食源性沙門氏菌檢測方法的研究進(jìn)展

凌玲

（南丹縣疾病預(yù)防控制中心，廣西 南丹，547200）

自2007年-2008年的食物事件中，是世界比較關(guān)注的話題。誘發(fā)這些事件的元兇是極為罕見的致病菌，是比較常見的病原菌-沙門氏菌。沙門氏菌是對人與動(dòng)物健康構(gòu)成危害較大的致病菌，也是人類食物中常見病原菌[1]。但當(dāng)前，我國對諸多對沙門氏菌檢驗(yàn)通常取傳統(tǒng)培養(yǎng)方式，報(bào)告檢驗(yàn)數(shù)據(jù)需一周，耗費(fèi)時(shí)間較長，程序繁瑣。因此，創(chuàng)建準(zhǔn)確的測定方式是沙門氏菌檢驗(yàn)的中心問題。當(dāng)前，主要用傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)測定方式等來檢測。

1 沙門氏菌

1.1 沙門氏菌感染因素 沙門氏菌是自然界的宿主，部分能夠?qū)λ拗鬟M(jìn)行選擇，很多對人、動(dòng)物均能夠適應(yīng)，會寄存于哺乳類等人胃腸道中，特別是在家養(yǎng)、野生動(dòng)物中感染率較高。所以，各包裝、運(yùn)輸?shù)仍诩庸づc處理期間均可能會污染。如：宰殺家禽時(shí)衛(wèi)生條件不到位，腸腔沙門氏菌會對肉類造成污染，并于肉類中儲藏[2]。市場出售、廚房加工期間經(jīng)各用具互相污染，零售市場所購的生肉受沙門菌污染的最高達(dá)58%。蛋類、蛋制品污染來源，可是禽類卵巢，還可因糞便中沙門氏菌繞過蛋殼步入蛋內(nèi)。通常諸多因蛋混合所制的蛋粉中，感染率較高。乳類與制品如冰淇淋等食物均會遭受沙門氏菌感染，這些動(dòng)物源性食物均是造成沙門氏菌感染的重要介質(zhì)。原料以動(dòng)物臟器為主的生物制劑，如：酶、膽鹽等均會引發(fā)感染，發(fā)展中國家水源經(jīng)常會受到污染，污水灌溉等為散發(fā)最主要原因[3]。人與人直接傳播是按護(hù)士手、醫(yī)療器械為媒介，這也是醫(yī)院中感染暴發(fā)流行的主要因素。

1.2 沙門氏菌生物學(xué)性質(zhì) 沙門氏菌于百余年前發(fā)現(xiàn)，對人與動(dòng)物的健康均會造成危害，菌屬類型繁雜，抗原復(fù)雜。自從分離出食源性沙門氏菌依賴，可從人、動(dòng)物中分離較多菌群、血清型、變種，最普遍的是腸炎沙門氏菌[4]。沙門氏菌對外界環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，能夠在肉類等食物中存活數(shù)月。

1.3 沙門氏菌危害 沙門氏菌為世界范圍內(nèi)眾所公認(rèn)的食源性致病菌，食物傳播為人類感染沙門氏菌的主要路徑，蛋類、肉類等食物均和沙門氏菌存在一定關(guān)系[5]。人類沙門氏菌特點(diǎn)為惡心等癥。潛伏期處于8h-72h，患者進(jìn)食受污染的食物后會于36h后病發(fā)，癥狀大約為一周。

2 檢測方法

2.1 傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)測定方法 傳統(tǒng)測定沙門氏菌的方法是分步增菌對食物樣品進(jìn)行測定，加大病原檢出情況。培養(yǎng)方式可于總體各階段開展。①預(yù)增菌，選擇培養(yǎng)基，確保其高營養(yǎng)，取樣品加入其中，溫度37℃，促使細(xì)菌復(fù)蘇，確保全部微生物的生長[5]。②選擇性增菌步驟，沙門氏菌生長會使其存在的微生物數(shù)量變少，和預(yù)增菌培養(yǎng)接近，篩取選擇性培養(yǎng)基時(shí)，有多項(xiàng)觀點(diǎn)。當(dāng)前的類型可分成三類，分別是：連四硫基鹽肉湯、硒酸鹽胱氨酸肉湯、RV培養(yǎng)基。由于無任何培養(yǎng)基確保全部食品基質(zhì)。因此，科學(xué)的做法即是用不同培養(yǎng)基平行地開展試驗(yàn)。③分離環(huán)節(jié)，選擇性培養(yǎng)物于含多種遏制非沙門氏菌生長制劑瓊脂平板劃線培養(yǎng)，確認(rèn)平板上肉眼可探尋的特征性菌落，對菌落分離物加強(qiáng)血清學(xué)測定，并予以鑒定。

雖然這種方法是當(dāng)前有效的方法，但因切割等諸多因素，食物中沙門氏菌具有間歇性且密度低，因此有必要重復(fù)分離較大樣品于增菌肉湯中的培養(yǎng)。既往沙門氏菌測定期間至少一周方可確定[6]。整個(gè)檢驗(yàn)程度極為繁雜，消耗大量人力。從實(shí)驗(yàn)人員入手，所選的單菌落、手工生化測定等各步驟憑借操作者主觀判斷，由于要求測定檢測經(jīng)驗(yàn)豐富，檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否準(zhǔn)確一定程度憑借檢測者專業(yè)素質(zhì)與實(shí)驗(yàn)階段工作變化。這種方式不夠客觀，方便，節(jié)約時(shí)間，速度快捷。

2.2 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR） 常規(guī)PCR：有人員按自己設(shè)計(jì)的引物，獲取增產(chǎn)物為沙門氏菌基因的DNA片段。研究對已知被沙門氏菌污染樣品均可擴(kuò)增出特異亮帶。測定未知污染情況，發(fā)現(xiàn)2個(gè)樣品受沙門氏菌污染，表示PCR方式于樣品測定中，數(shù)據(jù)可靠[7]。在樣品DNA含量上，梯度稀釋時(shí)，需對各稀釋度樣品PCR擴(kuò)增，DNA含量為0.01pg時(shí)，會擴(kuò)展出條帶，表示PCR擴(kuò)增對沙門氏菌的測定中靈敏度高。PCR方式對樣品的測定中，所得各數(shù)據(jù)清晰，對樣品無過高要求，檢測時(shí)間過短，所花費(fèi)用高，操作復(fù)雜，操作殘留的污染容易致使假陰性、假陽性，需專用儀器設(shè)備，實(shí)際檢驗(yàn)缺乏操作性[8]。建立在PCR基礎(chǔ)上對沙門氏菌的測定上，部分人員會將其與其他基因結(jié)合測定沙門氏菌。經(jīng)多重PCR能夠?qū)z出率提高，有效對血清型進(jìn)行鑒別，檢測時(shí)間可下降。但用多重PER需區(qū)分引物退火溫度，內(nèi)在或擴(kuò)增物能夠阻礙PER，并對其展開分析。RT-PCR（Real—Time PER）：有人員按腸炎沙門氏菌特異性序列作為模板，對引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)全部污染樣品經(jīng)RT-PCR測定，數(shù)據(jù)呈陽性[9]。沙門氏菌實(shí)時(shí)定量PCR測定技術(shù)保留常規(guī)PER測定敏感性，全部過程由電腦干預(yù)，由加樣數(shù)據(jù)僅需2h[10]。能夠同步對多個(gè)樣品擴(kuò)增并定量，能夠?qū)Χ鄻悠愤M(jìn)行測定處理，將測定效率提高，對食物污染做好監(jiān)測，準(zhǔn)確判斷食物中毒事件，還可對樣品中細(xì)菌污染程度展開定量分析，靈敏度比傳統(tǒng)PCR高，自動(dòng)化簡單，會發(fā)展為測定細(xì)菌的主要方式。

2.3 免疫學(xué)方法 酶聯(lián)免疫吸附：酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA），其原理是將抗原、抗體提前結(jié)合于固相載體表面，添加受檢樣品、酶標(biāo)抗原，使其于載體上抗隱患、抗體發(fā)生反應(yīng)，成為抗原復(fù)合物。通過洗滌量反應(yīng)液中剩余物質(zhì)取出，添加反應(yīng)底物后，底物固相載體上酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，最后經(jīng)定性有色產(chǎn)物確定樣品中待測物質(zhì)含量。國外最早發(fā)現(xiàn)測定鼠傷寒沙門氏菌ELISA方式[11]。這種方式離心細(xì)菌后，轉(zhuǎn)移至醋酸纖維薄膜上，并于多孔板中固定，添加抗鼠傷寒沙門氏菌鞭毛抗體效用，加入第二酶標(biāo)抗體作尉，最終顏色為底物色，產(chǎn)棕色、蘭色呈陽性。這種方式最小檢出量至104-105CFU/ml，不足之處是會誘發(fā)假陽性反應(yīng)。免疫熒光標(biāo)記：免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體反應(yīng)理念，將已知抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制為熒光標(biāo)記物，用熒光抗體充當(dāng)分子探針檢查細(xì)胞對應(yīng)抗原。細(xì)胞、組織中產(chǎn)生的抗原抗體復(fù)合物上存在熒光素，用熒光顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察，熒光素激發(fā)光照射會出現(xiàn)明亮熒光，能夠清晰觀察熒光所處細(xì)胞，找尋抗原，并對其定位，用定量技術(shù)測定含量。

國外學(xué)者還嘗試用自動(dòng)熒光抗體檢測系統(tǒng)對食品沙門氏菌進(jìn)行測定，每小時(shí)能夠鑒定120個(gè)玻片樣品[12]。和常規(guī)研究相比，準(zhǔn)確率較高。研究人員用熒光抗體測定系統(tǒng)測定食品中沙門氏菌。系統(tǒng)能夠同時(shí)對14個(gè)樣品進(jìn)行測定，所得數(shù)據(jù)可靠，操作容易。還有學(xué)者用表面吸附法將測定樣品吸附在玻璃表面的薄膜上，用免疫熒光顯微鏡判定數(shù)據(jù)[13]。這種方法測定限為103-5/ml個(gè)沙門氏菌，不會出現(xiàn)假陰性、假陽性反應(yīng)。

2.4 SPR生物傳感器測定 從SPR技術(shù)在化學(xué)傳感器領(lǐng)域研究以來，SPR傳感器逐漸變?yōu)閭鞲衅黝I(lǐng)域特點(diǎn)，其研究甚晚，處于起步環(huán)節(jié)。我國當(dāng)前尚未將SPR傳感器在食品中沙門氏菌測定。結(jié)合SPR生物傳感器實(shí)時(shí)測定靈敏度特征將其在沙門氏菌測定中應(yīng)用。全部測定期間于1h內(nèi)展開，迅速測定[14]。但因測定細(xì)菌濃度過高，需逐漸將傳感器測定權(quán)限放大。

3 結(jié)語和展望

沙門氏菌是人、畜共患的病原菌，會誘發(fā)人類沙門菌病。創(chuàng)建科學(xué)的食源性沙門氏菌定量測定，不僅檢測速度可加快且更為準(zhǔn)確，及時(shí)處理受污染的食品，對公共衛(wèi)生均意義顯著。

沙門氏菌測定方式較多，包含傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)、PCR等。既往細(xì)菌培養(yǎng)程序繁多，至少需一周方能得出定論，難以適應(yīng)迅速簡捷的要求。常規(guī)PCR方式雖然迅速且便捷，但容易受到污染，假陽性高。與之比較，RT-PCR能夠攻克PCR不足，操作便捷，數(shù)據(jù)可靠且直觀，極為靈敏。漸漸發(fā)展成極為重要的測定方式，雖然SPR生物傳感器可迅速對其測定，但SPR傳感器價(jià)格過高，研究會花費(fèi)較高費(fèi)用，對檢測干擾較大，但其于這項(xiàng)領(lǐng)域中對病菌方面前景尚可，需進(jìn)一步探索。

綜上所述，沙門氏菌是食品衛(wèi)生測定的重要目標(biāo)菌，測定方式意義深遠(yuǎn)。不僅門氏菌測定靈敏度高，檢測時(shí)間也可縮短，檢測程度可簡化，檢測會向自動(dòng)化邁進(jìn)，可重復(fù)性高，簡單、易行，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。