滇龍膽草7-脫氧番木鱉酸-7-羥化酶基因的克隆與表達(dá)分析

張曉東 李彩霞 王元忠

摘要：克隆滇龍膽7-脫氧番木鱉酸-7-羥化酶基因GrDL7H，并進(jìn)行表達(dá)分析，為龍膽苦苷生物合成途徑的解析奠定基礎(chǔ)。根據(jù)滇龍膽轉(zhuǎn)錄組GrDL7H序列，使用RT-PCR（逆轉(zhuǎn)錄PCR）和3′RACE（cDNA末端快速擴(kuò)增）技術(shù)從滇龍膽幼葉中克隆該基因及其啟動(dòng)子，并進(jìn)行序列分析和組織特異性表達(dá)分析。結(jié)果表明，GrDL7H基因（登錄號(hào)：KT306971）全長(zhǎng)2 154 bp，包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子，其中GrDL7H基因（登錄號(hào)：KP340980）開放閱讀框長(zhǎng) 1 542 bp，編碼513個(gè)氨基酸;GrDL7H蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為59.08 ku，等電點(diǎn)（pI值）為8.88，屬于CYP450蛋白超家族成員，可能定位于葉綠體;GrDL7H蛋白質(zhì)無(wú)信號(hào)肽，為親水穩(wěn)定蛋白質(zhì)，主要由α-螺旋和環(huán)構(gòu)成;GrDL7H蛋白質(zhì)具有CYP450蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域，功能為參與氧化還原反應(yīng);滇龍膽GrDL7H蛋白質(zhì)與黃金雞納樹CcDL7H蛋白質(zhì)的親緣關(guān)系最近;GrDL7H基因啟動(dòng)子主要包含6個(gè)光應(yīng)答元件、1個(gè)赤霉素應(yīng)答元件、6個(gè)參與茉莉酸甲酯應(yīng)答的順式調(diào)控元件和1個(gè)熱脅迫應(yīng)答元件等;組織特異性表達(dá)分析結(jié)果表明，GrDL7H基因主要在葉片中表達(dá)。

關(guān)鍵詞：滇龍膽;7-脫氧番木鱉酸-7-羥化酶;基因克隆;表達(dá)分析

中圖分類號(hào)： S188;Q78 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）17-0076-06

滇龍膽（Gentiana rigescens Franch. ex Hemsl.）為多年生草本植物，主要分布于云南、四川等地，其根部主要用來治療肝炎和膽囊炎[1-2]。目前，由于滇龍膽的市場(chǎng)需求量逐年增加，野生滇龍膽遭到人為大肆破壞[3]。從合成生物學(xué)角度來看，滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，要大量合成龍膽苦苷，首先必須先弄清龍膽苦苷的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制。

萜類生物合成途徑包括基本前體形成、碳骨架結(jié)構(gòu)形成和萜類化合物的結(jié)構(gòu)后修飾3個(gè)階段[4]。7-脫氧番木鱉 酸-7-羥化酶（CrDL7H）是萜類龍膽苦苷生物合成途徑第二階段重要的酶，能夠催化7-脫氧番木鱉酸生成番木鱉酸[5]。在長(zhǎng)春花中，有研究者通過病毒誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)鑒定了 7- 脫氧番木鱉酸-7-羥化酶，CrDL7H基因沉默后，裂環(huán)番木鱉苷含量減少了70%，7-脫氧番木鱉酸鮮質(zhì)量含量增加到4 mg/g，且在裂環(huán)番木鱉苷途徑中羥基化先于羧基氧甲基化[5]。使用表達(dá)CrDL7H酶的酵母微體進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)分析，結(jié)果表明其米氏常數(shù)Km和最大速率Vmax分別為（111.07±14.80） μmol/min和（5.50±0.77） μmol/min[6]。目前，CrDL7H酶基因已從長(zhǎng)春花、小曼長(zhǎng)春花、蘿芙木、秀麗藤、金銀花、金雞納樹、水甘草等許多植物中分離[5]，但是目前僅在長(zhǎng)春花中進(jìn)行過詳細(xì)的研究。DL7H基因表達(dá)具有組織特異性。在川西獐牙菜中，SmDL7H基因在葉中的表達(dá)量最高，其次是莖和花，在根中的表達(dá)量最低;并且與G10H、IS、IO、SLS2等基因表達(dá)量相比，DL7H基因的表達(dá)量相對(duì)較低[7]。在長(zhǎng)春花中，CrDL7H基因主要在葉中表達(dá)，在第1對(duì)葉中表達(dá)量最高，在第2、3、4、5對(duì)葉中的表達(dá)量逐漸降低，且對(duì)應(yīng)的長(zhǎng)春堿與裂環(huán)番木鱉苷的含量逐漸減少;其次是莖和花，表達(dá)量最低的為根[8]。

目前，由于龍膽科植物的基因組并未測(cè)序，導(dǎo)致龍膽苦苷生物合成途徑并不完全清楚[9]。本研究根據(jù)筆者于2013年在滇龍膽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索的GrDL7H基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）技術(shù)成功從滇龍膽葉片中擴(kuò)增到GrDL7H基因，然后根據(jù)所克隆基因序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)該基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行擴(kuò)增和分析，最后對(duì)二年生滇龍膽根、莖、葉、花等不同組織中GrDL7H基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，以期為滇龍膽龍膽苦苷生物合成途徑的解析提供幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

基因克隆和啟動(dòng)子擴(kuò)增所用材料為滇龍膽無(wú)菌苗幼葉，采自玉溪師范學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究所金航研究員鑒定為滇龍膽，采樣日期為2014年5月17日。qPCR（實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增）分析使用的二年生滇龍膽植株采自臨滄市云縣臨滄耀陽(yáng)生物藥業(yè)科技有限公司后箐基地，由該公司技術(shù)經(jīng)理董順福鑒定為滇龍膽，采樣日期為2018年4月30日。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 GrDL7H基因的擴(kuò)增 采用多糖植物組織提取試劑盒提取滇龍膽幼葉總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采用植物基因組DNA提取試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]提取滇龍膽葉片DNA。根據(jù)前期測(cè)序的滇龍膽轉(zhuǎn)錄組GrDL7H基因轉(zhuǎn)錄本序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異引物GrDL7H EcoRⅠ-F、GrDL7H-R（表1）。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：PrimeSTAR Max Premix（2×，TaKaRa）25 μL，cDNA模板2 μL，正反向引物（10 μmol/L）各1 μL，加ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件如下：98 ℃ 10 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，然后割膠，使用膠回收試劑盒（德國(guó)QIAGEN）對(duì)目的片段進(jìn)行回收，將其連接到pMD19-T載體上。轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α[寶生物工程（大連）有限公司]后進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑取12個(gè)白斑搖菌;使用試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切檢測(cè)正確后進(jìn)行測(cè)序[生工生物工程（上海）股份有限公司]，獲得重組質(zhì)粒pMD19-fGrDL7H。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)基因特異性引物GrDL7H 3RACE-F，進(jìn)行3′ cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）。使用DNAMAN軟件比對(duì)后，進(jìn)行基因片段拼接，獲得GrDL7H基因ORF（開放閱讀框）全長(zhǎng)。設(shè)計(jì)基因特異性引物，分別以cDNA和gDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行TA克隆后，分別進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.2 GrDL7H基因啟動(dòng)子的克隆 根據(jù)“1.2.1”節(jié)中克隆到的滇龍膽GrDL7H基因序列，設(shè)計(jì)基因特異引物GrDL7H-sp2和GrDL7H-sp3（表1）。采用Universal Genome Walker 2.0試劑盒，分別使用DraⅠ、EcoR V、PuvⅡ和StuⅠ酶切滇龍膽基因組DNA，加接頭后，構(gòu)建文庫(kù)DL1、DL2、DL3和DL4，然后進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增。第1輪PCR總體系為25 μL，具體成分如下：DL1 g DNA 1 μL，50×Advantage 2聚合酶混合物0.5 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 1 μL，AP1（10 μmol/L）1 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，GrDL7H-sp2（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 19.5 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 25 s、72 ℃ 3 min，7個(gè)循環(huán);94 ℃ 25 s、67 ℃ 3 min，32個(gè)循環(huán);63 ℃ 7 min。第2輪PCR總體系為25 μL，具體成分如下：第1輪PCR產(chǎn)物 1 μL，50×Advantage 2聚合酶混合物0.5 μL，10×Advantage 2 PCR 1 μL，AP1（10 μmol/L） 1 μL緩沖液，dNTP（10 mmol/L）1 μL，GrDL7H-sp3（10 μmol/L）1 μL，ddH2O 19.5 μL，反應(yīng)條件為94 ℃ 25 s、72 ℃ 3 min，5個(gè)循環(huán);94 ℃ 25 s、67 ℃ 3 min，20個(gè)循環(huán);63 ℃ 7 min。第2輪PCR產(chǎn)物經(jīng)TA克隆，獲得重組質(zhì)粒pMD19-pGrDL7H，菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.2.3 GrDL7H基因及啟動(dòng)子的生物信息學(xué)分析 用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站的BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，用Genetyx 6.1.8軟件進(jìn)行翻譯，用DNAMAN 7進(jìn)行多序列比對(duì);用Clustal X 2.1進(jìn)行比對(duì)，然后使用MEGA 6.0軟件內(nèi)置的NJ（鄰接）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置Bootstrap（自抽樣）=1 000;利用在線數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//molbiol. edu.ru/eng/scripts/01_11.html）進(jìn)行稀有密碼子分析。使用ChloroP服務(wù)器v 1.1進(jìn)行葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè);使用Interpro軟件進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè);使用ProtScale軟件進(jìn)行疏水性分析，方法為Hphob./Kyte & Doolittle量表法;使用PredictProtein對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);使用Phyre2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi？id=index）對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè);利用Expasy中的TMHMM工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的跨膜螺旋區(qū);利用在線工具Wolf Psort預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位情況。使用GT-AG原則，將ORF序列與gDNA序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)行外顯子與內(nèi)含子的分析。使用啟動(dòng)子在線分析網(wǎng)站PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對(duì)克隆到的GrDL7H基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

1.2.4 GrDL7H基因的熒光實(shí)時(shí)定量分析 分別取二年生滇龍膽的根、莖、葉、花，使用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit[寶生物工程（大連）有限公司]提取總RNA，使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser[寶生物工程（大連）有限公司]處理除去基因組DNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈cDNA。以轉(zhuǎn)錄組中GrACTIN基因（GenBank登錄號(hào)為KM061807）作為內(nèi)參和GrDL7H基因ORF序列設(shè)計(jì)特異性引物（表1）。PCR體系如下：TB GreenPremix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）10 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 1 μL，正反向引物各1 μL。qPCR條件：95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，重復(fù)4次。在LightCycler 480 Ⅱ熒光定量PCR儀（Roche，瑞士）上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增曲線、溶解曲線、標(biāo)準(zhǔn)曲線由軟件自動(dòng)生成。使用內(nèi)參基因GrACTIN表達(dá)校準(zhǔn)后，計(jì)算根、莖、葉中GrDL7H基因的相對(duì)表達(dá)量。采用比較CT值的2-ΔΔCT的方法進(jìn)行定量數(shù)據(jù)的分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 滇龍膽GrDL7H基因的克隆

以滇龍膽幼葉cDNA為模板，使用表1中的基因特異性引物GrDL7H EcoRⅠ-F和GrDL7H-R擴(kuò)增出約1 500 bp的片段。通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-fGrDL7H，然后進(jìn)行DNA測(cè)序。結(jié)果表明，fGrDL7H長(zhǎng)1 502 bp，不含3′末端。使用SMART RACE試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，獲得600 bp DNA片段（圖1-A）。使用DNAMAN軟件對(duì)GrDL7H基因片段進(jìn)行組裝，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GrDL7H基因ORF全長(zhǎng)1 542 bp（圖1-B，登錄號(hào)：KP340980）。使用GrDL7H EcoR Ⅰ-F和GrDL7H EcoR Ⅰ-R對(duì)GrDL7H基因的基因組DNA（gDNA）進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示GrDL7H基因長(zhǎng)2 154 bp（圖1-C，登錄號(hào)：KT306971），包含5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子（圖1-D）。

2.2 GrDL7H基因的生物信息學(xué)分析

2.2.1 GrDL7H基因的ORF分析和多序列比對(duì)分析 利用Genetyx 6軟件對(duì)GrDL7H基因的ORF序列進(jìn)行分析，該基因（GenBank登錄號(hào)為KP722033.1）長(zhǎng)1 542 bp，編碼513個(gè)氨基酸。

利用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的BLASTP程序?qū)rDL7H蛋白質(zhì)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，滇龍膽GrDL7H與蘿芙木RsDL7HT（78.17%）、黃金雞納樹CcDL7H（77.78%）、長(zhǎng)春花CrDL7H（77.73%）的序列相似性均較高，與擬南芥AtDL7H（51.47%）的蛋白質(zhì)相似性稍低。利用DNAMAN 7將GrDL7H蛋白質(zhì)序列與NCBI中相似性較高的部分序列進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，GrDL7H蛋白質(zhì)與已知蛋白質(zhì)序列的保守性較高（圖2）。利用MEGA 7.0軟件將GrDL7H氨基酸序列與NCBI中相似性較高的部分序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示，滇龍膽GrDL7H蛋白質(zhì)與黃金雞納樹CcDL7H的親緣關(guān)系較近（圖3）。

2.2.2 GrDL7H蛋白質(zhì)的理化特性分析 使用ExPASy ProtParam tool對(duì)GrDL7H蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，GrDL7H蛋白質(zhì)單體的相對(duì)分子質(zhì)量為59 077 u，理論等電點(diǎn)（pI值）為8.88，這與長(zhǎng)春花CrDL7H蛋白質(zhì)類似[8];帶正電氨基酸殘基（Arg+Lys）為70個(gè)，帶負(fù)電氨基酸殘基（Asp+Glu）為63個(gè)，化學(xué)方程式為C2 686H4 240N708O743S23;不穩(wěn)定指數(shù)為31.37，屬穩(wěn)定蛋白質(zhì);脂肪指數(shù)為94.81;總平均疏水性（GRAVY）為-0.173，為親水蛋白質(zhì)（圖4）。GrDL7H蛋白質(zhì)含有20種基本氨基酸，其中亮氨酸含量最高，為11.9%;其次是賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸，含量分別為7.60%、6.40%、6.40%;半胱氨酸含量最低，為1.00%。

2.2.3 GrDL7H蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析 利用PredictProtein軟件對(duì)GrDL7H蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果表明：該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（H）占54.58%，環(huán)（L）占37.43%，延伸帶（E）占7.99%。利用Phyre 2軟件預(yù)測(cè)GrDL7H蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見圖5，該模型以細(xì)胞色素p4504b1酶[c5t6qA]為模板，在第15～513位氨基酸處建模，序列相似度為24%。

2.2.4 GrDL7H蛋白質(zhì)序列的分析歸類 使用InterPro 6.0在線工具對(duì)GrDL7H蛋白質(zhì)進(jìn)行分析和歸類，結(jié)果表明，GrDL7H蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞色素P450超家族E類、類群Ⅰ（IPR002401）的成員，包含細(xì)胞色素P450保守結(jié)構(gòu)域（IPR036396）（圖6）。GO預(yù)測(cè)結(jié)果表明，在生物過程方面GrDL7H蛋白質(zhì)參與氧化還原過程，在分子功能方面，該蛋白質(zhì)參與鐵離子結(jié)合、氧化還原酶活性、血紅素結(jié)合，在細(xì)胞成分方面未預(yù)測(cè)到結(jié)果。

2.2.5 GrDL7H蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析 利用ExPASy SignalP 41服務(wù)器分析GrDL7H蛋白質(zhì)，未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，表明該蛋白質(zhì)為非分泌型蛋白質(zhì)。利用TMHMM 2.0工具預(yù)測(cè)GrDL7H蛋白質(zhì)的跨膜螺旋區(qū)，結(jié)果表明：GrDL7H蛋白質(zhì)在5～27位氨基酸含有跨膜區(qū)域，其余的1～4位氨基酸在細(xì)胞內(nèi)，28～513位氨基酸在細(xì)胞外（圖7）。

2.2.6 GrDL7H蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析 使用WoLF PSORT軟件進(jìn)行GrDL7H蛋白的亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果顯示，GrDL7H蛋白質(zhì)在葉綠體、細(xì)胞核、核骨架、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、液泡的定位系數(shù)分別為 6.0、3.5、2.5、2和1.0。

2.2.7 GrDL7H基因稀有密碼子分析 使用在線軟件對(duì)GrDL7H基因進(jìn)行稀有密碼子分析，結(jié)果表明，在大腸桿菌和釀酒酵母中，GrDL7H基因中稀有密碼子分別占1.36%、0.19%，且均無(wú)二聯(lián)或三聯(lián)稀有密碼子連續(xù)出現(xiàn)的情況，因此可選用大腸桿菌表達(dá)菌BL21、Rosetta（DE3）或釀酒酵母進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)。

2.3 GrDL7H基因啟動(dòng)子的克隆

以滇龍膽葉片DNA為模板，使用基因特異性引物分別進(jìn)行2輪PCR擴(kuò)增， 第2輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過TA克隆獲得重組質(zhì)粒pMD19-pGrDL7H，測(cè)序后，上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得登錄號(hào)（GenBank登錄號(hào)：MG832585）。對(duì)獲得的GrDL7H啟動(dòng)子進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，該啟動(dòng)子不但在-30區(qū)域附近含有轉(zhuǎn)錄起始的核心啟動(dòng)子元件TATA盒，而且含有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域通用順式作用元件CAAT盒;此外，還具有6個(gè)光應(yīng)答元件、 1個(gè)赤霉素應(yīng)答元件、6個(gè)參與茉莉酸甲酯應(yīng)答的順式調(diào)控元件、1個(gè)熱脅迫應(yīng)答元件和1個(gè)參與生物鐘控制的順式調(diào)控元件（表2）。

2.4 GrDL7H基因的組織表達(dá)分析

取二年生滇龍膽的根、莖、花和葉，通過熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)GrDL7H基因在根莖花葉等不同組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，GrDL7H基因表達(dá)量最高的組織是葉，其表達(dá)量大約分別是根、莖、花中的50、32、6倍;其次是花，表達(dá)量最低的是根（圖8）。這與川西獐牙菜SmDL7H基因在根莖葉花中的表達(dá)模式類似[7]。在長(zhǎng)春花中，CrDL7H基因主要在葉中表達(dá)，隨著葉齡的增加，其表達(dá)量逐漸降低，相應(yīng)的長(zhǎng)春堿與裂環(huán)番木鱉苷的含量逐漸減少;其次是莖和花，表達(dá)量最低的是根[8]。這些結(jié)果表明，葉是滇龍膽龍膽苦苷生物合成的主要場(chǎng)所。

3 討論

滇龍膽的主要藥效成分為龍膽苦苷，屬于環(huán)烯醚萜類物質(zhì)。該類物質(zhì)的合成主要包括3個(gè)階段，第1階段是通過甲羥戊酸（MVA）和甲基赤蘚糖-4-磷酸（MEP）途徑合成IPP（異戊烯焦磷酸）和DMAPP（二甲基丙烯基二磷酸-三銨鹽）的基本前體，第2階段是IPP和DMAPP在異戊烯基轉(zhuǎn)移酶和萜類合酶作用下形成萜類化合物和中間產(chǎn)物，第3階段是萜類化合物的碳骨架結(jié)構(gòu)在后修飾酶的催化下，分別進(jìn)行羥基化、甲基化、糖基化等，形成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、具有活性的萜類化合物[4]。為闡明龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，本研究克隆了1個(gè)萜類合成第2階段的GrDL7H基因，其表達(dá)情況可能影響龍膽苦苷的生物合成。由于許多萜類合成途徑中的底物不能通過商業(yè)化途徑獲得，導(dǎo)致學(xué)界對(duì)DL7H基因的研究較少，目前研究比較清楚的僅有長(zhǎng)春花中的CrDL7H基因。本研究從滇龍膽幼葉中克隆獲得GrDL7H基因，通過多序列比對(duì)分析，表明滇龍膽GrDL7H與其他植物DL7H蛋白質(zhì)具有較高的相似性，特別是與長(zhǎng)春花CrDL7H蛋白質(zhì)的序列相似性高達(dá)77.73%，表明二者具有相似的結(jié)構(gòu)與功能。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，滇龍膽GrDL7H與黃金雞納樹CcDL7H的親緣關(guān)系較近，且GrDL7H蛋白質(zhì)具有典型的CYP450蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，屬于E類家族成員，這些結(jié)果表明，所克隆的基因?yàn)镈L7H基因。

在長(zhǎng)春花中，CrDL7H基因在根、莖、葉、花芽和花中均有表達(dá)，但在第1對(duì)幼葉中的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他組織[8]。組織表達(dá)特異性研究結(jié)果表明，滇龍膽GrDL7H基因在葉中的表達(dá)量最高，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于根、莖和花，因此推測(cè)滇龍膽葉片為龍膽苦苷生物合成的主要器官，這與朱宏濤等的研究結(jié)果[10]一致。目前研究表明，滇龍膽全株可以入藥[11-12]，但其根中龍膽苦苷含量最高[13]。因此，根中的龍膽苦苷主要是由葉片和莖中合成的龍膽苦苷通過運(yùn)輸?shù)竭_(dá)根中進(jìn)行積累而成的。

在真核生物基因中，啟動(dòng)子由核心啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子2個(gè)部分組成，是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)及其5′端上游近端大約100～200 bp的1組具有獨(dú)立功能的DNA序列，每個(gè)元件長(zhǎng)度約為7～20 bp，是決定RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄起始和轉(zhuǎn)錄頻率的關(guān)鍵元件[14]。本研究擴(kuò)增到的滇龍膽GrDL7H基因啟動(dòng)子片段大小為818 bp，不但具有核心啟動(dòng)子TATA盒上游啟動(dòng)子CAAT盒，而且具有6個(gè)光應(yīng)答的元件、1個(gè)參與赤霉素應(yīng)答元件、6個(gè)參與茉莉酸甲酯應(yīng)答的順式調(diào)控元件、1個(gè)熱脅迫應(yīng)答元件、1個(gè)參與生物鐘控制的順式調(diào)控元件，表明GrDL7H基因的表達(dá)受光、赤霉素、茉莉酸甲酯、熱脅迫、生物鐘等多種因素的調(diào)控，這同時(shí)也表明，可通過調(diào)控基因表達(dá)來提高龍膽苦苷的含量。

本研究為滇龍膽GrDL7H基因功能的解析奠定了基礎(chǔ)。今后將對(duì)GrDL7H基因進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)、純化和酶活分析、基因調(diào)控機(jī)制分析來研究其功能，從而為龍膽苦苷生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制的闡明奠定基礎(chǔ)。

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