θ為28.72°、15.91°處有2個(gè)衍射峰；BPY在衍射角2θ為26.00°、21.77°和13.44°處有3個(gè)衍射峰。

2.3

DSC檢測(cè)結(jié)果顯示，5-FU-BPY在256.66 ℃處具有新的熔點(diǎn)峰，而5-FU的熔點(diǎn)為288.19 ℃，BPY的熔點(diǎn)為115.49 ℃。

2.4

FT-IR檢測(cè)結(jié)果顯示，5-FU在3 068、1 725/cm處分別對(duì)應(yīng)的亞酰胺基伸縮振動(dòng)峰位移至3 103、1 688/cm處，BPY在1 401/cm處對(duì)應(yīng)的吡啶氮伸縮振動(dòng)峰位移至1 461/cm處。

2.5

SEM檢測(cè)結(jié)果顯示，5-FU-BPY呈規(guī)則光滑的長(zhǎng)條狀形態(tài)， 5-FU呈現(xiàn)不規(guī)則粗糙塊狀形態(tài)，BPY呈松散的無序形態(tài)(圖2)。

A：5-FU-BPY結(jié)構(gòu)形態(tài)；B：5-FU結(jié)構(gòu)形態(tài)；C：BPY結(jié)構(gòu)形態(tài)，500倍

3 討 論

本研究制備了一種新的5-FU-BPY晶型，通過SCXRD技術(shù)測(cè)定了晶體結(jié)構(gòu)及分子組成，其不對(duì)稱單元是由兩個(gè)5-FU分子和半個(gè)BPY分子通過氫鍵相互連接組成。8個(gè)5-FU分子通過氫鍵相連形成超分子環(huán)形單元，中間與BPY分子通過分子間氫鍵相結(jié)合，最終自組裝擴(kuò)展生成雙孔狀構(gòu)造，這種罕見的超分子孔洞結(jié)構(gòu)可能會(huì)對(duì)5-FU-BPY共晶的理化性質(zhì)產(chǎn)生一定影響[28]。PXRD圖譜被認(rèn)為是晶體結(jié)構(gòu)的指紋圖譜，因此利用PXRD可快速鑒別共晶及晶相純度，PXRD結(jié)果顯示5-FU-BPY在2θ為12.94°、14.90°、16.78°和33.83°處形成4個(gè)新的特征衍射峰，不同于5-FU及BPY的衍射峰，也不同于報(bào)道的另一晶型的6個(gè)衍射峰[29]，表明形成了新的共晶。DSC是利用不同晶型物質(zhì)特有的熱力學(xué)性質(zhì)，通過熔點(diǎn)進(jìn)行鑒別，DSC檢測(cè)結(jié)果證明5FU-BPY在256.66 ℃處具有新的熔點(diǎn)，與兩種組分的熔點(diǎn)具有明顯的差異，也不同于另一晶型的233 ℃的熔點(diǎn)，這預(yù)示著新晶相的形成。共晶形成氫鍵時(shí)，共晶的紅外光譜會(huì)發(fā)生明顯變化，因此FT-IR可以用于檢測(cè)共晶的形成[30]。5-FU-BPY的FT-IR圖譜中5-FU在3 068、1 725/cm處的N-H,C=O伸縮振動(dòng)分別移至3 103、1 688/cm處；BPY的吡啶N伸縮振動(dòng)峰由1 401/cm處移至1 461/cm處，這說明5-FU的亞酰胺基和BPY的吡啶氮之間參與了氫鍵的形成，這與單晶結(jié)果相符。SEM可以直接觀察樣品的微觀結(jié)構(gòu)，不同的晶型排列會(huì)顯示不同的形態(tài)。本研究SEM觀察顯示5-FU-BPY形態(tài)發(fā)生明顯變化，說明形成共晶后，5-FU-BPY具有不同結(jié)晶形式及晶胞排列，證實(shí)了新晶相的形成。

藥物共晶多晶型影響藥物的理化性質(zhì)及療效，制備方法不同會(huì)得到不同的共晶晶型。研磨法通過借助機(jī)械力來促進(jìn)共晶的形成，添加適當(dāng)?shù)囊掖继岣叻肿拥囊苿?dòng)性可促進(jìn)共晶形成，但研磨法存在不易結(jié)晶的缺點(diǎn)，即使添加少量溶劑也可能生成溶劑化物。超聲輔助是一種新興技術(shù)，此方法得到的共晶純度高，可用于特定配比共晶的制備與篩選。本研究采用超聲技術(shù)，提供給藥物分子與配體分子更強(qiáng)的作用力，促進(jìn)晶核的形成。選擇不同極性的乙腈與水的混合溶劑進(jìn)行共晶制備，得到一種新的具有不同熔點(diǎn)、PXRD峰的共晶多晶型，這為通過改變制備方法及溶劑極性獲得共晶多晶型提供了研究思路。以往共晶的研究熱點(diǎn)集中在共晶的設(shè)計(jì)、制備與表征上。但近年來隨著共晶研究的深入，研究人員在制備共晶過程中意外發(fā)現(xiàn)藥物共晶的多晶型行為。本研究通過SCXRD確定共晶結(jié)構(gòu)內(nèi)部原子、分子的空間排布，證實(shí)5-FU-PY具有的雙孔狀構(gòu)造，不同于研磨法得到的共晶鏈狀結(jié)構(gòu)，這種微觀空間排列方式不同所形成的不同晶體結(jié)構(gòu)分類為堆積多晶型，這為共晶多晶型的超分子研究提供了基礎(chǔ)。

總之，5-FU具有滲透性低，口服吸收不完全，生物利用度低等缺點(diǎn)，本研究制備的5-FU-BPY共晶通過引入另一配體，物理化學(xué)性質(zhì)將發(fā)生改變。本研究也存在不足之處，如未進(jìn)行性質(zhì)研究，下一步需要利用細(xì)胞開展抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，以期為5-FU的口服給藥系統(tǒng)及透皮給藥系統(tǒng)的研究提供參考。